一种生物发酵饲料的代谢组学分析方法
【专利摘要】本发明公开了一种生物发酵饲料的代谢组学分析方法。该方法不仅提高了代谢物的提取率，提高了核磁谱图的质量，而且简化了提取流程，实现了生物发酵饲料的代谢组学分析，对生物发酵饲料和原料进行了很好的区分。
【专利说明】
一种生物发酵饲料的代谢组学分析方法
技术领域
[0001] 本发明属于代谢组学技术领域。具体涉及一种生物发酵饲料的代谢组学分析方 法。
【背景技术】
[0002] 生物发酵饲料是目前研究和开发的热点，在保障饲料资源和畜产品安全，促进减 排、降低环境污染等诸多方面都显示了极大的前景，发展生物发酵饲料具有重大战略意义。 国外生物发酵饲料已经广泛应用，总体研究水平也高于国内，尤其在饲用生物活性添加剂 的生理生化方面已经深入开展了大量研究。而我国生物饲料的研究除少数传统发酵产品 外，普遍存在生产技术水平不够完善、品种少、应用技术不配套等问题。然而，目前我国生物 饲料无论是研究还是实际应用都呈现出快速、高效的态势。现代生物技术的大量应用，在酶 制剂的发酵菌种基因改良提升、发酵工艺和水平等方面已经赶上甚至部分领域超过发达国 家的相应水平。但是，由于生物发酵饲料成分的复杂性和不稳定，对生物发酵饲料组分的研 究和效果评估目前仍然缺乏行之有效的方法。
[0003] 随着代谢组学研究的不断深入和研究领域的不断拓展，生物发酵代谢组学研究也 成为了目前代谢组学的热点应用领域之一。代谢组学的研究方法，不仅可以对生物发酵过 程中培养基碳源和氮源等成分进行表征，也能对发酵微生物细胞内代谢物进行表征，还能 对微生物发酵途径中底物-终产物反应过程进行实时监控。
[0004] 目前关于生物发酵代谢组学的研究刚刚起步，尚有诸多方法学问题有待解决。一 方面，生物发酵的培养基和代谢终产物十分复杂，包含氨基酸、糖类、生物胺类、有机酸类等 代谢物，需要采用相应的提取方法，尽量对所有的代谢物进行提取。另一方面，由于在代谢 物检测过程中离子浓度过高会导致核磁共振和质谱检测结果分辨率下降，特别是PH值随着 发酵过程出现明显的变化，也会在核磁共振检测过程中导致谱峰的漂移，影响数据的质量 而导致数据误差变大。所以，对于基于匪R的代谢组学研究中，发展针对于生物发酵饲料成 分研究的提取方法是十分必要的。
[0005] 在生物发酵成分分析研究中，最为普遍的方法是氨基酸、短链脂肪酸等一类相近 物质的检测方法。由于进行氨基酸检测时，需要高温（ll〇°C)和强酸条件下消解 2,虽然可以 实现对氨基酸的检测，但是高温使得容易挥发的短链脂肪酸、乳酸、醇类等功能性物质会丢 失掉。乳酸作为乳酸菌发酵饲料的主要指标，需要采用单独的分析方法进行测。
[0006] 由于生物发酵饲料是采用微生物或者酶进行处理或消化，减少了抗营养因子，并 对营养物质进行了预消化，得到更加适合与动物食用和消化的产品。而且不同微生物在不 同的底物和生长环境下代谢物的差异较大，标准的提取方法很难建立，需要针对实际研究 采用不同的提取方法。而生物发酵饲料对于动物营养和健康而言，水溶性的代谢物具有更 加重要的意义。那么在生物发酵饲料的代谢组学研究中，如何尽量多的提取到生物发酵饲 料中的水溶性代谢物，特别是实现对生物发酵所想得到的目标物的分析，以及在胃肠道能 够消化吸收的代谢物的全组分检测，具有现实意义。
[0007] 因此，由于在发酵饲料代谢组学分析中需要保持代谢物的原貌而且力图检测到尽 量多的水溶性代谢物，实现高通量快速筛选，这就需要对目前的提取方法进行筛选和优化， 避免过于剧烈（高温、强酸、强碱等）、操作过于繁琐和提取效率较低的提取方法，进而找到 适合于生物发酵饲料代谢组学分析的提取方法。
