检测疟原虫感染的方法
【专利摘要】本发明涉及一种识别患有疟原虫感染的受试者的方法。本发明还涉及一种用于监测患有疟原虫感染的受试者的方法，例如，在用抗疟疾化合物治疗之后进行监测。还提供了识别治疗疟原虫感染的化合物的方法。
【专利说明】检测疟原虫感染的方法 发明领域
[0001 ]本发明涉及一种识别患有疱原虫(Plasmodium)感染的受试者的方法。本发明还涉 及一种用于监测患有疟原虫感染的受试者的方法，例如，在用抗疟疾化合物治疗之后进行 监测。还提供了识别治疗疟原虫感染的化合物的方法。
[0002] 发明背景
[0003] 疱原虫属种(Plasmodium spp.)是寄生原生动物，并且由这些生物体导致的人类 感染被称为疟疾。疟疾是一种烈性传染病。全世界每年存在超过3亿病例，并且导致每年大 约6600亿死亡。感染人类的疟原虫属种是通过被感染按蚊的叮咬来传播。恶性疟原虫 (Plasmodium falciparum)引起因疱疾所致的大部分死亡。然而，间日疱原虫（Plasmodium vivax)是世界范围内最普遍的疟原虫属种，并且导致巨大发病率。恶性疟原虫(导致毒力最 强的疟疾)已发展出对当前使用的药物的耐药性。这又导致疟疾的发生率增加，并且导致用 于治疗和预防该疾病的药物较少。疟原虫的其它属种(诸如，诺氏疟原虫(P.knowlesi)和卵 形疟原虫(P.ovale))也可能导致人类的疾病，虽然它们主要感染其它动物。
[0004] 在蚊子食血期间，当被感染按蚊将子孢子注入受试者中时，开始疟疾感染。在注入 之后，寄生虫进入血流，并且作为其生命周期的一部分而经历一系列改变。子孢子行进至肝 脏，在其中它侵袭肝细胞。一个子孢子可产生超过10，〇〇〇个裂殖子，所述裂殖子随后将从肝 细胞中破裂并且侵袭红细胞，但间日疟原虫和卵形疟原虫可在肝脏中保持休眠(休眠体)并 在初始感染数年之后导致复发。在其红细胞内阶段中，裂殖子经历各种形式(环形物、营养 体、裂殖体）以形成平均20个子系裂殖子，所述子系裂殖子被释放至血流中并且感染新红血 细胞(Biamonte等人，2013)。这导致症状性高烧和相关病状。
[0005] 疟疾病通常是通过血涂片的显微镜检查或通过基于抗原的迅速诊断性试验(RDT) 来确认。显微术是最常用于检测疟原虫的方法一 2010年针对疟疾检查了约1.65亿血涂片 (Aregawi等人，2011)。尽管其被广泛使用，但通过显微术进行诊断受到两个主要缺点的困 扰:执行该试验的许多装置(尤其是农村）尚未配备，并且结果的精确度取决于检查血涂片 的人员的技术和寄生虫在血液中的水平。血涂片的灵敏度的范围在最佳条件下为从75%至 90%，到低至50%。市售可用的RDT可能在预测疟疾寄生虫的存在方面比血涂片更为精确， 但它们的诊断灵敏度和特异性根据厂商不同有很大变化，并且不能告知存在多少寄生虫 (Wilson,2012)〇
[0006] 作为当今疟疾防治所面临的最大挑战之一，已出现对抗疟疾药的耐药性。耐药性 已涉及到疟疾向新区域的传播以及在已根除疟疾的区域中再度出现疟疾。在世界上某些地 方，耐药性还在流行病的出现和严重度方面起到显著作用(Bloland，2001)。令人遗憾地，目 前检测耐药性的技术(诸如PCR分析)需要数周来完成。
[0007] 需要提供更快、更廉价且非侵袭性的方式来检测疟原虫感染，尤其是孕妇体内小 孩所存在的低水平感染，以及监测治疗的效力，特别是在面对疟原虫属种的耐药菌株时。还 需要筛选治疗疟原虫感染的化合物的新的方式。
[0008] 发明概述
[0009] 本发明人已识别出可用于识别和监测受试者中的疟原虫感染的新标识物。
[0010] 在一个方面，本发明提供一种用于识别患有疟原虫感染的受试者的方法，所述方 法包括在所述受试者或得自其的样本中检测一种或多种挥发性有机化合物，所述挥发性有 机化合物选自由烯丙基甲基硫化物、1-甲硫基丙烷、（E)-1-甲硫基-1-丙烯和（Z)-1-甲硫 基-1-丙烯组成的组，其中一种或多种挥发性有机化合物的水平指示疟原虫感染。
[0011] 在实施方案中，一种或多种挥发性有机化合物的水平还指示疟原虫感染的状态。
[0012] 在另一方面，本发明提供一种用于监测患有疟原虫感染的受试者的方法，所述方 法包括在所述受试者或得自其的样本中检测一种或多种挥发性有机化合物，所述挥发性有 机化合物选自由烯丙基甲基硫化物、1-甲硫基丙烷、（E)-1-甲硫基-1-丙烯和（Z)-1-甲硫 基-1-丙烯组成的组，其中所述受试者先前已知具有疟原虫感染，并且其中所述一种或多种 挥发性有机化合物的水平指示所述疟原虫感染的状态。
[0013] 可在施用化合物以治疗感染之后对受试者进行监测。这允许确定该治疗是否有 效，以及该受试者是否经历进一步的或变更的治疗和/或监测。
[0014] 本发明人已发现，在施用化合物来治疗感染之后短时间内，一种或多种挥发性有 机化合物的水平在回到正常(健康)水平附近之前有所增加，并且最显著的增加是(z)-i-甲 硫基-1-丙烯。不希望受理论限制，这可能是疟原虫细胞死亡的结果。因此，在实施方案中， 当与治疗之前的水平相比时，在治疗之后，所述一种或多种挥发性有机化合物的水平初始 增加指示所述治疗是有效的。在实施方案中，至少通过检测(z)-i-甲硫基-1-丙烯的水平监 测初始增加。
[0015] 在用于监测患有疟原虫感染的受试者的方法的一个实施方案中，在施用所述治疗 之后0.5至72小时之间，监测受试者的所述初始增加。
[0016] 在用于监测患有疟原虫感染的受试者的方法的另一实施方案中，一种或多种挥发 性有机化合物的水平的降低指示所述治疗已经有效。在实施方案中，至少通过检测(E)-1-甲硫基-1-丙烯的水平，监测对所述感染有效的治疗。
[0017] 在其它实施方案中，一种或多种挥发性有机化合物的水平降低是在一种或多种挥 发性有机化合物的水平初始增加之后。
