抗癌剂感受性判定标记的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种能够判别各个患者的治疗反应性的抗癌剂感受性判定标记和利用其的新的癌症治疗方法。选自在质量分析仪中本体或其片段是作为m/z＝149.05～149.06的阴离子被检测出的分子、作为m/z＝152.99～153.00的阴离子被检测出的分子、作为m/z＝724.34～724.35的阳离子被检测出的分子、谷胱甘肽、亚牛磺酸、1?甲基烟酰胺、牛磺酸、谷胱甘肽二硫化物、S?腺苷高半胱氨酸、烟酰胺、γ?谷氨酰半胱氨酸和精胺中的一种以上的分子作为抗癌剂感受性判定标记，在用于判定大肠癌的抗癌剂感受性的试剂盒的制造中的用途，其中，上述抗癌剂是伊立替康、SN?38和/或它们的盐。
【专利说明】抗癌剂感受性判定标记
[0001 ] 本案是申请日为2010年10月29日、申请号为201080049509.5 (PCT/JP2010/069364)、发明名称为抗癌剂感受性判定标记的专利申请的分案申请。
技术领域
[0002]本发明涉及用于判定作为对象的患者的癌对于欲使用的抗癌剂是否具有治疗反应性的抗癌剂感受性判定标记及其应用。
【背景技术】
[0003]抗癌剂，有烷基化剂、铂制剂、代谢拮抗剂、抗癌性抗生素、抗癌性植物生物碱等种类。这些抗癌剂中，根据癌的种类不同，有时显示效果，有时不显示效果。但是，已知即使是认为有效的种类的癌，也因各个患者而异有时显示效果，有时不显示效果。这种抗癌剂对于各个患者的癌是否显示效果称为抗癌剂感受性。
[0004]盐酸伊立替康(CPT-1l)是日本开发的具有I型拓扑异构酶(Topoisomerase I)抑制作用机理的抗癌剂。在日本，CPT-1I作为对非小细胞肺癌、小细胞肺癌、宫颈癌、卵巢癌的有效药剂而在1994年I月得到认可，并在1995年7月认可其适用于胃癌、结肠-直肠癌、乳腺癌、鳞状细胞癌、恶性淋巴瘤。CPT-1l特别是在大肠癌领域作为多剂并用疗法的一线药物(First line drug)或者二线药物(second line drug)占据了世界标准治疗用药的位置，其有用性得到认可(非专利文献I?6)。
[0005]对晚期-转移大肠癌的化学疗法，通过并用二十世纪90年代登场的CPT-11、奥沙利铀等关键药物(key drug)和当时作为大肠癌治疗的中心药剂的氟尿啼啶(5-FU)为中心的氟化嘧啶制剂，能够戏剧般的改善以生存率为基础的临床成绩，但是现状是奏效率大约只有50%左右，冒着很重的副作用这样的高风险投与抗癌剂的患者，有一半是无效的，确立判别个体的治疗反应性(反应-无反应)的抗癌剂感受性预测标记是当务之急。
[0006]通常，癌化学疗法的治疗疗程是长期进行的，事实上，只有在观察副作用的出现而进行了几个疗程的治疗之后才能判断是否取得效果以及是否应该继续给药，但是到了这样的时候，则需要花费长期的时间和高额的医药费，也出现了副作用。因此，如果有对于各个患者在治疗前或者治疗早期就能够预测是否能够得到效果的方法，就能够减轻患者的负担和副作用表现，削减医药费。
[0007]CPT-1I虽然自身具有抗肿瘤活性，但在体内通过羧酸酯酶(Carboxyl esterase)活化，转换为抗肿瘤活性比CPT-1l强大约100?数千倍的7-乙基-10-羟基喜树碱(7-ethyl-10-hydroxycamptothecin，SN-38)。据认为CPT-11和SN-38同时在体内存在，呈现抗肿瘤效果。SN-38在肝细胞内通过UDP-葡萄糖醛酸基转移酶(UGT:UDP-g lucurono sy Itransferase)接受葡萄糖醛酸化，成为没有细胞毒性的葡萄糖醛酸化的SN-38(SN-38G)，主要排泄至胆汁中而向肠道移动，其后，排泄到粪便中。排泄到肠道的一部分SN-38G通过肠内细菌所具有的β-葡萄醣醛酸酶脱去葡萄糖醛酸，再次成为活性型SN-38，并经由通过肠道上皮的转运蛋白再吸收而进行肠肝循环、通过肠上皮细胞内的UGT进行葡萄糖醛酸化等步骤而被代谢、排泄(非专利文献7)。此时，认为SN-38损害肠道粘膜，诱发腹泻。此外，还会对细胞分裂活跃的骨髓产生影响，引起红细胞减少、白细胞减少、血小板减少。
[0008]严重的腹泻、嗜中性粒细胞减少症等副作用，UGTlAl遗传多态性所带来的SN-38体内暴露量的变化显示为一个原因。但是，涉及治疗效果，由于从作为前药的CPT-1l向活性代谢物SN-38的转换和其解毒、在肠道循环过程中SN-38的再生成、CPT-1l自身的代谢和从代谢物生成SN-38的所谓体内动态的复杂性，此外，由于抗肿瘤效果多受肿瘤方面的主要原因所决定，因此，还没有通过药物动态能够预测治疗效果的报告。还有报告，末梢血单核球细胞的羧酸酯酶mRNA表达量与SN-38和SN-38G的AUC比相关，但是与肿瘤缩小效果不相关(非专利文献8)。
[0009]作为CPT-1l感受性或耐性相关的肿瘤方面的因子，报告有作为SN-38的标的的I型拓扑异构酶(Topoisomerase I)有无突变及表达量、参与从CPT-11向SN-38转换的羧酸酯酶活性(非专利文献9 )、影响CPT-11、SN-3 8的细胞内蓄积量的转运蛋白(mu 11 i drugresistance protein(MRP)_l、MRP_2、Breast cancer resistant protein(BCRP)/ABCG2)的参与，此外，有关于细胞增殖抗原K1-67、癌抑制基因p53等与使用CPT-11治疗的反应性的关联的研究。最近，在体外(in vitro)，试着通过组合抗癌剂感受性数据和微阵列数据来系统地预测抗癌剂感受性，研究了喜树碱类的托泊替康(非专利文献10)。在临床研究中，最近报告了具有抗细胞凋亡作用的金属蛋白酶I组织抑制剂(Ti ssue inhibitor ofmetalloproteinase-1，TIMP-1)的血楽中水平，与对转移结肠-直肠癌的CPT-11+5-FU并用疗法的临床预后的相关有显著性(非专利文献11)。
[0010]虽然认识到对CPT-1l的感受性预测生物标记的必要性而做了很多研究，但是也有报告等指出，对于作为标的的I型拓扑异构酶(Topoisomerase I)而言，与作为5-FU感受性预测因子的胸苷酸合酶，均没有发现与5-FU+CPT-11并用疗法的治疗反应性之间有明确的关联性(非专利文献12)，并未确立预测治疗反应性的明确的生物标记。现有技术文献
[0011]非专利文献
[0012]非专利文献1:JClin Oncol 1993;11:909-913
[0013]非专利文献2:SeminOncol 1999;26(lSuppl5):6-12
[0014]非专利文献3:Lancet 1998;352:1407-1412
[0015]非专利文献4:ProASCO 2005；Abstract#3506
[0016]非专利文献5:NEngl J Med 2000;343:905-914
[0017]非专利文献6:Lancet 2000;355:1041-1047
[0018]非专利文献7:Cancer Res 1991;51:4187-4191
[0019]非专利文献8:Cl in Cancer Res 2005;11:6901-6907
[0020]非专利文献9:PharmacogenetGenomics 2007 ； 17:1-10
[0021]非专利文献10:Nat Med 2006;12:1294-1300
[0022]非专利文献ll:ClinCancer Res 2007;13:4117-4122