[0008] 现有技术包括氨基酸提取工艺、乳酸提取工艺、酸性甲醇-乙腈提取工艺等，提取 操作程序复杂，耗时较长，由于使用大量有毒试剂和有机溶剂，成本高，环境污染较大，也无 法实现生物发酵饲料所有组分的同时检测。为了在既保证发酵饲料代谢物提取率的前提 下，又最大程度的简化提取工艺，降低提取成本。本发明采用磷酸盐缓冲液提取新方替代盐 酸消解和有机溶剂提取法，同时简化提取流程，尽量减少操作对实验结果的影响，保持生物 发酵饲料中水溶性代谢物组成的原貌。并通过维持PH值的稳定，以保证核磁谱峰漂移最小， 最终达到既保证水溶性代谢物的提取效率最高，又能够很好保证数据的质量，为生物发酵 饲料发酵过程的研究提供一种新的代谢组学分析方案。
[0009] 现有贺克勇等采用的对苹果渣发酵饲料中氨基酸提取方法。具体方法如下：称取 新发酵样品〇.5g置于安培瓶中，加入6mol/L盐酸IOml后混勾，密封。110°C消化22h，采用去 离子水定容至IOmU吸取ImL于5mL容量瓶内，40-50°C真空干燥，残留物用ImL水溶解，再干 燥，反复进行两次，最后蒸干，用PH值2.2的缓冲液ImL溶解，经0.25_微孔滤膜过滤，采用氨 基酸分析仪测定 17 种氨基酸（Cys、Phe、Thr、Ser、Glu、Pro、Gly、Ala、Val、Met、Leu、Ile、Tyr、 Asp、His、LyS和Arg)的含量，然后乘以稀释倍数换算成饲料样品中氨基酸的含量。但是，采 用浓盐酸高温消解发酵样品中蛋白质和氨基酸，破坏了有机酸和脂肪酸等其他的对热和酸 不稳定的化合物，并且具有耗时，环境污染大等缺点。
[0010] 现有罗建等采用的羟基联苯比色法测定饲料样品中的乳酸。标准曲线的配制如 下:分别配制乳酸标准液1、2、3、4、5和6yg/mL，在比色管中分别加入乳酸标准液ImL、4.0 % 硫酸铜溶液〇. 〇5mL，再加入浓硫酸6mL，反应5min，冷却至20 °C以下后，再分别于各比色管中 加入1 %碱溶性羟基联苯溶液0.05mL，混合均匀，在室温下放置6-8h，过夜，在570nm下进行 比色测定，绘制出标准曲线。提取方法如下：称取Ig发酵饲料溶解于IOOmL蒸馏水中， 4000rpm离心10min，取上清液ImL，按标准曲线测定样品中乳酸含量（％ )。但是，采用的羟基 联苯比色法测定饲料样品中的乳酸，提取方法操作简单易行，缺点是只能实现乳酸的检测。
[0011] 现有聂存喜等对固体发酵代谢物提取方法的进行比较认为酸性甲醇-乙腈法提取 的效率最高。具体方法如下:将Ig样品在液氮条件下研钵磨碎，溶于IOmL 50%酸性甲醇-乙 腈溶液(_20°C )，在冰上放置30min;-20°C，10000r/min，离心5min，取上清溶于10倍体积的 冷水(4°C )中，用0.2μπι针筒式滤器过滤后，可进入质谱进行分析。但是，热的乙腈法提取法， 由于在70°C沸腾5min，会导致容易挥发性的小分子物质丢失，提取效率偏低，甚至会导致氨 基酸和糖等发生化学反应。50%甲醇法(_20°C)提取的效率也没有酸性甲醇-乙腈法(-20 °C)的高。但是，总的来说，由于提取过程的温度和提取试剂的极性，造成了检测的效率差异 较大。而且，甲醇和乙腈等试剂具有毒性大、操作较为繁琐，耗时较长，环境污染大等缺点。 虽然可以同时测定棕榈酸、硬脂酸、油酸和亚油酸的浓度，但不能同时检测甲酸、乙酸、丙酸 和丁酸等短链脂肪酸，也不能同时检测氨基酸以及其他的化合物。
[0012]