[0018] 因为一种或多种挥发性有机化合物的水平可用于指示疟原虫感染的状态，这允许 确定用于选择对感染的合适治疗的水平。因此，在另一方面，本发明提供一种选择用于疟原 虫感染的合适治疗的方法，所述方法包括:在受试者或得自其的样本中检测一种或多种挥 发性有机化合物的水平，所述挥发性有机化合物选自由烯丙基甲基硫化物、1-甲硫基丙烷、 (E)-1-甲硫基-1-丙烯和(Z)-1-甲硫基-1-丙烯组成的组；以及基于一种或多种挥发性有机 化合物的水平来选择合适的治疗。
[0019] 合适样本的实例包括但不必限于：呼出气（exhaled breath )、呼吸冷凝物 (condensate breath)、唾液、血液、汗水、皮肤微生物、皮肤挥发性样本和尿。在一个实施方 案中，样本是呼出气。在另一实施方案中，样本是排除了肺泡气的呼出气。
[0020] 在一个实施方案中，本发明的方法还包括将一种或多种挥发性有机化合物的水平 与合适对照物比较。例如，当识别疟原虫感染时，该对照物可能与得自已知不受疟原虫感染 的个体的样本(例如呼出气）的类型相同。在另一实例中，当监测患有疟原虫感染的受试者 时，该对照物可能与得自用治疗感染的化合物进行治疗之前的受试者的样本(例如呼出气） 的类型相同。在一个实例中，受试者的呼出气排除了肺泡气。
[0021] 受试者可以是可能被疟原虫感染的任何物种。在实施方案中，受试者是动物，优选 是哺乳动物。该动物可以是人或非人动物。例如，受试者可以选自鸟类、大鼠、小鼠、灵长类、 非人灵长类(NHP)以及人。在一些实施方案中，动物可以是人源化动物，诸如人源化小鼠或 大鼠。在一个实施方案中，受试者为人。
[0022] 所述一种或多种挥发性有机化合物还可以用在筛选新型抗疟疾化合物的方法中。 因此，在另一方面，本发明提供一种识别治疗疟原虫感染的化合物的方法，所述方法包括： [0023] i)将候选化合物施用于受疟原虫感染的受试者；以及
[0024] ii)针对一种或多种挥发性有机化合物的水平来监测所述受试者或得自其的样 本，所述挥发性有机化合物选自由烯丙基甲基硫化物、1-甲硫基丙烷、（E)-1-甲硫基-1-丙 烯和(Z)-1-甲硫基-1-丙烯组成的组；
[0025] 其中在步骤i)之后，所述一种或多种挥发性有机化合物的水平的初始增加，和/或 所述一种或多种挥发性有机化合物的水平的降低，指示所述化合物可用于治疗疟原虫感 染。
[0026] 在上述方面的一个实施方案中，该受试者是实验室动物，所述实验室动物是疟疾 的模式生物体。此类模式生物体是本领域已知的，并且包括转基因的人源化小鼠和大鼠。
[0027] 此外，所述一种或多种挥发性有机化合物还可以用于识别对抗疟原虫化合物已发 展出耐药性的疟原虫的菌株。因此，在其它方面，本发明提供一种识别对抗疟原虫化合物已 发展出耐药性的疟原虫的菌株的方法，该方法包括
[0028] i)将所述抗疟原虫化合物施用于受疟原虫菌株感染的受试者，以及
[0029] ii)针对一种或多种挥发性有机化合物的水平来监测所述受试者或得自其的样 本，所述挥发性有机化合物选自由烯丙基甲基硫化物、1-甲硫基丙烷、（E)-1-甲硫基-1-丙 烯和(z)-i-甲硫基-1-丙烯组成的组，
[0030] 其中在步骤i)之后，所述一种或多种挥发性有机化合物的水平缺乏显著改变指示 该疟原虫菌株具有对抗疟原虫化合物的耐药性。
[0031 ]在两个上述方面的实施方案中，该方法包括确定一种或多种挥发性有机化合物在 步骤i)之前的水平，以及将这些水平与步骤i)之后获得的那些水平相比较。
[0032] 在两个上述方面的另一实施方案中，该方法还包括在步骤i)之前：
[0033] 1)获得未受疟原虫感染的受试者，并且在该受试者或得自其的样本中确定所述一 种或多种挥发性有机化合物的水平，以及
[0034] 2)用疟原虫或疟原虫菌株感染该受试者，并且在被感染的受试者或得自其的样本 中确定所述一种或多种挥发性有机化合物的水平。
[0035] 在实施方案中，该方法包括将来自步骤1)和/或2)的一种或多种挥发性有机化合 物的水平与施用候选化合物或抗疟原虫化合物之后的所述一种或多种挥发性有机化合物 的水平相比较。
[0036] 在其它实施方案中，该方法包括确定一种或多种挥发性有机化合物在步骤1)和2) 以及ii)的一个或多个之间的水平的倍数差异。
[0037] 本发明人还已识别出哪个可被认为是可用于本发明方法的二级挥发性有机化合 物。因此，在其它实施方案中，本发明的方法还包括确定一种或多种额外的挥发性有机化合 物的水平，所述额外的挥发性有机化合物选自由二氧化碳、异戊二烯、丙酮、苯和环己酮组 成的组。
[0038] 或类似通过本领域已知的任何技术可检测/监测一种或多种挥发性有机化合物。 实例包括但不限于以下中的一种或多种:气相色谱质谱学(GCMS)、液相色谱质谱学(LCMS)、 电子鼻装置、生物传感器、基于抗体的检测系统、比色测定、近红外(NIR)、选择离子流动管 质谱学(SIFT)和质子转移反应质谱学(PTR-MS)。在一个实例中，或类似使用气相色谱质谱 学(GCMS)或电子鼻装置来检测/监测一种或多种挥发性有机化合物。
[0039] 所述一种或多种挥发性有机化合物可被用作试剂来识别可用于本发明方法的化 合物(其可以呈组成物的形式），例如用作传感器化合物（sensor compound)。因此，在其它 方面，本发明提供一种筛选用于识别患有疟原虫感染的受试者的化合物的方法，该方法包 括：
[0040] i)使候选化合物与挥发性有机化合物接触，所述挥发性有机化合物选自由烯丙基 甲基硫化物、1-甲硫基丙烷、（E)-1-甲硫基-1-丙烯和(Z)-1-甲硫基-1-丙烯组成的组，以及
[0041] ii)确定所述化合物是否与所述挥发性有机化合物结合或反应，
[0042] 其中与挥发性有机化合物结合或反应的化合物可被用在用于识别和/或监测患有 疟原虫感染的受试者的本发明方法中，和/或用在选择合适治疗的本发明方法中。