[0023]非专利文献12:1nt J Cancer 2004;111:252-258
【发明内容】
[0024]发明要解决的课题
[0025]本发明的目的在于提供一种能够判别各个患者的治疗反应性的抗癌剂感受性判定标记和利用其的新的癌症治疗方法。
[0026]用于解决课题的方法
[0027]为此，本发明的发明人培养人癌细胞株，使用毛细管电泳-飞行时间型质量分析仪(CE-TOFMS)对SN-38暴露后的细胞内代谢改变进行网罗式分析，进行抗癌剂感受性判定标记的探索，发现在SN-38低感受性细胞中确认SN-38暴露后细胞内水平显著上升的峰，或在SN-38高感受性细胞中确认SN-38暴露后细胞内水平显著上升的峰，并发现该峰是在质量分析仪中，本体或其片段是作为m/z = 149.05?149.06的阴离子被检测出的分子、作为m/z =152.99?153.00的阴离子被检测出的分子、作为m/z = 724.34?724.35的阳离子被检测出的分子、甘油三磷酸、二氢生物蝶呤(Dihydrob1pterin:BH2)、γ -氨基丁酸(GABA)、乳酸、2-甲基丁酰肉毒碱。此外，发现SN-38高感受性细胞或SN-38低感受性细胞中，在SN-38暴露后，天冬酰胺、天冬氨酸表现出与对照组不同的细胞内水平的变动，并发现通过将SN-38暴露时的天冬酰胺对天冬氨酸的比除以SN-38非暴露时的天冬酰胺对天冬氨酸的比所算出的值是抗癌剂的感受性判定标记。此外，本发明的发明人培养8种人癌细胞株，对于这些人癌细胞株的细胞内代谢物，使用CE-TOFMS进行抗癌剂感受性判定标记的探索，发现伴随着对抗癌剂感受性的降低而细胞内水平上升的代谢物，发现该代谢物是GABA、1-甲基腺苷、谷胱甘肽(GSH)所参与的代谢系统上的物质。基于上述见解进一步进行研究，结果发现，如果将来自癌症患者机体的试样中的这些代谢物的浓度、上述代谢物浓度的比作为指标，就能够判定该癌症患者的癌对于抗癌剂是否有感受性，此外，如果将这些代谢物的浓度、改变、上述代谢物浓度的比作为指标，就能够进行抗癌剂感受性增强剂的筛选，如果并用该抗癌剂感受性增强剂和作为感受性兴奋对象的抗癌剂，就能够大幅提高该抗癌剂的治疗效果，从而完成了本发明。
[0028]即，本发明提供一种抗癌剂感受性判定标记，其包含选自在质量分析仪中，本体或其片段是作为m/z = 149.05?149.06的阴离子被检测出的分子(以下，称为代谢物A)、作为m/z = 152.99?153.00的阴离子被检测出的分子(以下，称为代谢物B)、作为m/z = 724.34?724.35的阳离子被检测出的分子(以下，称为代谢物D)、甘油三磷酸、二氢生物蝶呤、GABA、乳酸、天冬酰胺、天冬氨酸、2-甲基丁酰肉毒碱、1-甲基腺苷、谷胱甘肽和这些分子所参与的代谢系统上的物质中的一种以上的分子。
[0029]此外，本发明提供一种抗癌剂感受性的判定方法，其特征在于，测定检测体中的上述物质。
[0030]此外，本发明提供一种用于实施抗癌剂感受性的判定方法的试剂盒，其特征在于，包括用于测定上述物质的方案。
[0031 ]此外，本发明提供一种以上述物质的表达改变为指标的抗癌剂感受性增强剂的筛选方法。
[0032]此外，本发明提供一种由上述筛选方法得到的抗癌剂感受性增强剂。
[0033]此外，本发明提供一种含有上述抗癌剂感受性增强剂和作为感受性增强对象的抗癌剂的组合的癌治疗用组合物。
[0034]此外，本发明提供用于判定抗癌剂感受性的上述物质。
[0035]发明的效果
[0036]使用本发明的抗癌剂感受性判定标记，就能够在抗癌剂给药前或抗癌剂给药开始后早期适宜判定各个患者的抗癌剂治疗反应性，结果，能够选择具有更高治疗效果的抗癌剂，作为其结果，能够防止不能期待治疗效果的抗癌剂的继续给药所带来的癌症进展、副作用的增大，并且还能够期待减少患者的负担，削减医疗费。此外，使用该标记，就能够筛选增强抗癌剂感受性的药剂，如果并用作为其对象的抗癌剂和抗癌剂感受性增强剂，就能够大幅提高癌治疗效果。本发明的抗癌剂感受性判定标记的测定试剂，作为抗癌剂感受性判定试剂是有用的。
【附图说明】
[0037]图1为表示50nmol/L SN-38暴露时，HT-29、HCT_116细胞的平均生存率随时间变化的图。
[0038]图2为表示HT-29、HCT-116中SN-38暴露后的代谢物A的细胞内水平随时间变化的图。
[0039]图3为表示HT-29、HCT-116中SN-38暴露后的代谢物B的细胞内水平随时间变化的图。
[0040]图4为表示HT-29、HCT-116中SN-38暴露后的2-甲基丁酰肉毒碱的细胞内水平随时间变化的图。
[0041 ] 图5为表示HT-29、HCT-116中SN-38暴露后的BH2的细胞内水平随时间变化的图。
[0042]图6为表示HT-29、HCT-116中SN-38暴露后的代谢物D的细胞内水平随时间变化的图。
[0043]图7为表示HT-29、HCT-116中SN-38暴露后的甘油三磷酸的细胞内水平随时间变化的图。
[0044]图8为表示HT-29、HCT-116中SN-38暴露后的GABA的细胞内水平随时间变化的图。
[0045]图9为表示HT-29、HCT-116中SN-38暴露后的乳酸的细胞内水平随时间变化的图。
[0046]图10为表示HT-29、HCT-116中SN-38暴露后的天冬酰胺的细胞内水平随时间变化的图。
[0047]图11为表示HT-29、HCT-116中SN-38暴露后的天冬氨酸的细胞内水平随时间变化的图。
[0048]图12为表示HT-29、HCT-116中SN-38暴露时的天冬酰胺对天冬氨酸的比除以SN-38非暴露时的天冬酰胺对天冬氨酸的比所计算出的值([天冬酰胺/天冬氨酸]SN-38/[天冬酰胺/天冬氨酸]对照)随时间变化的图。
[0049]图13为表示稳定状态中的GABA的细胞内水平和各癌细胞株中的SN-38感受性的关系的图。
[0050]图14为表示对8种人大肠癌细胞株的SN-38感受性的图。
[0051 ]图15为表示稳定状态下的1-甲基腺苷、GABA、亚牛磺酸、谷胱甘肽、1_甲基烟酰胺的细胞内水平与各癌细胞株中的SN-38感受性的关系的图。
[0052]图16为表示稳定状态下的谷胱甘肽代谢系统上的物质的细胞内水平与各癌细胞株中的SN-38感受性的关系的图。
【具体实施方式】
[0053]本发明的抗癌剂感受性判定标记，是选自代谢物A、B、D、甘油三磷酸、二氢生物蝶呤、GABA、乳酸、天冬酰胺、天冬氨酸、2-甲基丁酰肉毒碱、1-甲基烟酰胺、谷胱甘肽和这些分子所参与的代谢系统上的物质的分子(以下，也称为“代谢系统物质”)。其中，作为代谢物A、B、D，是在毛细管电泳-飞行时间型质量分析仪(CE-TOFMS)中，本体或其片段是作为m/z =149.05?149.06的阴离子被检测出的分子、本体或其片段是作为m/z = 152.99?153.00的阴离子被检测出的分子、本体或其片段是作为m/z = 724.34?724.35的阳离子被检测出的分子。此外，包括使得这些分子的浓度改变的代谢系统上的全部的物质，作为该物质，可以举出增强代谢为这些分子的物质、抑制的物质、促进从这些分子代谢的物质、抑制的物质等。
[0054]本发明的抗癌剂感受性判定标记之一，是甘油三磷酸或其所参与的代谢系统上的物质(也称为甘油三磷酸代谢系统物质)，作为该物质，除了甘油三磷酸之外，还包括代谢系统中使得甘油三磷酸的浓度改变的所有的物质，可以举出增强向甘油三磷酸代谢的物质、抑制的物质，促进从甘油三磷酸代谢的物质、抑制的物质等。这些中，特别优选甘油三磷酸。