【申请人】之前采用代谢组学对肠道内容物进行了分析。但是，生物发酵饲料是利用 微生物发酵工程开发的新型饲料资源和饲料添加剂。主要以酒槽、饼柏、麸皮等农产品深加 工副产品或非常规饲料原料为原料进行生物发酵后得到适于动物摄食和消化的原料，由于 生物发酵的作用主要分解抗营养因子并转化为适合动物采食、消化和吸收的养分，还有产 生大量益于肠道健康的氨基酸和短链脂肪酸类物质，常使用乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢等 产酶和产酸菌作为发酵菌株。生物发酵饲料具有原料相对单一，短链脂肪酸等单一代谢物 含量较高等特点，导致酸碱环境等化学性质较胃肠道内容物更为极端。而且，生物发酵饲料 由于某些营养物质已经被微生物利用而产生了新的代谢物，这些小分子物质浓度会较低。 而胃肠道内容是经过胃酸和消化酶消化后的混合物，具有小分子代谢物种类多浓度高的特 点。生物发酵饲料和胃肠道内容物在酸碱体系和小分子物质的种类与浓度上具有明显的差 异。故而，针对性对生物发酵饲料的代谢组学分析方法需要进行进一步的研究，以建立一种 生物发酵饲料的代谢组学分析方法。
【发明内容】
[0013]本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种生物发酵饲料的代谢组学分析方法。 [0014]为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
[0015] 所述生物发酵饲料的代谢组学分析方法包括如下步骤：
[0016] (1)取生物发酵饲料加入浓度为0.1-0.7M的磷酸盐缓冲液中，生物发酵饲料与磷 酸盐缓冲液的质量体积比为1: 20至1: 2，质量体积比的单位为g/mL，经液氮速冻后，于水浴 锅中超声解冻，然后置于组织破碎仪中破碎;将破碎后的猪胃肠道内容物再重复液氮速冻、 超声解冻、破碎仪破碎处理1 一4次；
[0017] (2)将经步骤（1)处理后的生物发酵饲料于4°C、12000rpm离心，取上清液进行核磁 共振检测。
[0018] 优选地，所述磷酸盐缓冲液浓度为0.2-0.3M。
[0019] 优选地，所述生物发酵饲料与磷酸盐缓冲液的质量体积比为1:10。
[0020] 优选地，用水配制步骤（2)所述的磷酸盐缓冲液，所用的水中重水含量为10 - 100%，优选为100%，所用TSP内标浓度为0.002-0.05%，优选为0.002%，配制后的磷酸盐 缓冲液的pH值为5.0-9.0，优选为7.4。
[0021] 本发明的方法不仅对水溶性代谢物进行较好的提取，保证了生物发酵饲料代谢物 组成的原貌，也将核磁谱峰漂移减小到最低程度，提高了核磁谱图的质量，同时简化了提取 工艺流程。通过对提取工艺流程的优化，方法如下：取约20g解冻或新鲜的生物发酵饲料样 品，充分粉碎后(全部过20目筛），然后称取0.1 g生物发酵饲料样品，加入0.2M磷酸盐缓冲液 (pH值7.4，0.002 % TSP，100 %重水）1.0 mL，液氮速冻后，水浴锅中超声（22KHz，5min)并解冻 后，置于组织破碎仪中（20Hz，30s)，如此反复冻融、超声和破碎处理3个循环。最后，4°C，12 OOOrpm离心10min，取上清液0.8mL加入5mm核磁管备用。可检测代谢物45种，其中氨基酸20 种，氮代谢物2种，短链脂肪酸5种，三羧酸循环代谢物5种，生物胺5种，糖类2种，核苷酸3种， 脂质代谢物3种。整个提取过程仅需3h。谱峰漂移受pH值影响很小。因此，该提取方法不仅提 高了代谢物的提取率，提高了核磁谱图的质量，而且简化了提取流程，实现了生物发酵饲料 的全谱检测。
[0022] 采用本发明方法对高粱基酒糟的组成进行了全谱分析，很好地进行了代谢组学区 分，建立了相应的代谢指纹图谱。因此，该方法不仅提高了代谢物的提取率，提高了核磁谱 图的质量，而且简化了提取流程，实现了生物发酵饲料的代谢组学分析，对生物发酵饲料和 原料进行了很好的区分。