[0043] 候选化合物可能是任何类型的化合物，诸如低碳基分子或蛋白质。在实施方案中， 该蛋白质是抗体或受体，诸如G蛋白偶联受体。在另一实施方案中，该候选化合物是固态传 感器组成物。例如，该候选化合物是掺杂和无掺杂金属氧化物传感器。
[0044] 本发明人已识别出适合于检测烯丙基甲基硫化物的存在的传感器化合物。在一个 实施方案中，候选化合物是选自二氧化锡(Sn0 2)和三氧化钨(W03)的金属氧化物传感器，其 中该氧化物传感器任选地掺杂有金属，所述金属选自由钯(Pd)、铂(Pt)、银(Ag)、铜(Cu)、或 其组合(诸如铂银化合物(PtAg))组成的组。在一个实施方案中，该候选化合物是掺杂有银 的二氧化锡(掺杂有Ag的Sn0 2)。
[0045] 对2种、3种或4种挥发性有机化合物的检测可以（例如)是烯丙基甲基硫化物、1-甲 硫基丙烷、（E)-1-甲硫基-1-丙烯和(Z)-1-甲硫基-1-丙烯的任何组合。
[0046] -个实施方案涉及对(Z)-1-甲硫基-1-丙烯、（E)-1-甲硫基-1-丙烯、1-甲硫基丙 烷和烯丙基甲基硫化物的检测。另一实施方案涉及对(Z)-1-甲硫基-1-丙烯、（E)-1-甲硫 基-1-丙烯和1-甲硫基丙烷的检测。另一实施方案涉及对(Z)-1-甲硫基-1-丙烯和(E)-1-甲 硫基-1-丙烯的检测。
[0047] 疟原虫可以是其实例包括但不必限于以下的任何属种:恶性疟原虫、诺氏疟原虫、 间日疱原虫、卵形疱原虫curtisi亚种（Plasmodium ovale curtisi)、卵形疱原虫 wallikeri亚种（Plasmodium ovale wallikeri)或三日症原虫（Plasmodium malariae) 〇在 实施方案中，该疟原虫是恶性疟原虫或间日疟原虫。
[0048] 在其它实施方案中，如果疟原虫是间日疟原虫，则本发明的方法至少包括检测 (z)-i-甲硫基-1-丙烯的水平。
[0049] 除非另外明确陈述，否则本文任何实施方案都应被视为向任何其它实施方案施加 必要的变更。
[0050] 本发明在范围上不受限于本文所述的具体实施方案，所述实施方案仅意图用于例 示性目的。功能上等效的产物、组合物以及方法明显在如本文所描述的本发明的范围内。
[0051] 在本说明书中，除非另外明确陈述或上下文另外要求，否则提及单个步骤、物质的 组合物、步骤的组或物质组合物的组应视为涵盖那些步骤、物质组合物、步骤的组或物质组 合物的组中的一个和多个(即一个或多个）。
[0052] 在下文中，本发明是借助于以下非限制性实施例且参照附图加以描述。
[0053] 附图简述
[0054]图1-从志愿者收集呼吸的照片。
[0055] 图2-使用电动栗(c)将呼吸挥发物从呼吸袋(a)转移至吸附管(b)的照片。
[0056] 图3-环境空气收集系统的照片。
[0057]图4-通过直接从呼吸袋（2)对喘出气取样来由电子鼻（1)进行直接呼吸分析的照 片。
[0058]图5-将具有疟疾生物标记的加标呼吸制备为患者模拟器的示意图，所述患者模拟 器包括健康呼吸袋（1)、微量栗(2)、两颈圆底长颈烧瓶(3)、加标点(4)、"加标呼吸"袋(5)和 热板加热器(6)。
[0059] 图6-1组的单一离子(m/z 88)GCMS色谱，示出分析时间的第一个6分钟。在基准日 (第〇天(a))收集的样本的色谱，当志愿者被疟疾感染时(第4天(b))收集的样本的色谱，注 入抗疟疾药之后不久(第7天-PM(c))收集的样本的色谱，和在恢复时(第28天，（d))收集的 样本的色谱。
[0060] 图7-2组的单一离子(m/z 88)GCMS色谱，示出分析时间的第一个6分钟，分别是在 基准日（第0天(a))，当志愿者被疟疾感染时(第4天(b))，注入抗疟疾药不久之后(第7天-PM (c) )收集的样本，和在恢复时(第28天(d))收集的样本。
[0061] 图8-1组的PCA得分图，其基于4种硫醚(烯丙基甲基硫化物、1-甲硫基丙烷、（E)-1-甲硫基-1-丙烯和(Z)-1-甲硫基-1-丙烯)和在基准日（第0天）（BL)(a)、在疟疾感染期间(第 7天-AM)(If)(b)、在抗疟疾药施用之后(第7天-PM)(药物）（c)、在恢复期(第28天）（Rec)(d) 收集的呼吸样本的GC-MS数据（峰下面积）；以及1组的图8a至图8d的PCA得分图的覆盖图 (e) 〇
[0062] 图9-使用峰下面积计算的各化合物在呼吸收集的不同日间的1组的箱线图。箱线 图对应于（自上而下）：（Z)-1_甲硫基-1-丙烯、（E)-1-甲硫基-1-丙烯、1-甲硫基丙烷以及烯 丙基甲基硫化物。在各箱线上，中央标记是中值，该箱线的边缘是第25和第75百分位，须线 延伸至认为不是离群值的最极端数据点，并且单独绘出离群值。在各箱线图之上示出的P值 对应于AN0VA试验，并且拒绝的无效假设在于所有样本(来自不同收集日）是抽取自具有相 同平均值的群体。
[0063] 图10-1组针对(Z)-1-甲硫基-1-丙烯的多重比较试验表明，在第7天-pm，药物治疗 之后6.5小时，存在显著较高水平的化合物(无重叠区间）。
[0064] 图11-1组的PCA得分图，其基于4种硫醚(烯丙基甲基硫化物、1-甲硫基丙烷、（E)-1-甲硫基-1-丙烯和(Z)-1-甲硫基-1-丙烯)和在基准日（第0天）（BL)(a)、在疟疾感染期间 (第7天-AM)(If)(b)、在抗疟疾药施用之后(第7天-PM)(药物）（c)、在恢复期(第28天）（Rec) (d) 收集的呼吸样本的GC-MS数据(峰下面积）；以及2组的图11a至图lid的PCA得分图的覆盖 图(e)。
[0065] 图12-2组的箱线图对应于（自上而下）：（Z)-1_甲硫基-1-丙烯、（E)-1-甲硫基-1-丙烯、1-甲硫基丙烷以及烯丙基甲基硫化物。在各箱线上，中央标记是中值，该箱线的边缘 是第25和第75百分位，多个须延伸至认为不是离群值的最极端数据点，并且个别地绘出离 群值。在各箱线图之上示出的P值对应于AN0VA试验，并且拒绝的无效假设在于所有样本(来 自不同收集日）是抽取自具有相同平均值的群体。