[0055]本发明中的抗癌剂感受性判定标记之一，是二氢生物蝶呤(BH2)或其所参与的代谢系统上的物质(也称为BH2代谢系统物质)，作为该物质，除了BH2，还包括代谢系统中使得BH2的浓度改变的全部的物质，可以举出增强向BH2代谢的物质、抑制的物质、促进从BH2代谢的物质、抑制的物质等。这些中，特别优选BH2。
[0056]本发明中的抗癌剂感受性判定标记之一，是GABA或其所参与的代谢系统上的物质(也称为GABA代谢系统物质)，作为该物质，除了GABA，还包括代谢系统中使得GABA浓度改变的全部的物质，可以举出增强向GABA代谢的物质、抑制的物质、促进从GABA代谢的物质、抑制的物质等。这些中，特别优选GABA。
[0057]本发明中的抗癌剂感受性判定标记之一，是乳酸或其所参与的代谢系统上的物质(也称为乳酸代谢系统物质)，作为该物质，除了乳酸，还包括代谢系统中使得乳酸浓度改变的全部的物质，可以举出增强向乳酸代谢的物质、抑制的物质、促进从乳酸代谢的物质、抑制的物质等。这些中，特别优选乳酸。
[0058]本发明中的抗癌剂感受性判定标记之一，是天冬酰胺、天冬氨酸或它们所参与的代谢系统上的物质。在为天冬酰胺和天冬氨酸的情况下，它们的比很重要，具体而言，可以举出根据天冬酰胺和天冬氨酸的浓度算出的天冬酰胺对天冬氨酸的比，更具体而言，抗癌剂暴露时的天冬酰胺对天冬氨酸的比除以抗癌剂非暴露时的天冬酰胺对天冬氨酸的比所算出的值
[0059]([天冬酰胺/天冬氨酸]_^[天冬酰胺/天冬氨酸]*ff1。
[0060]作为计算该比时所使用的物质，除了天冬酰胺、天冬氨酸，能够使用天冬酰胺、天冬氨酸所参与的代谢系统上的物质(也称为天冬酰胺代谢系统物质、天冬氨酸代谢系统物质)，还包括代谢系统中使得天冬酰胺、天冬氨酸浓度改变的全部的物质，可以举出增强向天冬酰胺、天冬氨酸代谢的物质、抑制的物质、促进从天冬酰胺、天冬氨酸代谢的物质、抑制的物质等。这些中，特别优选天冬酰胺、天冬氨酸。
[0061]本发明中的抗癌剂感受性判定标记之一，是2-甲基丁酰肉毒碱或其所参与的代谢系统上的物质(也称为2-甲基丁酰肉毒碱代谢系统物质)，作为该物质，除了2-甲基丁酰肉毒碱，还包括代谢系统中使得2-甲基丁酰肉毒碱浓度改变的全部的物质，可以举出增强向2-甲基丁酰肉毒碱代谢的物质、抑制的物质、促进从2-甲基丁酰肉毒碱代谢的物质、抑制的物质等。这些中，特别优选2-甲基丁酰肉毒碱。
[0062]本发明中的抗癌剂感受性判定标记之一，是1-甲基腺苷或其所参与的代谢系统上的物质(也称为1-甲基腺苷代谢系统物质)，作为该物质，除了 1-甲基腺苷，还包括代谢系统中使得1-甲基腺苷浓度改变的全部的物质，可以举出增强向1-甲基腺苷的代谢兴奋的物质、抑制的物质、促进从1-甲基腺苷代谢的物质、抑制的物质等。这些中，特别优选1-甲基腺苷。
[0063]本发明中的抗癌剂感受性判定标记之一，是谷胱甘肽或其所参与的代谢系统上的物质(也称为谷胱甘肽代谢系统物质)，作为该物质，除了谷胱甘肽，还包括代谢系统中使得谷胱甘肽浓度改变的全部的物质，可以举出增强向谷胱甘肽代谢的物质、抑制的物质、促进从谷胱甘肽代谢的物质、抑制的物质等。这些中，优选谷胱甘肽、亚牛磺酸、1-甲基烟酰胺、牛磺酸、谷胱甘肽二硫化物(GSSG)、S_腺苷高半胱氨酸、烟酰胺、γ -谷氨酰半胱氨酸(γ-Glu-Cys)、精胺，特别优选谷胱甘肽、亚牛磺酸、1-甲基烟酰胺。
[0064]代谢物A、B、2_甲基丁酰肉毒碱，如后述的实施例所示，在SN-38暴露后，在作为SN-38低感受性的HT-29中，观察到细胞内水平显著上升。另一方面，在作为SN-38高感受性的HCT-116中，没有观察到细胞内水平的显著改变。因此，这些物质，特别是作为CPT-1USN-38等的抗癌剂感受性判定标记是有用的。
[0065]代谢物D、甘油三磷酸、BH2、乳酸，如后述的实施例所示，在SN-38暴露后，在作为SN-38高感受性的HCT-116中，观察到细胞内水平显著上升。另一方面，在作为SN-38低感受性的HT-29中，没有观察到细胞内水平的显著变化。因此，这些物质，特别是作为CPT-11、SN-38等的抗癌剂感受性判定标记是有用的。
[0066]GABA，如后述的实施例所示，在SN-38暴露后，在作为SN-38低感受性的HT-29中，观察到细胞内水平显著上升。另一方面，在作为SN-38高感受性的HCT-116中，没有观察到细胞内水平的显著改变。此外，作为原先的代谢物水平，在SN-38低感受性的HT-29中，细胞内水平高，在SN-38高感受性的HCT-116中，细胞内水平低。再者，使用8种人癌细胞株进行研究，随着对SN-38感受性的降低，细胞内GABA水平上升。因此，GABA，特别是作为CPT-1USN38等的抗癌剂感受性判定标记是有用的。
[0067]天冬酰胺，如后述的实施例所示，在作为SN-38高感受性的HCT-116中，在SN-38暴露后表现出与对照组不同的细胞内水平的改变，但是，在作为SN-38低感受性的HT-29中，没有观察到SN-38暴露组与对照组存在细胞内水平的差异。此外，天冬氨酸，如后述的实施例所示，在作为SN-38低感受性的HT-29中，在SN-38暴露后，表现出与对照组不同的细胞内水平的改变，但是在作为SN-38高感受性的HCT-116中，没有观察到SN-38暴露组与对照组存在细胞内水平的差异。SN-38暴露时的天冬酰胺对天冬氨酸的比除以SN-38非暴露时的天冬酰胺对天冬氨酸的比而算出的值([天冬酰胺/天冬氨酸]I38/[天冬酰胺/天冬氨酸]3?)，在作为SN-38高感受性的HCT-116中，观察到其显著上升，另一方面，在作为SN-38低感受性的HT-29中，观察到其显著减少。因此，该天冬酰胺与天冬氨酸浓度的比，特别是作为CPT-11、SN-38等的抗癌剂感受性判定标记是有用的。
[0068]1-甲基腺苷、谷胱甘肽代谢系类物质，如后述的实施例所示，使用8种人癌细胞株进行研究，随着对SN-38感受性的降低，细胞内的这些物质的水平上升。因此，1-甲基腺苷、谷胱甘肽代谢系统物质，特别是作为CPT-1USN-38等的抗癌剂感受性判定标记是有用的。
[0069]作为本发明的抗癌剂感受性判定标记的对象的抗癌剂，没有特别限定，例如，可以举出0?1'-11、5?^-38、奥沙利钼、环磷酰胺(07(31(^1108。1^1111(16)、异磷酰胺(1:[>08€31111(16)、噻替哌(^11；!_(^6口3)、美法仑(11^1口1^1311)、白消安(busulfan)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimus tine)、达卡巴嘆(dacarbaz ine )、丙卡巴餅(procarbaz ine )、替莫挫胺(temozo1mide)、顺钼(cisplatin)、卡钼(carboplatin)、奈达钼(nedaplatin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、培美曲塞(pemetrexed)、氟尿啼啶(f IuorouraciI)、替加氟/尿啼啶(tegaful/uracil)、脱氧氟尿苷(doxifluridine)、替加氟/吉美拉西/奥替拉西(tegaful/gimeraci 1/oteraci I)、卡培他滨(03口60；^313；!_116)、阿糖胞苷(cytarabine)、依诺他滨(enocitabine)、吉西他滨(36111(3；!^313；!_116)、6-疏基嘌呤(6161^3。七(^111'；!_116)、氣达拉滨(f Iudarabin)、喷司他汀(pentostatin)、克拉屈滨(cladribine)、轻基脈(hydroxyurea)、多柔比星(<^010!'1113；!