一种基于化学发光的结晶紫检测方法
【专利摘要】本发明公开一种基于化学发光的结晶紫检测方法，是由碳酸钠溶液、碳酸氢钠溶液或碳酸钠与碳酸氢钠的混合溶液与鲁米诺配制浓度为1.0×10?6mol·L?1～1.0×10?4mol·L?1的鲁米诺工作液，另配制浓度为10μg·mL?1～1.0×104μg·mL?1的过氧化氢水溶液，分别检测空白水样及待测水样与过氧化氢水溶液及鲁米诺工作液在避光条件下反应的发光强度，记为I0和I，计算得到相对发光强度ΔI＝I0?I，对照标准曲线计算得到待测水样中结晶紫的浓度。本发明通过建立结晶紫?鲁米诺(3?氨基邻苯二甲酰肼)?过氧化氢的特殊发光体系检测水体中结晶紫的含量，检测灵敏及准确度高，并可实现自动进样、多个样品同时检测，操作简便、成本低。
【专利说明】
一种基于化学发光的结晶紫检测方法
技术领域
[0001] 本发明属于化学分析检测技术领域，涉及一种基于化学发光的结晶紫检测方法。 技术背景
[0002] 结晶紫，分子式为C25H3QClN3,其结构如附图1所示，属三芳基甲烷化学物质，被广泛 地用于纺织业、皮革业、制陶业和细胞染色等。同时，由于它能抑制寄生虫，杀死真菌和细 菌，许多国家在较长一段时间里曾将其作为水产养殖业的常用杀菌剂，用于鱼类高发的水 霉病、原虫病的控制，提高鱼类存活率。但结晶紫对鱼类的生殖系统和免疫系统具有高毒 性、高残留、致癌、致畸、致突变等的毒副作用，大部分国家和地区将结晶紫列为水产兽医行 业的禁用药，但由于结晶紫价格低、易制备、使用方便和药效显著等特点，我国许多地方在 水产品养殖、保鲜和运输过程中仍在使用，引起的水产品体内的残留和环境污染，因此，需 要建立水体中结晶紫的快速检测方法，对结晶紫的使用进行监测监管。
[0003] 目前结晶紫的检测手段有高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱法
[0004] (HPLC-MS)、液相色谱一串联质谱法(HPLC-MS-MS)、同位素内标法、酶联免疫分析 法等，但这些方法有操作繁琐、耗时长、仪器价格昂贵、需要专业的技术人员、不适合现场大 规模的检测等缺点，而化学发光法具有灵敏度高、检测速度快、线性范围广等优点，在环境 监测、化学分析等领域应用广泛，但目前对于结晶紫还没有出现高效的基于化学发光的检 测方法。
【发明内容】
[0005] 针对上述现有技术的不足，本发明提供一种基于化学发光的结晶紫检测方法，该 方法通过建立结晶紫-鲁米诺(3-氨基邻苯二甲酰肼)_过氧化氢的特殊发光体系，检测水体 中结晶紫的含量，具有分析速度快、灵敏度高、试剂消耗少等优点。
[0006] 本发明的目的通过以下技术方案实现：
[0007] -种基于化学发光的结晶紫检测方法，包括以下步骤：
[0008] 由碳酸钠溶液、碳酸氢钠溶液或碳酸钠与碳酸氢钠的混合溶液与鲁米诺配制浓度 为1.0 X 10-6mol · L-1~1.0 X 10-4mol · L-1的鲁米诺工作液，另配制浓度为IOyg · mL-1~1.0 X 104yg · ml/1的过氧化氢水溶液，分别检测空白水样及待测水样与过氧化氢水溶液及鲁米 诺工作液在避光条件下反应的发光强度，记为Io和I，计算得到相对发光强度AI = Iq-I,对 照标准曲线计算得到待测水样中结晶紫的浓度。
[0009] 优选的，所述碳酸钠溶液、碳酸氢钠溶液或碳酸钠与碳酸氢钠的混合溶液的浓度 为0.05mol · L-1 ~0.20mol · L-SpH值为9.5~13.0。
[0010] 所述待测水样为水产养殖水或环境水样，不含有结晶紫以外的其他影响结晶紫与 鲁米诺、过氧化氢反应发光强度的物质，所述空白水样为不含有结晶紫及其他影响结晶紫 与鲁米诺、过氧化氢反应发光强度的水样，优选的，待测水样中结晶紫的浓度为2~SOOng · ml/1，保证结晶紫浓度与相对发光强度之间的正比关系。