[0066] 图13-2组针对(Z)-1-甲硫基-1-丙烯的多重比较试验表明，在第8天-pm，药物治疗 之后6.5小时，存在显著较高水平的化合物(无重叠区间）。
[0067] 图14-对在疟疾研究不同阶段处收集的呼吸样本诊断电子鼻响应。
[0068]图15-针对对照呼吸样本和具有烯丙基甲基硫化物的加标呼吸样本（lOppb)这两 种类别的平均分类向量的平均配对距离(average pairwise distances)。各片表示诊断电 子鼻的特征，并且示出针对各虚拟传感器的两种样本之间的差异。
[0069] 图16-使用诊断电子鼻传感器编号2314所得的箱线图，其对应于在时间步长6及热 回路10处的传感器1 (掺杂Ag的Sn02)。
[0070] 图17-使用诊断电子鼻传感器编号2314所得的多重比较试验，其对应于在时间步 长6及热回路10处的传感器1 (掺杂Ag的Sn02)。
[0071] 图18-(a)针对2组中收集的不同环境空气样本在硫醚:烯丙基甲基硫化物、(E)-1-甲硫基-1-丙烯和(Z)-1-甲硫基-1-丙烯）区域内的单一离子(m/z 88)GCMS色谱。未能观察 到峰，表明它们不存在于环境空气样本中（或处于非可检测水平）。(13)针对不同环境空气样 本在1-甲硫基-1-丙烯的区域内的单一离子(m/z 90)GCMS色谱。
[0072] 图19-示出分析时间的第一个5分钟的单一离子(m/z 88)色谱。在抗疟疾药注射和 呼吸加标了烯丙基甲基硫化物（lOppb)(烯丙基甲基硫化物约RT 3.75*)之后6.5小时收集 的呼吸样本的色谱的覆盖图。
[0073]图20-在疟疾过程中针对两个组的呼吸中挥发物与血液中寄生虫水平。组中各参 加者在第0天被接种约1，800个静脉内施用的有活力的恶性疟原虫感染的人类红细胞。在疟 疾过程中收集呼吸和血液样本。1组在第7天开始药物治疗(n = 7,左图），并且2组在第8天开 始(n = 6,右图），通过图中虚竖线所示。寄生虫血症的生长和清除是通过蓝色圆圈表示，并 且化合物的丰度是通过正方形表示:烯丙基甲基硫化物(m/z 88)、（E)-1-甲硫基-1-丙烯 (m/z 88)、（Z)-1_甲硫基-1-丙稀(m/z 88)和 1-甲硫基-丙烷(m/z 90)。
[0074]图21-在对两个组进行治疗之前a)和之后b)，寄生虫水平与疟疾挥发物的丰度的 相关性。在1组中，快速作用合成臭氧化物药物是在第7天使用，并且2组中，哌喹是在第8天 施用。
[0075]图22-在疟疾间日疟原虫感染过程中，在人类志愿者中，RBC中寄生虫血症的生长 和清除，以及烯丙基甲基硫化物(m/z 88)、（E)-1-甲硫基-1-丙烯(m/z 88)、（Z)-1-甲硫基-1-丙稀(m/z 88)和1-甲硫基-丙烷(m/z 90)的呼吸丰度。
[0076]发明详述 [0077 ] 通用技术和选定的定义
[0078]除非另外明确定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都应视为具有与由本领 域(例如在细胞培养、寄生虫学、疟疾检测、分子遗传学、挥发性化合物检测方法、免疫学、免 疫组织化学、蛋白质化学和生物化学中）普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。
[0079] 术语"和/或"，例如"X和/或Y"应理解为意指"X和Y"或"X或Y"，且将用以对于两种 含义或对于任一含义提供明确的支持。
[0080] 在整篇本说明书中，用词"包含(comprise)"或变化形式(如"包含(comprises)"或 "包含(comprising)"）应理解为暗示包括所述要素、整数或步骤、或成组要素、整数或步骤， 而非排除任何其它要素、整数或步骤、或成组要素、整数或步骤。
[0081] 如本文所用，术语"识别患有疟原虫感染的受试者"还指诊断该感染。例如，该方法 可用于辨别疟疾发热与非疟疾发热，因为疟疾的症状可能类似于许多不同传染性疾病或其 它病的那些症状，所述疾病或病包括病毒性疾病，诸如感冒或流感、蜱叮咬所致疾病(立克 次氏体）、胃部感染(肠胃炎）、肝脏的炎症(肝炎）、细菌导致的严重发热(伤寒）、脑或脊髓的 细菌感染或炎症(细菌性脑膜炎）、寄生虫导致的其它感染。
[0082] 如本文所用，术语"监测患有疟原虫感染的受试者"是指经过一段时间，诸如数小 时、数日、数周或数月，观察该感染。如本文概述，在施用化合物以图治疗该疾病之后，可监 测受试者。
[0083] 如本文所用，术语"指示该状态"是指受试者的疾病负担水平。这尤其与受试者是 否经历针对疟原虫感染的治疗，或何时决定对感染的合适治疗有关。如本文所述，V0C水平 的初始增加表明治疗正在起作用，而水平到达健康受试者中所见的类似水平则表明该治疗 已有效，或者可能治愈所有疟原虫属。此外，本发明人已发现，除初始治疗之后的短期波动 以外，所定义V0C(尤其烯丙基甲基硫化物）的水平指示受试者中疟原虫的总数。因此，术语 "指示该状态"还指受试者中疟原虫(寄生虫)的总数。
[0084] 术语"挥发性有机化合物"，也可缩写为"V0C"，是指在普通室温条件下具有高蒸气 压的有机化学品。因此，应理解单个"挥发性有机化合物"可以缩写成V0CJ0C的高蒸气压由 低沸点引起，其导致大量分子从化合物的液体形式或固体形式蒸发或升华成气态。
[0085]如本领域中理解的，与1-甲硫基-1-丙烯有关的"E"和"Z"的使用是用于描述1-甲 硫基-1-丙烯中双键的几何异构、或立体化学的注释。
[0086] 如本领域中理解的，使用术语"硫(su 1 f ur) "和"硫化物（su 1 f i de) "时可能也分别 是指"硫(sulphur)" 和"硫化物(sulphide)"。