_(3；!_11)、表柔比星(6。；!_1'1113；!_(3；!_11)、佐柔比星((13111101'1113；!_(3；!_11)、依达比星(idarubicine)、卩比柔比星(pirarubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、氨柔比星(amurub icin)、放线菌素 D(actinomycin D)、博来霉素(bleomycine)、派来霉素(pep leomyc in)、丝裂霉素 C(mytomycin C)、阿柔比星(aclarubicin)、净司他丁(zinostatin)、长春新減(vincristine)、长春地辛(vindesine)、长春減(vinblastine)、长春瑞滨(vinoreIbine)、紫杉醇(pacI i taxeI)、多西紫杉醇(docetaxeI)、托泊替康(nogitecan，topotecan)、依托泊苷(etoposide)、泼尼松龙(prednisolone)、地塞米松(dexame thasone )、他莫昔芬(tamoxifen)、托瑞米芬(toremifene)、甲轻孕酮(medroxyprogesterone)、|5可男|3 曲P坐(anastrozole)、依西美坦(exemestane)、来曲 P坐(Ietrozole)、利妥昔(rituximab)、伊马替尼(;!_11^七;!_11；!_13)、吉非替尼(36:[>;^;!_11；!_13)、吉姆单抗奥佐米星(gemtuzumab ozogamicin)、硼替佐米(bortezomib)、厄洛替尼(er1tinib)、西妥昔单抗(cetuximab)、贝伐单抗(be vac i zumab )、舒尼替尼(sunitinib)、索拉非尼(sorafenib)、达沙替尼(dasatinib)、帕尼单抗(panitumumab)、门冬酰胺酶(asparaginase)、维甲酸(tretinoin)、三氧化二砷(arsenic tr1xide)、或它们的盐、或它们的活性代谢物等。其中，优选植物生物碱类抗癌剂，特别优选CPT-11、SN-38或者它们的土卜
ΠΤΤ.0
[0070]在使用本发明的抗癌剂感受性判定标记判定抗癌剂感受性时，测定检测体中的这些代谢系统物质即可。在此，作为检测体，可以列举来自患有癌的被检验者(癌患者)机体的试样，例如，可以列举血液、血清、血浆、尿、癌组织-细胞、腹水、胸水、脑脊液、便、痰等，但特别优选血清。
[0071]另外，作为本发明对象的癌，可以列举以喉癌为代表的唇、口腔和喉癌、以食道癌、胃癌、结肠-直肠癌等为代表的消化器官癌、以肺癌为代表的呼吸器官和胸腔内脏器官癌、骨及关节软骨癌、皮肤的恶性黑色素瘤、鳞状细胞癌及其它皮肤癌、以间皮瘤为代表的间皮和软组织癌、以乳腺癌、子宫癌、卵巢癌为代表的女性性器官癌、以前列腺癌为代表的男性性器官癌、以膀胱癌为代表的尿路癌、以脑肿瘤为代表的眼、脑和中枢神经系统癌、甲状腺和其它内分泌腺癌，以非何杰金氏淋巴瘤和淋巴细胞性白血病为代表的淋巴组织、造血组织和关联组织癌、以及以这些癌为原发病灶的转移组织的癌等，但特别是能够对非小细胞肺癌、小细胞肺癌、宫颈癌、卵巢癌、胃癌、结肠-直肠癌、鳞状细胞癌、恶性淋巴瘤适合地利用。
[0072]检测体中这些代谢系统物质的测定方法，可以根据被测定对象物来适宜决定，例如，可以通过CE-TOFMS、Gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS)等各种质量分析装置、HPLC、免疫学测定方法、生化学测定方法等测定。
[0073]对于代谢物A、B、2_甲基丁酰肉毒碱而言，在判定作为对象的抗癌剂的感受性时，测定抗癌剂给药前和给药后的来自癌症患者机体的试样中的这些代谢系统物质浓度，如果与抗癌剂给药前相比，给药后这些代谢系统物质的浓度上升，则能够判定该癌没有抗癌剂感受性，如果在抗癌剂给药前后这些代谢系统物质的浓度没有变化，则能够判定该癌具有抗癌剂感受性。
[0074]此外，在抗癌剂给药后的初期阶段，当这些代谢系统物质的浓度判断为比规定的标准浓度高时，能够判定该癌对作为对象的抗癌剂没有感受性。当对作为对象的抗癌剂没有感受性时，不能期待该药效，在将这种不能期待药效的抗癌剂继续给药的情况下，存在癌症进展、副作用的增大的危险。这样，本发明的抗癌剂感受性判定标记不仅能够判定抗癌剂治疗反应性，还对防止不能期待药效的抗癌剂的继续给药所带来的副作用增大有很大贡献。
[0075]对于代谢物D、甘油三磷酸、BH2、乳酸而言，在判定对作为对象的抗癌剂的感受性时，测定抗癌剂给药前和给药后的来自癌症患者机体的试样中的这些代谢系统物质浓度，如果与抗癌剂给药前相比，给药后这些代谢系统物质的浓度上升，则能够判定该癌具有抗癌剂感受性，如果在抗癌剂给药前后这些代谢系统物质的浓度没有变化，则能够判定该癌没有抗癌剂感受性。
[0076]此外，在抗癌剂给药后初期阶段，当这些代谢系统物质的浓度判断为比规定的标准浓度低时，能够判定该癌对作为对象的抗癌剂没有感受性。当对作为对象的抗癌剂没有感受性时，不能期待该药效。在将这种不能期待药效的抗癌剂继续给药的情况下，存在癌症进展、副作用的增大的危险。这样，本发明的抗癌剂感受性判定标记不仅能够判定抗癌剂治疗反应性，还对防止不能期待药效的抗癌剂的继续给药所带来的副作用增大有很大贡献。
[0077]对于GABA而言，在判定对作为对象的抗癌剂的感受性时，测定抗癌剂给药前和给药后的来自癌症患者机体的试样中的这些代谢系统物质浓度，如果与抗癌剂给药前相比，给药后这些代谢系统物质的浓度上升，则能够判定该癌没有抗癌剂感受性，如果在抗癌剂给药前后这些代谢系统物质的浓度没有变化，则能够判定该癌具有抗癌剂感受性。
[0078]此外，在抗癌剂给药前或给药后初期阶段，当这些代谢系统物质的浓度判断为比规定的标准浓度高时，能够判定该癌对作为对象的抗癌剂没有感受性。当对作为对象的抗癌剂没有感受性时，不能期待该药效。在将这种不能期待药效的抗癌剂继续给药的情况下，存在癌症进展、副作用的增大的危险。这样，本发明的抗癌剂感受性判定标记不仅能够判定抗癌剂治疗反应性，还对防止不能期待药效的抗癌剂的继续给药所带来的副作用增大有很大贡献。
[0079]对于天冬酰胺、天冬氨酸的浓度之比而言，在判定对作为对象的抗癌剂的感受性时，测定抗癌剂给药前和给药后来自癌症患者机体的试样中的天冬酰胺和天冬氨酸的浓度，如果与抗癌剂给药前相比，给药后天冬酰胺对天冬氨酸的比上升，则能够判定该癌具有抗癌剂感受性，如果在抗癌剂给药前后天冬酰胺对天冬氨酸的比减少，则能够判定该癌没有抗癌剂感受性。
[0080]此外，在抗癌剂给药后初期阶段，当天冬酰胺对天冬氨酸的比判断为比规定的标准低时，能够判定该癌对作为对象的抗癌剂没有感受性。当对作为对象的抗癌剂没有感受性时，不能期待该药效。在将这种不能期待药效的抗癌剂继续给药的情况下，存在癌症进展、副作用的增大的危险。这样，本发明的抗癌剂感受性判定标记不仅能够判定抗癌剂治疗反应性，还对防止不能期待药效的抗癌剂的继续给药所带来的副作用增大有很大贡献。
[0081]对于1-甲基腺苷、谷胱甘肽代谢系统物质而言，在判定对作为对象的抗癌剂的感受性时，在抗癌剂给药前阶段，当这些代谢系统物质的浓度判断为比规定的标准浓度高时，能够判定该癌对作为对象的抗癌剂没有感受性。当对作为对象的抗癌剂没有感受性时，不能期待该药效。在将这种不能期待药效的抗癌剂继续给药的情况下，存在癌症进展、副作用的增大的危险。这样，本发明的抗癌剂感受性判定标记不仅能够判定抗癌剂治疗反应性，还对防止不能期待药效的抗癌剂的继续给药所带来的副作用增大有很大贡献。