[0011] 优选的，所述待测水样经过预处理后再与过氧化氢水溶液及鲁米诺工作液混合， 所述预处理是将待测水样经过滤后，用活化的强酸型阳离子交换树脂和强碱性阴离子交换 树脂进行处理，再加入乙二胺四乙酸二钠作为掩蔽剂消除金属离子的干扰，得到预处理后 的待测水样。
[0012] 本发明利用结晶紫对鲁米诺-过氧化氢在碱性条件下发光强度的影响来检测结晶 紫的含量，实际中随结晶紫含量增加，结晶紫-鲁米诺-过氧化氢在碱性条件下反应的化学 发光强度I降低，则鲁米诺-过氧化氢在碱性条件下反应的化学发光强度Io与结晶紫-鲁米 诺-过氧化氢在碱性条件下发生反应的化学发光强度I的差值（即相对发光强度A I = Iq-I ) 随结晶紫的含量增加而增加。在该检测方法中，所述过氧化氢水溶液与鲁米诺工作液反应 的化学发光强度Io随过氧化氢水溶液用量的增加而增加，即该空白反应体系中鲁米诺是过 量的，而含结晶紫的待测水样与鲁米诺工作液及过氧化氢水溶液反应的化学发光强度I随 待测水样用量增加而减小，据此调节各种物质的用量。
[0013] 优选的，所述反应的时间为IOs~30s。所述反应是在避光条件下进行，反应过程的 化学发光强度是逐渐增强后衰减的过程，因而需要根据实际情况选择检测时间。
[0014] 本发明的基于化学发光的结晶紫检测方法优选在带有多个样品检测槽、自动进样 装置及化学发光检测装置的现有设备中进行，在检测槽中分别加入结晶紫标准溶液、待测 水样及空白样，由自动进样装置同时将鲁米诺工作液及过氧化氢水溶液注入样品槽中进行 化学发光，由化学发光检测装置检测相对发光强度，计算后得到待测水样中结晶紫的浓度， 可实现单个待测样品的平行检测、多个样品同时检测以及标准溶液的同步检测，进样准确 度高，检测速度快。所述现有设备可以为带有自动进样器、化学发光检测单元的酶标仪或其 他化学发光检测仪，另配套使用自动读板装置(如微孔板）。
[0015] 本发明具有以下有益效果：
[0016] 本发明通过建立结晶紫-鲁米诺(3-氨基邻苯二甲酰肼)_过氧化氢的特殊化学发 光体系检测水体中结晶紫的含量，具有检测灵敏及准确度高的优点，并可结合现有的自动 进样、化学发光检测等装置，实现多个样品同时检测，操作简便、成本低，适用于实时监测及 环境预警监测。
【附图说明】
[0017] 图1结晶紫的化学结构图；
[0018] 图2标准曲线。
【具体实施方式】
[0019] 本发明可通过如下的实施例进一步的说明，但实施例不是对本发明保护范围的限 制。
[0020] 实施例
[0021]待测水样的制备：取水样IOOmL，用0.45μπι微孔滤膜过滤，所得滤液经过活化后的 强酸型阳离子交换树脂(732,上海凌峰化学试剂有限公司）和强碱性阴离子交换树脂(717， 上海凌峰化学试剂有限公司）处理，再加入IyL IX l(T7m〇l · I/1的乙二胺四乙酸二钠作为 掩蔽剂消除金属离子的干扰，得到预处理后的待测水样;在100mL预处理后的待测水样中加 入IyL Img · ml/1的结晶紫标准溶液充分混合均勾，得到浓度为10.OOng · ml/1的模拟待测 水样。
[0022] 标准曲线的绘制与待测水样的检测：
[0023] 使用滤光片型多功能酶标仪Infinite? 200 (TECAN，瑞士），配套使用白色96孔聚苯 乙烯平底微孔板（3922，Corning，美国），将空白水样、待测水样和浓度为800ng · mL一1、 500ng · mL-\300ng · mL-\200ng · mL-\l50ng · mL-\100 ng · mL-\50ng · mL-\25ng · ml,-1、 IOng · mL-1Jng · mL-1Jng · mL-1Jng · mL-1的结晶紫标准溶液按照50yL/孔的体积用量分 别加入到微孔板的微孔中，空白水样、待测水样及每个浓度的结晶紫标准溶液均设置3个平 行孔；