[0087]如本文所用，术语"步骤i)之后，一种或多种挥发性有机化合物的水平的初始增 加，和/或一种或多种挥发性有机化合物的水平的降低，指示该化合物可用于治疗疟原虫感 染"意指取决于受试者或样本在用候选化合物治疗之后何时被分析，如果化合物具有抗疟 疾效应，则可以观察到一种或多种V0C的较高或较低水平（与施用该化合物之前的水平相 比）。如本文所述，一般在施用有效治疗(尤其是快速作用药物)之后不久观察到初始增加， 然后降低至与施用该化合物之前相比更低的量。如果监测该受试者，则可观察到有规律地 增加，随后减少（降低）。然而，有可能（例如）在单个时间点（例如从施用化合物起30日）监 测，以确定治疗是否已具有任何效果。
[0088]如本文所用，术语"一种或多种挥发性有机化合物的水平缺乏显著改变"意指一种 或多种挥发性有机化合物的水平未变化至足够程度来表明治疗已有效，或者即便观察到初 始增加，但一种或多种挥发性有机化合物的水平恢复至与治疗之前几乎相同。例如，显著改 变的缺乏可能是（例如）当与治疗之前相比时，在治疗之后，所述水平少于+/-20%，或少于 +/ _10 % 〇
[0089] 如本文所用，术语"治疗（treating/treat/treatment)"包括施用治疗有效量的化 合物来试图减小受试者中疟原虫感染(诸如疟疾)的严重度或者消除至少一种症状，诸如例 如，衰竭、意识损害、呼吸窘迫(酸中毒呼吸）、胃肠疾病（恶心、呕吐、腹泻）、多重惊厥、循环 性虚脱、肺水肿(放射性）、异常出血、黄疸、神经病学疾病(眩晕、紊乱、定向力障碍、昏迷）、 头痛、背痛、肌痛、寒战、咳嗽和/或血红素尿。此类术语还涵盖寄生负载的降低和/或抑制复 制和/或寄生虫在被治疗受试者中传播的减少。
[0090]题
[0091]该样本可能是得自已知或被确定具有一种或多种挥发性有机化合物的受试者的 任何材料。
[0092]在一个实施方案中，样品是气态。或者，该样本可以是从诸如来自身体来源的固体 或液体样本(诸如来自身体的组织或流体)收集的挥发性有机化合物。该样本可包括来自受 试者的体液或固体物质。来自受试者的合适样本的实例包括但不必限于:呼出气、呼吸冷凝 物、唾液、血液、汗水、皮肤微生物、皮肤挥发性样本和尿。在一个实施方案中，样本是呼出 气。在另一实施方案中，样本是其中已排除了肺泡气的呼出气。
[0093]样本收集的一个示范性实施方案示于图1中，其中从疑似疟原虫感染的受试者中 收集呼出气。使用如图2所示电动栗可将呼出气挥发物从呼吸袋转移至吸附管，或可以直接 使用呼吸袋。
[0094] 在某些实施方案中，在气相中检测到一种或多种挥发性有机化合物。样本本身可 能是气相，例如是来自个体的呼出气，或该气体可以与固体或液体样本混合或产生自固体 或液体样本，所述样本诸如是在培养物或培养基中生长的样本。
[0095] 在其它实施方案中，可在样本的液相或固相中检测到一种或多种挥发性有机化合 物。
[0096] 在一个实施方案中，可以直接从受试者中检测到一种或多种V0C，例如，疑似具有 或已知具有疟原虫感染的人的呼出气可以被直接地呼出至检测或诊断设备中。
[0097] 在另一实施方案中，可将样本(诸如皮肤拭子或尿样本)放置于容器中，并且使用 在容器内（诸如在容器的盖子的内侧上)的合适传感器来检测V0C。
[0098] 该样本立即针对挥发性有机化合物进行分析，或存储在适宜条件下以便稍后分 析。
[0099]可在检测一种或多种V0C之前，将样本预先浓缩。预先浓缩步骤包括技术人员已知 的各种不同程序，诸如对吸附管、固相微萃取(SPME)、或低温浓缩的使用。
[0100] 吸附管通常由玻璃构成并且含有各种类型的固体吸附剂材料(吸附剂）。通常使用 的吸附剂包括活性炭、硅胶和组织多孔聚合物，诸如Tenax和Amberlite XAD树脂。吸附管可 以附接至电动栗。用流速ml/min校准的栗通过该吸附管抽取预定体积的气态样本。在该转 移或取样周期期间，V0C被捕集在吸附剂材料上。
[0101] 使用SPME技术来收集低浓度的V0C以用于分析。SPME是在实验室中和现场使用的 样本制备技术。SPME涉及使用涂布有提取相的纤维，所述提取相可以是液体(聚合物)或固 体(吸附剂），其从不同种类的培养基中提取不同种类的分析物(包括挥发物和非挥发物）， 并且可以是液相、固相或气相。由该纤维提取的分析物的数量与其在样本中的浓度成比例， 只要在对流或搅动帮助下达到平衡，或假设短时预平衡。提取之后，将SPME纤维转移至单独 仪器(诸如气相色谱仪)的注射口，其中发生对分析物的解吸并且进行分析。SPME的吸引力 在于，该提取是快速且简单的，并且可通常在无溶剂情况下完成，并且检测限对某些化合物 可达到兆分率(ppt)水平。SPME还具有现场应用的巨大潜力;现场取样甚至可由非科学工作 者完成，而无需在各个位置具有气相色谱-质谱分析法设备。
[0102]低温浓缩是一种允许回收V0C以便再使用的工艺。冷凝过程需要极低温度，以便 V0C可被浓缩。当前，在低温(少于-160°C冷凝过程中使用液氮。
[0103] 挥发性有机化合物和疟原虫感染
[0104] 如技术人员将理解，生物系统随许多因素而高度变化，诸如年龄、性别、遗传因素、 一般健康、感染水平、感染阶段、感染历史等等，所有都潜在地影响生物标记在个体中的水 平。类似地，疟原虫的属种还可能相关，因为已知的是，间日疟原虫和卵形疟原虫在其血液 阶段循环中比恶性疟原虫更慢，所以间日疟原虫和卵形疟原虫可能花费不同时间来释放挥 发性有机化合物。
[0105] 此外，疟疾感染直至症状显现的时间(潜伏期)一般在以下范围：
[0106] ?恶性疟原虫，9至14天，
[0107] ?间日疟原虫和卵形疟原虫，12至18天，
[0108] ?三日疟原虫，18至40天，和
[0109] ?诺氏疟原虫，11至12天。