[0082]在实施本发明的抗癌剂感受性的判定方法时，优选使用含有用于测定检测体中的这些代谢系统物质的方案的试剂盒。该试剂盒中，包含这些代谢系统物质的测定试剂、测定试剂的使用方法、以及用于判定抗癌剂感受性有无的基准等。该基准包括这些代谢系统物质的标准浓度或标准比、判定为高的浓度或比、判断为低的浓度或比、对测定结果产生影响的主要原因和其影响程度等，这些浓度能够针对每个作为对象的抗癌剂进行设定。使用该基准，能够如前所述进行判定。
[0083]如果以抗癌剂暴露后的代谢物A、B、2_甲基丁酰肉毒碱、GABA、1_甲基腺苷、谷胱甘肽代谢系统物质的表达改变，具体而言，以改变的抑制或浓度的降低为指标，就能够筛选抗癌剂感受性增强剂。即，在体外(in vitro)或体内(in vivo)，使得代谢物A、B、2_甲基丁酰肉毒碱、GABA、1-甲基腺苷、谷胱甘肽代谢系统物质的抗癌剂暴露前的浓度降低的物质、抑制抗癌剂暴露后的改变或使得浓度降低的物质，增强抗癌剂感受性。例如，在体外(invitro)，用某种物质处理抗癌剂暴露前的各种癌细胞株时，使得细胞内的代谢物A、B、2-甲基丁酰肉毒碱、GABA、1-甲基腺苷、谷胱甘肽代谢系统物质的浓度降低的物质，是增强该抗癌剂感受性的物质(抗癌剂感受性增强剂)。此外，在体外(in vitro)，抑制各种癌细胞株中抗癌剂暴露后的细胞内的代谢物A、B、2-甲基丁酰肉毒碱、GABA、1-甲基腺苷、谷胱甘肽代谢系统物质的改变的物质，是增强该抗癌剂感受性的物质(抗癌剂感受性兴奋及)。此外，在体内(in vivo)，使得荷癌动物中抗癌剂暴露前的代谢物A、B、2_甲基丁酰肉毒碱、GABA、1_甲基腺苷、谷胱甘肽代谢系统物质的浓度降低的物质，抑制抗癌剂暴露后的代谢物A、B、2-甲基丁酰肉毒碱、GABA、1-甲基腺苷、谷胱甘肽代谢系统物质的改变或使得浓度降低的物质，是增强该抗癌剂感受性的物质(抗癌剂感受性增强剂)。
[0084]此外，如果以抗癌剂暴露后的代谢物D、甘油三磷酸、BH2、乳酸的表达改变，具体而言，以改变的促进或浓度的上升为指标，就能够筛选抗癌剂感受性增强剂。即，在体外(invitro)或体内(in vivo)，促进代谢物D、甘油三磷酸、BH2、乳酸在抗癌剂暴露后的改变或使浓度上升的物质，增强抗癌剂感受性。例如，在体外(in vitro)，促进各种癌细胞株中的抗癌剂暴露后的细胞内的代谢物D、甘油三磷酸、BH2、乳酸的改变的物质，是增强该抗癌剂感受性的物质(抗癌剂感受性增强剂)。此外，在体内(i η V i V ο )，促进荷癌动物中的抗癌剂暴露后的代谢物D、甘油三磷酸、BH2、乳酸的改变或使浓度上升的物质，是增强该抗癌剂感受性的物质(抗癌剂感受性增强剂)。
[0085]此外，如果以抗癌剂暴露后的天冬酰胺对天冬氨酸的比的改变、具体而言，以比的上升为指标，就能够筛选抗癌剂感受性增强剂。即，在体外(in vitro)或体内(in vivo)，使得抗癌剂暴露后的天冬酰胺与天冬氨酸浓度之比上升的物质，增强抗癌剂感受性。例如，在体外(in vitro)，使得各种癌细胞株中抗癌剂暴露后的细胞内天冬酰胺与天冬氨酸浓度之比上升的物质，是增强该抗癌剂感受性的物质(抗癌剂感受性增强剂)。此外，在体内(i ηvivo)，使得荷癌动物中的抗癌剂暴露后的天冬酰胺与天冬氨酸浓度之比上升的物质，是增强该抗癌剂感受性的物质(抗癌剂感受性增强剂)。其中，作为这些浓度的比，可以使用抗癌剂暴露时的天冬酰胺对天冬氨酸的比除以抗癌剂非暴露时的天冬酰胺对天冬氨酸的比所算出的值，当使用该值时，能够以敏锐的灵敏度筛选抗癌剂感受性增强剂。
[0086]此外，如果以代谢物A、B、2-甲基丁酰肉毒碱、GABA、1_甲基腺苷、谷胱甘肽代谢系统物质为指标，就能够筛选抗癌剂。即，在体外(in vitro)或体内(in vivo)，如果某种物质使得这些代谢系统物质的浓度改变，则该物质为抗癌剂。例如，在体外(in vitro)，如果将某种物质暴露于各种癌细胞株后，与暴露前相比，代谢物A、B、2-甲基丁酰肉毒碱、GABA、1-甲基腺苷、谷胱甘肽代谢系统物质的浓度改变，则该物质为抗癌剂。此外，如果向荷癌动物投与某种物质后，这些代谢系统物质的浓度发生改变，则该物质为抗癌剂。如果是能够期待药效的抗癌剂，则这些代谢系统物质的浓度改变比肿瘤的缩小或杀死细胞效果更早出现，因此，通过以这些代谢系统物质为指标进行筛选，就能够以更短时间的研究判定该物质作为抗癌剂是否是有用的。在削减抗癌剂开发所需的劳力和费用方面，能够期待很好的效果。
[0087]此外，如果以代谢物D、甘油三磷酸、BH2、乳酸为指标，就能够筛选抗癌剂。即，在体夕Kin vitro)或体内(in vivo)，如果某种物质使得这些代谢系统物质的浓度上升，则该物质为抗癌剂。例如，在体外(in vitro)，如果将某种物质暴露于各种癌细胞株后，与暴露前相比，代谢物D、甘油三磷酸、BH2、乳酸的浓度上升，则该物质为抗癌剂。此外，如果向荷癌动物投与某种物质后，这些代谢系统物质的浓度上升，则该物质为抗癌剂。如果是能够期待药效的抗癌剂，则这些代谢系统物质的浓度上升比肿瘤的缩小或杀死细胞效果更早出现，因此，通过以这些代谢系统物质为指标进行筛选，就能够以更短时间的研究判定该物质作为抗癌剂是否是有用的。在削减抗癌剂开发所需的劳力和费用方面，能够期待很好的效果。
[0088]此外，如果以天冬酰胺对天冬氨酸的比为指标，就能够筛选抗癌剂。即，在体外(invitro)或体内(in vivo)，如果某种物质使得天冬酰胺与天冬氨酸浓度之比上升，则该物质为抗癌剂。例如，在体外(in vitro)，如果某种物质暴露于各种癌细胞株后，与暴露前相比，天冬酰胺与天冬氨酸浓度之比上升，则该物质为抗癌剂。此外，如果向荷癌动物投与某种物质后，天冬酰胺与天冬氨酸浓度之比上升，则该物质为抗癌剂。如果是能够期待药效的抗癌剂，天冬酰胺与天冬氨酸浓度之比的上升比肿瘤的缩小或杀死细胞效果更早出现，因此，通过以天冬酰胺与天冬氨酸浓度之比为指标进行筛选，就能够以更短时间的研究判定该物质作为抗癌剂是否是有用的。在削减抗癌剂开发所需的劳力和费用方面，能够期待很好的效果O
[0089]其中，作为天冬酰胺与天冬氨酸浓度之比，可以使用抗癌剂暴露时的天冬酰胺对天冬氨酸的比除以抗癌剂非暴露时的天冬酰胺对天冬氨酸的比所算出的值，当使用该值时，能够以敏锐的灵敏度筛选抗癌剂。
[0090]如果并用这样得到的抗癌剂感受性增强剂和作为感受性增强对象的抗癌剂，就能够大幅提高该抗癌剂的治疗效果。作为组合抗癌剂感受性增强剂和作为感受性增强对象的抗癌剂的方式，可以是包含这些成分两者的一种组合物，也可以是各自分别的制剂的组合。此外，也可以将这些成分分别以各自的给药方式给药。作为在此使用的作为对象的抗癌剂，与前述同样，可以举出CPT-1 1、SN-38、奥沙利钼、环磷酰胺(cyclophosphamide )、异磷酰胺(ifosfamide)、噻替哌(th1tepa)、美法仑(meIphaIan)、白消安(busulfan)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)、达卡巴嘆(dacarbazine)、丙卡巴餅(procarbazine)、替莫挫胺(temozo1mide)、顺钼(cisplatin)、卡钼(carboplatin)、奈达钼(nedaplatin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、培美曲塞(pemetrexed)、氣尿啼啶(f Iuorouracil)、替加氟/尿啼啶(tegaful/uracil )、脱氧氟尿苷(doxifluridine)、替加氟/吉美拉西 / 奥替拉西<^633:[>111/^；!