[0024] 用？!1=11.5、浓度为0.2111〇1.1/1的恥20)3溶液配置浓度为2\10- 5111〇1.1/1的鲁米 诺工作液，用超纯水配置浓度为1.11 X 103yg · ml/1过氧化氢水溶液，将鲁米诺工作液与过 氧化氢水溶液分别连接酶标仪的自动进样器，设定自动进样体积均为50yL、震荡时间为 20s，开启自动进样进行测试，得到空白水样发生反应后的化学发光强度分别与待测水样、 标准溶液的化学发光强度的差值（即相对发光强度AI = I〇-I)，由结晶紫标准溶液的相对 发光强度与结晶紫标准溶液的浓度作图得到标准曲线，见图2,标准曲线为:y = 78444Ln(x) + 124295(R2 = 0.9939)，由待测水样反应后的相对化学发光强度计算待测水样的结晶紫浓 度为10.43ng · mL-、
[0025]考察检测方法的回收率:取5yL初始浓度为Img · ml/1的结晶紫溶液，用预处理后的 待测水样稀释成10mL，此时浓度为50ng · mL-S再倍比稀释成25ng · mL-1UOng · mL-1Jng · mL'得到4个添加后的待测水样，并设空白样，按照50μ!7孔的体积用量分别加入到微孔板 的微孔中，每个添加后的待测水样及空白样均设11个平行孔，开启自动进样进行测试，得到 空白样发生反应后与添加后的待测水样的化学发光强度的差值（即相对发光强度A I = I0-I)，计算得到该检测方法的回收率为89.4~112.5%，RSD〈10.4%。
[0026]最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护 范围的限制。本领域的技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行若干推演或者等 同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
【主权项】
1. 一种基于化学发光的结晶紫检测方法，包括以下步骤： 由碳酸钠溶液、碳酸氢钠溶液或碳酸钠与碳酸氢钠的混合溶液与鲁米诺配制浓度为 1.0X10-6mol · L-1~1.0X10-4mol · L-1的鲁米诺工作液，另配制浓度为IOyg · mL-1~1.0X 104yg · ml/1的过氧化氢水溶液，分别检测空白水样及待测水样与过氧化氢水溶液及鲁米诺 工作液在避光条件下反应的发光强度，记为Io和I，计算得到相对发光强度AI = I〇-I，对照 标准曲线计算得到待测水样中结晶紫的浓度。2. 如权利要求1所述的基于化学发光的结晶紫检测方法，其特征在于，所述碳酸钠溶 液、碳酸氢钠溶液或碳酸钠与碳酸氢钠的混合溶液的浓度为〇.〇5mol · IZ1~0.20mol · L一S pH 值为9.5~13.0〇3. 如权利要求1所述的基于化学发光的结晶紫检测方法，其特征在于，所述待测水样中 结晶紫的浓度为2~800ng · mL一、4. 如权利要求1所述的基于化学发光的结晶紫检测方法，其特征在于，所述反应的时间 为IOs~30s。5. 如权利要求1-4任一项所述的基于化学发光的结晶紫检测方法，其特征在于，所述基 于化学发光的结晶紫检测在带有多个样品检测槽、自动进样装置及化学发光检测装置的设 备中进行。
【文档编号】G01N21/76GK105891190SQ201610207824
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年4月4日
【发明人】赵肃清, 杨灵珊, 焦洛莹, 秦静, 夏娜娜, 沈定
【申请人】广东工业大学