[0110] 此外，传统上与疟疾相关的发作或周期性发热发生在红细胞破裂之前不久或红细 胞破裂时。感染三日疟原虫导致每72小时发作(三日疟）。感染卵形疟原虫或间日疟原虫导 致每48小时发作的间日疟。恶性疟原虫往往产生无规律发热高峰，叠加有每48小时发作的 稽留热或间日疟。因此，取决于感染的阶段，V0C的水平可能变化。具体而言，如果有可能该 受试者只是最近感染，则可能必需例如在9至40天时间内重复该方法，以双重核查阴性结 果。
[0111] 本发明人已示出了疟原虫感染与挥发性有机化合物烯丙基甲基硫化物、1-甲硫基 丙烷、(E)-1-甲硫基-1-丙烯和(Z)-1-甲硫基-1-丙烯水平之间的明确相关性。
[0112] 本发明人已示出，烯丙基甲基硫化物的水平与对疟原虫感染的存在的检测具有最 强相关性。
[0113] 本发明的方法可以各种方式执行。例如，可使用定义水平来作为疟原虫感染的指 标，诸如烯丙基甲基硫化物在呼出气样本中大于15兆分率(ppt)。在另一实施方案中，可将 V0C在试验受试者中的水平与来自已知不具有疟原虫感染的对照受试者的相同类型样本中 的水平相比较，并且来自指示疟原虫感染的试验受试者的样本中的水平更高（例如至少两 倍的更高水平）。在实施方案中，来自一个或多个对照样品的数据可以存储为参考收集数 据。
[0114] 本发明人还已示出，在针对疟原虫感染治疗该受试者之后，在恢复至无疟原虫感 染的受试者的水平，或接近该水平之前，这些V0C的水平通常增加。不仅因为如上所述因素， 而且因为所述治疗，初始增加的时间将在一定程度上变化。例如，缓慢作用治疗可能意指与 使用更快作用治疗的情况相比，"初始"增加发生在治疗之后更晚时。如技术人员将理解，对 患者的有规律监测将确保检测到"初始增加"。在实施方案中，初始增加发生在施用所述治 疗之后约0.5小时与约7天之间，或约0.5小时与约5天之间，或约0.5小时与约3天之间，或约 0.5小时与约24小时之间，或约0.5小时与约12小时之间，或约0.5小时与约8小时之间。
[0115] 此外，本发明人已示出，（Z)-1-甲硫基-1-丙烯的水平与施用化合物来治疗该感染 之后的初始增加具有最强相关性。因此，在与本文所述疟原虫感染相关的V0C中，（Z)-1-甲 硫基-1-丙稀是治疗效力（即，杀死寄生虫的治疗能力）的最佳标识物。
[0116] 在实施方案中，当使用快速作用治疗时，观察到初始增加。快速作用抗疟疾药物的 实例包括氯喹、奎宁、甲氟喹、阿托瓦醌(atovaquone)和青蒿素，而缓慢作用抗疟疾药物的 实例包括氯胍、乙胺嘧啶、硫酰胺和四环素。可使用Le Manach等人(2013)描述的方法(诸如 少于1.5的IC50速度测定)来识别快速作用药物。
[0117] 另外，本发明人已示出，（E)-1-甲硫基-1-丙烯的水平与感染的有效治疗具有最强 相关性，并由此是用于确定治疗之后寄生虫清除（即，治疗结束之后寄生虫负载降低或完全 不存在)的动力学的最佳标识物。
[0118] 在另一实施方案，一种或多种挥发性有机化合物的水平可以指示寄生虫的生命周 期阶段和寄生负载。例如，当前数据表明，硫醚水平可能与环形物、营养体、裂殖体和裂殖子 循环中的特定时期有关联。虽然发明人取样方案不具有精确定义该关联性的分辨率，但从 极大寄生虫血症180°相移以及在药物治疗之后不久发生的硫醚的峰值表明，红细胞的胀裂 (裂殖体破裂)而释放裂殖子并感染新红血细胞可能是触发最大硫醚释放的事件。
[0119] 基于本文提供的实验数据，技术人员可容易地执行常规试验以确定V0C的水平，或 一种或多种V0C的组合，所述水平指示疟原虫感染。在一个实施方案中，例如在呼出气样本 中检测到大于15兆分率(ppt)的烯丙基甲基硫化物指示疟原虫感染。在另一实例中，例如在 呼出气样本中至少300ppt烯丙基甲基硫化物的水平指示所述治疗正在生效。
[0120]在实施方案中，尤其当监测患有疟原虫感染的受试者或识别化合物以治疗疟原虫 感染时，该方法可以比较一种或多种V0C的倍数改变。例如，当识别化合物来治疗疟原虫感 染时，可以确定和比较V0C在以下中的一个或多个之间的倍数改变:i)感染之前的受试者或 来自其的样本;ii)感染之后且药物施用之前的受试者或来自其的样本;iii)在施用候选化 合物之后的各种阶段(时间）。
[0121] 因为一种或多种挥发性有机化合物的水平可用于指示疟原虫感染的状态，这允许 确定用于选择对感染的合适治疗的水平。如技术人员将明白的，
[0122] 1)当寄生虫血症为〈1 %时，可以口服方式治疗轻症疟疾，
[0123] 2 )当认为疱疾很严重时，通常给予静脉内治疗（www .cdc.gov/malaria/ diagnosis_treatment/clinicians3 .html)。重症症疾的WHO标准为>10，000个寄生虫/yl 〇 一旦寄生虫密度为〈1%时，患者可以采取口服法，以及
[0124] 3)当寄生虫血症为10%时，考虑换血疗法(Hanscheild，1999)。
[0125] 在用于实施例中描述研究的诱发血液阶段疟疾（IBSM)规程中，出于伦理原因，允 许的极大寄生虫血症水平为仅0.001 %。因此，尚未确定用于选择合适治疗的V0C的精确水 平和寄生虫负载。虽然如此，发明人已示出V0C的水平与寄生虫负载之间的明确相关性，且 由此，可以容易地使用很简单且常规的程序，按照本公开，确定出允许准确确定哪个V0C水 平是与小于〈1 %寄生虫血症（由此选择口服治疗)相关、与1 %至少于10%寄生虫血症（由此 选择静脉内治疗)相关以及与10%或更大寄生虫血症（由此选择输血)相关的合适数据。对 稀丙基甲基硫化物的估计可能是约300ppt的值将对应于约0.001 %寄生虫血症，由此，在这 种情况下将推荐口服干预。
[0126] 獅