_1116作(3；!_1/(^6以(3；!_1)、卡培他滨(03。6(3；^313；!_116)、阿糖胞苷(cytarabine)、依诺他滨(6110(3；^313；!_116)、吉西他滨(36111(3；^313；!_116)、6-巯基嘌呤(6-11161'0&卩七0卩111'；!_116)、氟达拉滨(:[>111(1&^13；!_11)、喷司他汀(卩61^08七&七；!_11)、克拉屈滨(cladribine)、轻基脈(hydroxyurea)、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、佐柔比星(daunorubicin)、依达比星(idarubicine)、卩比柔比星(pirarubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone )、氨柔比星(amurubicin)、放线菌素D(actinomycin D)、博来霉素(131601117(3；!_116)、派来霉素(卩6卩1601117(3；!_11)、丝裂霉素(^(1117七01117(3；!_11 C)、阿柔比星(aclarubicin)、净司他丁(zinostatin)、长春新減(vincristine)、长春地辛(vindesine)、长春碱(vinblastine)、长春瑞滨(vinore I bine)、紫杉醇(pac I i taxe I)、多西紫杉醇(do cet axel)、托泊替康(nogitecan，topotecan)、依托泊苷(etoposide)、泼尼松龙(prednisolone)、地塞米松(dexamethasone)、他莫昔芬(tamoxi f en)、托瑞米芬(toremifene)、甲轻孕酮(medroxyprogesterone)、阿那曲挫(anastrozole)、依西美坦(exemestane)、来曲挫(Ietrozole)、利妥昔(rituximab)、伊马替尼(imatinib)、吉非替尼(gefitinib)、吉姆单抗奥佐米星(gemtuzumab ozogamicin)、硼替佐米(bortezomib)、厄洛替尼(erlotinib)、西妥昔单抗(cetuximab)、贝伐单抗(be vac i zumab )、舒尼替尼(sunitinib)、索拉非尼(sorafenib)、达沙替尼(dasatinib)、帕尼单抗(panitumumab)、门冬酰胺酶(asparaginase)、维甲酸(tretinoin)、三氧化二砷(arsenic tr1xide)、或它们的盐、或它们的活性代谢物等。其中，优选植物生物碱类抗癌剂，特别优选CPT-1USN-38或者它们的盐。
[0091]实施例
[0092]接着，举出实施例，进一步详细说明本发明。
[0093]实施例1
[0094](I)方法
[0095](a)使用细胞
[0096]使用2种人大肠癌细胞株(HCT-116、HT-29)，这些细胞从株式会社益力多本社获得。
[0097]培养在以下条件下进行，即，Φ lOOmm/Tissue Culture Dish( IffAKI)，培养基(Doulbecco’s modified Eagle’s Medium, 10%Fetal Bovine Serum)，37°C，5%C02。
[0098](b)药剂
[0099]SN-38散装粉末从株式会社益力多本社获得。SN-38溶解在DMSO中，以使在各实验中培养基中的DMSO的浓度稀释到0.1 %以下的方式使用。
[0100](C)对SN-38的感受性评价
[0101]对两株细胞，通过MTS assay (Ce I ITi ter96?AQueous One Solut1n Ce 11Proliferat1n 48 8&7，？1'011168&)评价在50111]101凡的31^-38暴露24、48、72小时后的细胞生存率。在感受性评价中，用不同培养代数的细胞实施3次，每次进行3个样品的测定，计算其平均值和标准偏差。
[0102](d)SN_38的暴露和细胞内代谢物的采取
[0103]对两株细胞，通过更换为含有50nmol/L的SN-38的培养基而开始抗癌剂的暴露(使用仅除去SN-38的培养基作为对照组)ο在Ohr、3hr、8hr、24hr暴露后，在冰上，用5 %的甘露醇(4°C)清洗细胞后，迅速添加甲醇(4°C，含有内部标准物质)，使酶失活，保存在一80°C。其中，分别准备用于细胞计数的细胞和用于提取代谢物的细胞，进行同样的处理后，进行细胞计数，用于细胞数补正。
[0104](e)代谢组样品的制备
[0105]向一80 °C保存的甲醇溶液中加入氯仿和Mi I1-QA，进行液-液萃取，除去杂质成分。采取包含代谢物的水-甲醇层，使用分子量筛截5000Da的离心超滤膜进行除蛋白，之后，减压干燥滤液，在一80°C保存。临测定前在Mi I 1-Q水中溶解，供给代谢组测定。
[0106](f)代谢组测定
[0107]细胞内代谢物的网罗式测定由Agilent Technologies公司的毛细管电泳-飞行时间型质量分析仪(CE-TOFMS)进行。在阳离子性代谢物的网罗式测定中，以使毛细管的出口为阴极的方式施加电压，此外，在阴离子性代谢物的网罗式测定中，以使毛细管的出口为阳极的方式施加电压，一齐定量分析m/z = 50?1000的代谢物。
[0108]⑵结果
[0109]通过MTS assay对50nmol/L的SN-38暴露后随时间变化的细胞生存率进行研究，各细胞的生存率在24hr暴露后几乎没有差异。但是，随着暴露时间的延长，各细胞的生存率降低，其差异随时间而扩大。72hr暴露后的细胞生存率，HT-29为大约85%，HCT-116为大约35%,与HCT-1I相比，HT-29确认为SN-38低感受性(图1)。
[0110]通过使用CE-TOFMS进行的网罗式代谢组分析方法，对SN-38暴露所伴有的细胞内代谢组改变进行网罗式分析。对两株细胞，比较SN-38暴露24小时的组和对照组，提取两组中差异大的峰。对这些峰，将SN-38暴露后随时间的改变绘成图表，发现显示出特征性改变的以下的代谢物(图2?7、9?11)。
[0111](I)SN-38暴露后，在HT-29中观察到细胞内水平显著上升的代谢物.m/z = 149.05?149.06(阴呙子)
[0112].m/z = 152.99?153.00(阴离子)
[0113].m/z = 246.16?246.17(阳离子)
[0114](2)SN-38暴露后，在HCT-116中观察到细胞内水平显著上升的代谢物
[0115]m/z = 171.00(阴离子)
[0116]m/z = 240.10 ?240.11(阳离子)
[0117]m/z = 724.34 ?724.35(阳离子)
[0118]m/z = 89.02(阴离子)
[0119](3)在HCTl 16中，观察到SN-38暴露后表现出与对照组不同的细胞内水平改变的峰
[0120]m/z = 133.06(阳离子)
[0121](4)在HT-29中，观察到SN-38暴露后表现出与对照组不同的细胞内水平改变的峰
[0122]m/z = 134.04(阳离子)