【附图说明】
[0023] 图1为代表性代谢物化学位移变化幅度随pH值变化图，中性条件下(pH值7.0-8.0) 化学位移变化幅度相对较小，而酸性和碱性条件下化学位移变化幅度相对较大；
[0024] 图2为提取溶液中pH值变化随离子强度的变化图；
[0025] 图3为核磁谱信噪比随着提取溶液中离子强度变化图；
[0026] 图4为提取磷酸盐缓冲液中重水含量为10%、50%和100%的压水峰核磁谱图；
[0027] 图5为提取缓冲液中TSP浓度为0.002%、0.01 %和0.05%的谱峰图；
[0028]图6为生物发酵饲料一维NMR标准图谱;指认代谢物45种，其中氨基酸20种，氮代谢 物2种，短链脂肪酸5种，三羧酸循环代谢物5种，生物胺5种，糖类2种，核苷酸3种，脂质代谢 物3种；
[0029] 图7为发酵前原酒糟（)和发酵后酒糟(·)的得分图。
【具体实施方式】
[0030] 实施例1
[0031] 1.实验方法
[0032] 1.1样品
[0033] 枯草芽孢杆菌发酵后的高粱基酒槽
[0034] 1.2实验设备
[0035] 分析天平（Sartorius BS110S)，德国Sartorius公司；微量加样器，美国Thermo公 司；酸度计(HANNA pH 211型），意大利HANNA公司；漩涡振荡器(SI-Vortex-Genie 2型），美 国Scientific Industries公司；低温冷冻大容量离心机(Anke DL-4000B型），上海安亭科 学仪器厂;超低温冰箱，青岛海尔公司;Bruker Avance DRX-600高分辨核磁共振谱仪，德国 Bruker Biospin公司。
[0036] 1.3本发明样品提取方法如下：
[0037]取约20g解冻或新鲜的生物发酵饲料样品，充分粉碎后(全部过20目筛），然后称取 0.1 g生物发酵饲料样品，加入0.2M磷酸盐缓冲液(pH值7.4，0.002%TSP，100%重水）1.0 mL， 液氮速冻后，水浴锅中超声(22KHz，5min)并解冻后，置于组织破碎仪中（20Hz，30s)，如此反 复冻融、超声和破碎处理3个循环。最后，4°C，12 OOOrpm离心10min，取上清液0.8mL加入5mm 核磁管备用。
[0038] 1.4本发明核磁共振检测方法如下：
[0039]在Bruker Avanc e DRX-600 高分辨核磁共振谱仪（Bruker B i 〇 sp i η， Rheinstetten,Germany)上进行NMR检测，1H频率为600 . IlMHz，配备三共振高分辨探头。采 样温度为298K，采样次数为128次，谱宽20ppm。每个样品采样前控温至少5分钟，每个样品的 90°脉冲宽度调整为IOys左右，等待时间(Recycle delay，RD)为2s(期间进行预饱和压水）。 每个样品分别进行预饱和压水峰的N0ESYPR1D (RD-90° -"-90° -tm-90° -ACQ)实验，其中脉冲 延迟时间tSSys，混合时间U为IOOms，在U和弛豫延迟期间进行预饱和压水。
[0040] 米用Amix(V3·9· 15,Bruker Biospin,Germany)软件对饲料提取液的 1H NOESY谱 进行自动积分。为了消除残余水峰对分析造成的影响，将水峰所在的M.70-5. IOppm区间的 积分值去掉。将匪R谱的如.5-4.70和δ5.10-9. Oppm区间的积分值进行归一化处理(每个区 间的积分值与总积分值的比值），积分间隔〇.〇〇2ppm。随后将归一化的数据导入SMCA-P + 11 · 0软件包(Umetr ics，Sweden)进行多变量分析。