[0127] 或类似可通过本领域已知的任何技术来检测/监测一种或多种挥发性有机化合 物。实例包括但不限于诸如以下的光谱学中的一种或多种:质谱学(MS)(诸如气相色谱质谱 学(GCMS)、液相色谱质谱学(LCMS)和质子转移反应质谱学(PTR-MS))，离子迀移光谱学，场 非对称离子迀移光谱学，差分迀移光谱学(DMS);电子鼻装置;生物传感器;基于抗体的检测 系统；比色测定；红外光谱学（IR光谱学）（诸如近红外（NIR)、选择离子流动管质谱学 (SIFT)、傅里叶变换-红外线(FTIR)光谱学和衰荡腔光谱学）；燃料电池电极;光吸收光谱 学;纳米粒技术;柔性平板波(FPW)传感器;电化学传感器;光声设备;基于激光的设备;各种 电离技术和驯养动物检测或其组合。在一个实例中，或类似使用气相色谱质谱学(GCMS)、电 子鼻装置或生物传感器来检测/监测一种或多种挥发性有机化合物。
[0128] 质谱学通过使分子电离来工作，以产生带电分子或分子片段，并且测量它们的质 荷比。检测技术的质谱学组件包括四极杆、飞行时间、串联质谱学、离子回旋共振、和/或扇 形(磁性和/或静电性）。
[0129] 可以与色谱分离技术串联来使用质谱学。例如，GCMS是一种将气相色谱和质谱学 的特征组合来识别化合物的分析法。类似地，液相色谱质谱学(LCMS)是一种将液相色谱和 质谱学的特征组合来识别化合物的分析法。这些技术的色谱分离组件依靠混合物中不同分 子的化学性质的差异，并且当样本行进通过柱体时，允许分子分离。各分子具有特征性停留 时间，其中所述分子在设定条件下穿过柱体。这允许所述技术的质谱仪组件分别地俘获、电 离、加速、偏斜并且检测电离化分子、或分子片段。
[0130] 质子转移反应质谱学(PTR-MS)是用于在线监测挥发性有机化合物(V0C)的极灵敏 技术。PTR-MS仪器由离子源组成，所述离子源直接连接至漂移管和质谱仪。
[0131] 离子迀移光谱学（IMS)是一种分析技术，其用于基于电离化分子在载体缓冲气体 中的迀移来分离和识别气相中的电离化分子。该技术可以与质谱学和/或色谱分离技术联 合。例如，离子迀移光谱学-质谱学(MS-MS)是这样的技术，其中离子在被引入质谱仪之前， 在施加电势梯度下穿过某中性气体，根据漂移时间而首先分离。漂移时间是相对于离子的 电荷来对半径的度量。頂S的工作循环比大多数质谱技术更久，从而使得质谱仪可以沿IMS 分离的过程取样。这以类似于LC/MS的方式产生关于IMS分离和离子质荷比的数据。頂S的工 作循环相对于液相色谱或气相色谱分离而言很短，并且可因此联合此类技术，产生三重模 式，诸如 LC/1MS/MS。
[0132] 差分迀移光谱学离子是通过高和低电场下迀移之间的差异来区分，因为事实上离 子迀移值取决于施加的场强度。该方法易于使用，灵敏，快速，并且相对有选择性。
[0133] FTIR是用于获得固体、液体或气体的吸收、发射、光电导性或拉曼散射的红外光谱 的技术。任何吸收光谱法的目标是测量样本在多大程度上吸收各波长下的光。这样做的一 种方法是在样本上照耀单色光束，测量多少光被吸收，并且针对各个不同波长进行重复。傅 里叶转换谱是获得相同信息的不那么直观的方式。不在样本上照耀单色束的光，这种技术 同时照耀含有许多频率的光的光束，并且测量所述光束中多少被样本吸收。接下来，改变该 光束以含有频率的不同组合，从而提供第二数据点。将该过程重复多次。然后，电脑取得所 有这些数据，并且逆操作以推断各波长下吸收的是什么。
[0134] 选择的离子流动管质谱学（SIFT-MS)是用于痕量气体分析的定量质谱学技术，其 涉及在定义明确的时间周期期间，沿着流动管，通过所选正前体离子来对痕量挥发性化合 物的化学电离。
[0135] 衰荡腔光谱学是红外光谱学的另一变型，其对痕量水平的气体特别地灵敏，并且 可能尤其适合于使用请求保护的化合物来在呼吸中诊断疟疾。
[0136] 电子鼻(还称为电子鼻(E-nose))是检测气味的装置。该技术可能还称为"电子感 测"或"e_感测"。电子鼻包括3种主要部件:样本输送系统、检测系统、计算系统。样本输送系 统允许生成样本的顶部空间（挥发性化合物），其为被分析级分。该系统随后将该顶部空间 注入电子鼻的检测系统中。由传感器装置组成的检测系统是所述仪器的"反应性"部件。当 与挥发性化合物接触时，传感器反应，其意指它们经历电气性质的改变。在大多数电子鼻 中，各传感器对所有挥发性分子灵敏，但各传感器以其特定方式工作。然而，在生物电子鼻 中，使用对特定气味分子作出响应的蛋白质。大多数电子鼻使用传感器阵列，其在接触时与 挥发性有机化合物反应，和/或挥发性有机化合物在传感器表面上的吸附导致传感器的物 理变化。通过使信号变换成为数值的电子接口来记录特定响应。记录资料随后基于统计学 模式来计算。
[0137] 用于电子鼻的传感器包括金属氧化物半导体(M0SFET)、金属氧化物传感器(M0X)、 导电聚合物、聚合物复合物、石英晶体微量天平、表面声波(SAW)。
[0138] 在金属氧化物半导体(M0SFET)装置中，将晶体管用于扩大或切换电子信号。此举 工作的原理在于，进入传感器区域的分子主动或被动带电，产生M0SFET信号的改变，该改变 随后通过模式识别计算机系统来解读。因此，各个可检测分子具有其自己的独特信号。
[0139] 金属氧化物半导体(M0X)传感器使用沉积在Si-微电机基板(微传感器)上的基于 金属氧化物的感测厚膜。该基板含有：电极，其测量感测层的电阻;和加热器，其将感测层加 热到200°C至400°C。传感器用感测层电阻的改变来对环境大气的组成物的改变作出响应。
[0140] 导电聚合物是导电的有机聚合物。聚合物复合物在使用上类似于导电聚合物，但 由不导电聚合物添加诸如炭黑的导电材料来配制。
[0141]石英晶体微量天平是通过测量石英晶体谐振器的频率的改变来测量单位面积质 量的一种方式。单位面积质量可存储在数据库中并且用于将来参考。
[0142] 表面声波(SAW)是一类微型机电系统(MEMS )，其依靠对表面声波的调制来感测物 理现象。