[0123]关于m/z= 171.00的峰，使用分析软件Analyst? QS(Applied B1systems，Inc.)，进行组成的推定。根据相对于母峰的同位素的比例、精密质量等信息推定组成，结果，作为候补峰的m/z = 171.00的离子组成为C3H8O6P13使用京都大学制作的KEGG:生命系统信息统和数据库(http: //www.kegg.jp/)的代谢数据库，检索由该离子组成所推定的物质，判定该峰为甘油三磷酸。通过使用甘油三磷酸标品进行的研究，确认毛细管电泳的移动时间也是一致的。
[0124]关于m/Z= I49.05?149.06(阴离子)的峰，使用Capillary electrophoresis_quadrupole time-of-flight mass spectrometry(CE-QTOFMS)进行组成的推定。其结果，认为m/z = 149.05?149.06的离子组成为C5H9O5。
[0125]此外，关于m/z = 152.99?153.00(阴离子)的峰，使用CE-QT0FMS进行组成的推定。其结果，认为m/z = 152.99?153.00的离子组成为C3H6O5P13
[0126]此外，关于m/z = 246.16?246.17(阳离子)的峰，使用CE-QT0FMS进行组成的推定。其结果，m/z = 246.16?246.17的离子组成为&21124勵4。使用11111]1&11 Metabolome Database(http://www.hmdb.ca)检索由该离子组成所推定的物质，判定该峰为2-甲基丁酰肉毒碱。通过使用2-甲基丁酰肉毒碱标品进行的研究，确认毛细管电泳的移动时间也是一致的。
[0127]此外，关于m/z = 240.10?240.11 (阳离子)的峰，使用CE-QT0FMS进行组成的推定。其结果，m/z = 240.10?240.11的离子组成为091114他03。使用11111]1&11 Metabolome Database(http: //www.hmdb.ca)检索由该离子组成所推定的物质，判定该峰为二氢生物蝶呤。通过使用二氢生物蝶呤标品进行的研究，确认毛细管电泳的移动时间也是一致的。
[0128]关于m/z= 89.02的峰，使用分析软件Analyst TMQS(Applied b1systems , Inc.)进行组成的推定。根据相对于母峰的同位素的比例、精密质量等信息推定组成，结果，作为候补峰的m/z = 89.02的离子组成为C3H5O3t3使用京都大学制作的KEGG:生命系统信息统和数据库(http://www.kegg.jp/)的代谢数据库，检索由该离子组成所推定的物质，判定该峰为乳酸。通过使用乳酸标品进行的研究，确认毛细管电泳的移动时间也是一致的。
[0129]此外，对于对照组，比较两株细胞，提取差异大的峰。其中，对于m/z = 104.070的峰，在SN-38低感受性的HT-29中，其细胞内水平高，在SN-38高感受性的HCT-116中，其细胞内水平低。此外，将SN-38暴露后随时间的改变绘成图表，显示特征性的改变，由此认为是与SN-38感受性关联的代谢物(图8)。关于该峰，使用分析软件Analyst ? QS(AppliedB1systems, Inc.)进行组成的推定。根据相对于母峰的同位素的比例、精密质量等信息推定组成，结果，作为候补峰的m/z = 104.070的离子组成为C4H1Q02。使用京都大学制作的KEGG:生命系统信息统和数据库(http: //www.kegg.jp/)的代谢数据库，检索由该离子组成所推定的物质，判定该峰为丫 -氨基丁酸(T _aminobutyricacid，GABA)。通过使用GABA标品进行的研究，确认毛细管电泳的移动时间也是一致的。
[0130]关于m/z= 133.06，使用分析软件Analyst TM QS(Applied B1systems，Inc.)进行组成的推定。根据相对于母峰的同位素的比例、精密质量等信息推定组成，结果，作为候补峰的m/z = 133.06的离子组成为C4H9N203。使用京都大学制作的KEGG:生命系统信息统和数据库(http: //www.kegg.jp/)的代谢数据库，检索由该离子组成所推定的物质，判定该峰为天冬酰胺。通过使用天冬酰胺标品进行的研究，确认毛细管电泳的移动时间也是一致的。
[0131]关于m/z= 134.04的峰，使用分析软件Analyst TM QS(Appl ied B1systems ,Inc.)进行组成的推定。根据相对于母峰的同位素的比例、精密质量等信息推定组成，结果，作为候补峰的m/z = 134.04的离子组成为C4H8N04。使用京都大学制作的KEGG:生命系统信息统和数据库(http://www.kegg.jp/)的代谢数据库，检索由该离子组成所推定的物质，判定该峰为天冬氨酸。通过使用天冬氨酸标品进行的研究，确认毛细管电泳的移动时间也是一致的。
[0132]接着，计算天冬酰胺对天冬氨酸的比([天冬酰胺/天冬氨酸])，将SN-38暴露时的[天冬酰胺/天冬氨酸]除以SN-38非暴露时的[天冬酰胺/天冬氨酸]([天冬酰胺/天冬氨酸]sn-38/[天冬酰胺/天冬氨酸]_0。其结果，确认SN-38高感受性的HCT-116中，上述值显著上升。另一方面，确认SN-38低感受性的HT-29中，上述值显著减少(图12)。
[0133]实施例2
[0134](I)方法
[0135](a)使用细胞
[0136]使用8种人大肠癌细胞株(!1(:1'-116、!11'-29、!1(:1'-15、1^^0、1^1741'、5财80、51620、WiDr) οHCT-116、HT-29由株式会社益力多本社获得，Lovo、SW480、WiDr由大日本住友制药株式会社获得，HCT-15、LS174T由东北大学加龄医学研究所医用细胞资源中心获得，SW620由住商医药株式会社获得。
[0137](b)药剂
[0138]SN-38散装粉末从株式会社益力多本社获得。SN-38溶解在DMSO中，以使在各实验中培养基中的DMSO的浓度稀释到0.1 %以下的方式使用。
[0139](c)对SN-38的感受性评价
[0140]对各株细胞，通过MTS assay (Ce I ITi ter96?AQueous One Solut1n Ce 11Proliferat1n Assay，Promega)评价在0]11]101凡?541]101凡的31^-38暴露72小时后的细胞生存率，计算IC5q值(相对于SN-38未处理的孔细胞数抑制50%的浓度)，作为各细胞中的SN-38感受性。实验进行2次，每次3个样品。
[0141](d)细胞内代谢物的采取
[0142]对于稳态的各细胞，除去培养基，在冰上，用5%的甘露醇(4%)清洗细胞后，迅速添加甲醇(4°C，含有内部标准物质)，使酶失活，保存在一80°C。其中，分别准备用于细胞计数的细胞和用于提取代谢物的细胞，进行同样的处理后，进行细胞计数，用于细胞数补正。实验进行2次，每次3个样品。
[0143](e)代谢组样品的制备
[0144]向一80 °C保存的甲醇溶液中加入氯仿和Mi I 1-Q水，进行液_液萃取，除去杂质成分。采取包含代谢物的水-甲醇层，使用分子量筛截5000Da的离心超滤膜进行除蛋白，之后，减压干燥滤液，在一80°C保存。临测定前在Mi I 1-Q水中溶解，供给代谢组测定。
[0145](f)代谢组测定
[0146]细胞内代谢物的网罗式测定由Agilent Technologies公司的毛细管电泳-飞行时间型质量分析仪(CE-TOFMS)进行。在阳离子性代谢物的网罗式测定中，以使毛细管的出口为阴极的方式施加电压，此外，在阴离子性代谢物的网罗式测定中，以使毛细管的出口为阳极的方式施加电压，一齐定量分析m/z = 50?1000的代谢物。