[0041] 1.5 pH值对饲料中主要代谢物化学位移的影响评价
[0042]采用TopSpin 3.2软件观察并记录提取液中的主要代谢物，如，氨基酸类(丙氨酸、 组氨酸等）、有机酸（乙酸、柠檬酸和乳酸等)和生物胺类(组胺等）的化学位移，研究它们随 着pH变化时的变化幅度。代表性代谢物化学位移变化幅度随pH值的变化见图1所示，氨基酸 属于两性化合物，在酸性和碱性条件下的化学位移变化幅度均较大，而在中性条件下比较 稳定。生物胺类在酸性条件下，化学位移变化幅度较小，而在中性条件下变化较大。有机酸 在酸性条件下化学位移变化幅度较大，而在碱性条件下比较稳定。由于代谢物中主要以氨 基酸和有机酸为主，特别是乳酸、乙酸、甲酸、丙酸和丁酸等。为了保持氨基酸等物质的化学 位移稳定，并兼顾有机酸的化学位移稳定，在提取体系的PH值选择上，应该为中性偏碱性。
[0043] 因此，本方法中所述的磷酸盐缓冲液pH值条件为5.0-9.0，更优选7.4。
[0044] 1.6不同提取操作和条件之间的提取效率比较
[0045] 1.6.1提取溶液与样品比例的优化
[0046] 由于提取溶液与样品的比例越大，提取代谢物的效率会越高，但是会对代谢物进 行稀释，而降低代谢物的浓度，甚至可能会导致某些代谢物的浓度低于检测限，或者增加后 期核磁检测的采样次数和时间。在采样次数为128次的前提下，通过比较提取溶液与样品比 例分别为20:1、10:1、5:1和2:1之间的信噪比。结果表明，提取溶液与饲料样品比例最优为 10：1〇
[0047] 1.6.2提取缓冲溶液离子强度的优化
[0048] 采用 0.謂、0.21、0.31、0.4]?、0.51、0.61和0.7]\1的磷酸盐缓冲液化!1值7.4)与0.18 样品按照10:1混合，充分摇匀，测定溶液中的pH值。从图2中可知0.2M磷酸盐缓冲液能迅速 将提取体系的pH值调整到7.4左右。
[0049] 从图3中可知随着提取体系中的离子强度的增加，核磁谱信噪比呈现下降趋势，而 且离子强度大于0.3M后，信噪比急剧下降。可见提取体系中离子强度在0.3M以内的信噪比 比较合适。
[0050] 因此，本方法中所述的磷酸盐缓冲液离子强度为0.1-0.7M，更优选0.2 M。
[0051 ] 1.6.3破碎处理方式的优化
[0052]在0.2M磷酸缓冲液(pH值7.4)的基础上，进一步优化破碎处理方式。去除谱图中的 4.70-5 · IOppm水峰后，以0.002ppm的积分区间采用Amix(Bruker ,Germany)软件对压水的 NOESY IH谱的将NMR谱的δ〇. 5-4.70和δ5.10-9 . Oppm区间的积分值以进行自动积分(绝对 值），并以TSP的积分值(0 · 018ppm至-0 · 018ppm)为1进行归一化，以不同提取方法的归一化 积分值之和评价提取效率。冻融、超声和破碎循环次数不同的产量如表1所示，随着循环次 数从高至低依次为:循环4次〉循环3次〉循环2次〉循环1次，说明随着循环次数的增加，提取 效率会增加，循环次数从1次增加到3次，提取效率有显著提高(P〈0.05)，而循环次数从3次 增加到4次，没有明显差异(P>0.05)。说明循环3次可以达到最优化循环次数。
[0053] 因此，所述的破碎处理方式为冻融、超声和破碎1-4个循环，更优选3个循环。
[0054] 耒1冻融、轺亩和破碎循环汝教不同少_的产量比转
[0056] 注:a b e，代表不同提取次数之间的积分值的差异显著性(P〈0.05)
[0057] 1.6.4重水含量的优化