[0147](g)GABA与SN-38感受性的相关分析
[0148]对于通过CE-TOFMS从各细胞样品检测出的表示GABA的峰，对峰面积与各细胞的IC50值(50%细胞增殖抑制浓度)的关系进行相关分析。
[0149](2)结果
[0150](a)8种人大肠癌细胞株的SN-38感受性评价
[0151]各细胞中的IC5q值为0.74 ± 0.23?68.94 ± 6.83nmol/L，确认其感受性具有大幅度(图 13)。
[0152](b)GABA与SN-38感受性的相关分析
[0153]对于通过CE-TOFMS检测出的表示GABA的峰，对峰面积与各细胞的IC5q值的关系进行相关分析，确认尚的正相关(图13)。
[0154]实施例3
[0155](I)方法
[0156]—次次重复进行与实施例2同样的实验，对分别合计3次的实验得到的数据进行详细的分析。对于通过CE-TOFMS从各细胞样品检测出的峰，与m/z和移动时间已知的278个标品数据进行对照，由此识别确认在任一株细胞中检测的146种代谢物。对该146种代谢物，通过简单回归分析研究了8种人大肠癌细胞中的细胞内量与各个的细胞的Log[IC5Q]的关系。
[0157]⑵结果
[0158](a)8种人大肠癌细胞株中的SN-38感受性评价
[0159]8 种人大肠癌细胞株(HCT-116、HT-29、HCT-15、Lovo、LS174T、SW480、SW620、WiDr)的感受性以通过MTS as say计算的IC5Q为指标进行评价。其结果，WiDr的I C5Q( 63.27 土10.95nM)最高，表现出SN-38低感受性。另一方面，LS174T的IC5o(0.71±0.18nM)最低，表现出SN-38高感受性(图14)。
[0160](b)细胞内代谢量和SN-38感受性的关系
[0161]从8种人大肠癌细胞中提取细胞内代谢物，通过CE-TOFMS—齐分析。对于得到的数据，与该研究室所有的278种标品数据进行对照，确认在任一种细胞中的检测，对能够识别的146种代谢物，通过简单回归分析研究8种人大肠癌细胞中的细胞内量与各个的细胞的Log[IC5Q]的关系。其结果，作为细胞内量与L0g[IC5Q]之间确认有关联的代谢物(p<0.01、R22 0.7)，得到1-甲基腺苷、GABA、亚牛磺酸、谷胱甘肽(GSH)、1-甲基烟酰胺(图15)。这些代谢物均在SN-38高感受性细胞中的细胞内水平低，在SN-38低感受性细胞中的细胞内水平高。
[0162]而且，确认了亚牛磺酸、谷胱甘肽、1-甲基烟酰胺这样的谷胱甘肽代谢系统的物质的细胞内量与SN-38感受性之间相关，因此，尝试研究属于谷胱甘肽代谢系统的其他的物质的细胞内水平与SN-38感受性的关系，除了亚牛磺酸、谷胱甘肽、1-甲基烟酰胺外，确认了牛磺酸(R2 = 0.688)、谷胱甘肽二硫化物(GSSG,R2 = 0.634),S-腺苷高半胱氨酸(R2 = 0.496),烟酰胺(1?2 = 0.357)、丫-谷氨酰半胱氨酸(丫-6111气78，1?2 = 0.319)、精胺(1?2 = 0.295)的细胞内代谢物水平与对SN-38感受性之间的关联(图16)。
【主权项】
1.选自在质量分析仪中本体或其片段是作为m/z= 149.05?149.06的阴离子被检测出的分子、作为m/z = 152.99?153.00的阴离子被检测出的分子、作为m/z = 724.34?724.35的阳离子被检测出的分子、谷胱甘肽、亚牛磺酸、1-甲基烟酰胺、牛磺酸、谷胱甘肽二硫化物、S-腺苷高半胱氨酸、烟酰胺、γ-谷氨酰半胱氨酸和精胺中的一种以上的分子作为抗癌剂感受性判定标记，在用于判定大肠癌的抗癌剂感受性的试剂盒的制造中的用途， 其中，所述抗癌剂是伊立替康、SN-38和/或它们的盐。2.一种大肠癌的抗癌剂感受性的判定方法，其特征在于: 测定检测体中的、选自在质量分析仪中本体或其片段是作为m/z = 149.05?149.06的阴离子被检测出的分子、作为m/z = 152.99?153.00的阴离子被检测出的分子、作为m/z =724.34?724.35的阳离子被检测出的分子、谷胱甘肽、亚牛磺酸、1-甲基烟酰胺、牛磺酸、谷胱甘肽二硫化物、S-腺苷高半胱氨酸、烟酰胺、γ-谷氨酰半胱氨酸和精胺中的一种以上的分子， 其中，所述抗癌剂是伊立替康、SN-38和/或它们的盐。3.如权利要求2所述的判定方法，其特征在于: 检测体是来自患有癌的被检验者的机体试样。4.如权利要求2或3所述的判定方法，其特征在于: 检测体是来自被投与了抗癌剂的患有癌的被检验者的机体试样。5.—种用于判定大肠癌的抗癌剂感受性的试剂盒，其特征在于: 其包括用于测定检测体中的、选自在质量分析仪中本体或其片段是作为m/z = 149.05?149.06的阴离子被检测出的分子、作为m/z = 152.99?153.00的阴离子被检测出的分子、作为m/z = 724.34?724.35的阳离子被检测出的分子、谷胱甘肽、亚牛磺酸、1-甲基烟酰胺、牛磺酸、谷胱甘肽二硫化物、S-腺苷高半胱氨酸、烟酰胺、γ -谷氨酰半胱氨酸和精胺中的一种以上的分子的操作说明书， 其中，所述抗癌剂是伊立替康、SN-38和/或它们的盐。6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于: 检测体是来自患有癌的被检验者的机体试样。7.如权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于: 检测体是来自被投与了抗癌剂的患有癌的被检验者的机体试样。8.一种大肠癌的抗癌剂感受性增强剂的筛选方法，其特征在于: 以选自在质量分析仪中本体或其片段是作为m/z = 149.05?149.06的阴离子被检测出的分子、作为m/z = 152.99?153.00的阴离子被检测出的分子、作为m/z = 724.34?724.35的阳离子被检测出的分子、谷胱甘肽、亚牛磺酸、1-甲基烟酰胺、牛磺酸、谷胱甘肽二硫化物、S-腺苷高半胱氨酸、烟酰胺、γ-谷氨酰半胱氨酸和精胺中的一种以上的分子的表达改变作为指标， 其中，所述抗癌剂是伊立替康、SN-38和/或它们的盐。9.一种由权利要求8所述的方法得到的大肠癌的抗癌剂感受性增强剂， 其中，所述抗癌剂是伊立替康、SN-38和/或它们的盐。10.一种癌治疗用组合物，其特征在于: 含有权利要求9所述的大肠癌的抗癌剂感受性增强剂和作为感受性增强对象的抗癌剂的组合， 其中，所述抗癌剂是伊立替康、SN-38和/或它们的盐。11.抗癌剂感受性判定标记的测定试剂在用于判定抗癌剂感受性的试剂盒的制造中的用途， 所述抗癌剂感受性判定标记为选自在质量分析仪中本体或其片段是作为m/z = 149.05?149.06的阴离子被检测出的分子、作为m/z = 152.99?153.00的阴离子被检测出的分子、作为m/z = 724.34?724.35的阳离子被检测出的分子、谷胱甘肽、亚牛磺酸、1-甲基烟酰胺、牛磺酸、谷胱甘肽二硫化物、S-腺苷高半胱氨酸、烟酰胺、γ -谷氨酰半胱氨酸和精胺中的一种以上的分子， 其中，所述抗癌剂是伊立替康、SN-38和/或它们的盐， 作为感受性判定对象的癌是大肠癌。
【文档编号】G01N33/15GK105891317SQ201610344306
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2010年10月29日
【发明人】谷川原祐介, 鈴木哲也, 西牟田章户, 杉本伸二, 五十岚义晃
【申请人】学校法人庆应义塾, 株式会社益力多本社