[0058] 提取磷酸盐缓冲溶液中重水的含量直接与核磁检测过程中的压水难易程度相关， 水峰面积小时，核磁谱图的质量较高。如图4所示，重水含量为10%时压水峰面积较大，重水 含量为50 %时压水峰面积较小，100 %时面积最小。
[0059] 因此，所述的提取缓冲溶液中重水的含量为10%-100%，最优选为100%。
[0060] 1.6.5 TSP内标含量的优化
[0061] TSP作为核磁检测过程中的内标物质，其浓度应该与提取液所含物质的浓度相匹 配。如图5所示，采样次数为128次，从TSP浓度0.002、0.01到0.05%，峰面积成比例增加 。TSP 浓度为0.05%时，其谱峰远远高于样品中的其他物质峰强度。因此，综合以上实验数据，更 优选的TSP内标浓度应为0.002%。
[0062] 1.7在上述最优化提取方法下得到的生物发酵饲料核磁谱图结果
[0063] 生物发酵饲料一维NMR标准图谱见图6所示，从生物发酵饲料核磁谱图中指认代谢 物45种，其中氨基酸20种，氮代谢物2种，短链脂肪酸5种，三羧酸循环代谢物5种，生物胺5 种，糖类2种，核苷酸3种，脂质代谢物3种。由此，建立了生物发酵饲料的代谢指纹图谱。
[0064] 1.8在上述最优化提取方法下的生物发酵饲料代谢组学分析
[0065] 采用以上方法提取方法对生物发酵饲料和原料进行提取后，测得的代谢物数据进 行代谢组学分析，得分图见图7所示，可以很好地对原料和发酵后的生物饲料区分，在PCl维 上出现明显的两个聚类，说明该提取方法能够提取到生物发酵过程中产生的有意义的代谢 物，通过代谢组学分析能够很好的对这些代谢物变化进行分析。
【主权项】
1. 一种生物发酵饲料的代谢组学分析方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤： (1) 取生物发酵饲料加入浓度为0.1 -0.7M的磷酸盐缓冲液中，生物发酵饲料与磷酸盐 缓冲液的质量体积比为1:20至1:2,质量体积比的单位为g/mL，经液氮速冻后，于水浴锅中 超声解冻，然后置于组织破碎仪中破碎;将破碎后的猪胃肠道内容物再重复液氮速冻、超声 解冻、破碎仪破碎处理1 一4次； (2) 将经步骤（1)处理后的生物发酵饲料于4°C、12000rpm离心，取上清液进行核磁共振 检测。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液浓度为0.2-0.3M。3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物发酵饲料与磷酸盐缓冲液的质量体 积比为1:10。4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，用水配制步骤(2)所述的磷酸盐缓冲液，所用 的水中重水含量为10-100%，所用TSP内标浓度为0.002-0.05%，配制后的磷酸盐缓冲液 的 pH 值为 5.0-9.0。5. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，用水配制步骤(2)所述的磷酸盐缓冲液，所用 的水中重水含量为100 %，所用TSP内标浓度为0.002 %，配制后的磷酸盐缓冲液的pH值为 7.4。
【文档编号】G01N24/08GK105891251SQ201610217453
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年4月8日
【发明人】何庆华, 任萍萍, 李铁军, 孔祥峰, 印遇龙, 伍力, 崔志杰, 李凤娜, 刘莹莹
【申请人】中国科学院亚热带农业生态研究所