[0143] 纳米粒传感器具有独特的物理、化学和生物学性质以及功能活性。纳米粒大小与 形状与表面面积和量子效应有关。降低纳米粒的大小导致事实上与内部含量相比，显著更 大比例的原子(纳米粒的组分)是在表面上。
[0144] 生物传感器具有含物理化学检测器的生物学组件。因此，含生物学组件的电子鼻 是一种生物传感器。生物传感器通常由生物识别组件、生物转导器组件和电子系统组成，所 述电子系统包括信号放大器、处理器和显示器。
[0145] 生物学组件可以是例如细胞或蛋白质。合适蛋白质的实例包括但不限于:抗体或 其片段，其结合本文定义的V0C;或受体，诸如G偶联蛋白受体（GPCR)(例如嗅觉或味觉 GPCR)，其结合本文定义的V0C。在实施方案中，蛋白质用可检测标签标记。例如，G偶联蛋白 受体可用RET对标记，从而使得当V0C结合GPCR时，RET供体分子(诸如生物发光蛋白）相对于 RET受体分子的空间位置和/或偶极取向被改变（参见，例如，WO 2004/057333和WO 2010/ 085844)。在替代性实施方案中，该蛋白质为抗体或其片段，并且通过使用如本领域已知的 标记的二级药剂(例如二级抗体)来检测该抗体或其片段的结合。
[0146] 可能适合于在本发明方法中使用的生物传感器的实例描述在W0 2013/155553中。
[0147] 如技术人员将了解，结合本文定义的V0C的抗体或其片段还可以用于各式各样的 不同标准检测系统中，诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)或免疫组织化学着色。
[0148] 在实施方案中，使用诸如W0 2013/155553中所述的微流体来执行方法。
[0149] 在实施方案中，生物传感器可能涉及如澳大利亚临时专利申请2014904612中所述 的螯合金属离子。
[0150] 在某些实施方案中，使用即时(point-of-care)诊断设备来识别一种或多种V0C。 优选地，即时诊断工具为便携式，并且可以在探测的下限程度上检测V0C。
[0151] 抗疟原虫化合物
[0152] 抗疟原虫化合物也可称为抗疟疾化合物或抗疟疾药。
[0153] 抗疟原虫化合物是用于治疗和/或预防疟原虫感染的化合物。术语"抗疟原虫化合 物"还可指用于治疗和/或预防疟原虫感染的化合物的组合(即，组合疗法）。
[0154] 抗疟原虫化合物的实例包括但不限于：蒿甲醚-苯芴醇、蒿甲醚、阿莫地喹、青蒿 素、青蒿酯、克林霉素、氯喹、强力霉素、二氢青蒿素、甲氟喹、naphroquine、氯胍、哌喹、伯氨 喹啉、咯萘啶、奎宁、磺胺多辛-乙胺嘧啶、四环素、0Z439、及其组合。如本文所述，患有疟原 虫感染的受试者可用诸如上述那些的抗疟原虫药施用，并且使用本发明的方法监测以确定 治疗成功。
[0155] 治疗未成功，例如，通过在治疗之前和之后一种或多种或所有V0C的水平相似(例 如+/-20%或+/-10%)来确定的，可能指示受试者受治疗抗性的疟原虫菌株感染(并由此， 应该施加替代性治疗），或所用治疗的活性组分已被折损（超过有效期限和/或未恰当存 储），或不存在足够浓度或完全缺乏(抗疱疾药物伪造是严重的问题一参见Karunamoorthi， 2014)。
[0156] 如本文所述，V0C的水平可用于决定用于被感染受试者的大多数恰当治疗。
[0157] 在筛选新抗疟疾化合物的背景下，所谓"候选化合物"意指用于治疗或预防疟原虫 感染(诸如治疗疟疾）的待评估药剂。候选化合物(可能也称为药物候选物)包括正经历药物 发现过程的化合物。候选化合物可以包括(例如)小分子、肽或其模拟物、多肽、抗体、核酸分 子诸如适配体、肽核酸分子及其组分、组合和衍生物。
[0158] 候选化合物可在人类和非人类中进行评价。非人类(诸如小鼠或大鼠）可以是转基 因的。
[0159] McCarthy等人（2011)描述了一种用于评价治疗恶性疱原虫感染的新药候选物的 效力的研究。该研究证明了 19位试验志愿者的安全性，以及在13位可评估志愿者中所述药 物之间寄生虫血症的清除动力学的显著差异，其中蒿甲醚-苯芴醇(A/L)的平均寄生虫降低 比率为759,并且阿托瓦醌-氯胍(A/P)为17(分别地，95%CI 120-4786和7-40$，0.01)。本 发明的方法可与例如McCarthy等人所述那些一起使用来识别新型抗疟原虫化合物。
[0160]人源化小鼠已被开发来用于识别新型抗疟疾药化合物(参见，例如，Vaughan等人， 2012)。本发明的方法可与例如Vaughan等人(2012)所述那些一起使用来识别新型抗疱原虫 化合物。
[0161] US
[0162] 本发明可用于筛选用于识别患有疟原虫感染的受试者的化合物。此类化合物可以 与本文定义的V0C结合或反应。因此，在筛选用于识别患有疟原虫感染的受试者的化合物的 背景下，所谓"候选化合物"意指用于识别或监测疟原虫感染的方法中的待评估药剂。候选 化合物可以包括(例如)小分子、肽或其模拟物、多肽、抗体、核酸分子诸如适配体、肽核酸分 子及其组分和衍生物。在一个实施方案中，候选化合物是固态传感器组成物。例如，该固态 传感器组成物可以是掺杂和无掺杂的金属氧化物传感器。在一个实施方案中，固态传感器 组成物是选自二氧化锡(Sn0 2)和三氧化钨(W03)的金属氧化物传感器，其中该氧化物传感器 任选地掺杂有金属，所述金属选自由钯(Pd)、铂(Pt)、银(Ag)、铜(Cu)、或其组合(诸如铂银 化合物(PtAg))组成的组。在一个实施方案中，该传感器组成物是掺杂有银的二氧化锡(掺 杂有Ag的Sn0 2)。
[0163] 如技术人员将了解的，存在各式各样的可适合于筛选与本文定义的V0C结合或反 应的化合物的不同筛选程序。实例包括但不限于:受体蛋白（诸如GPCR)文库筛选、表面等离 子体共振、高分辨率NMR、噬菌体显示、亲和色谱法、等温滴定量热学（ITC)、免疫沉淀法和与 质谱学联合的GST沉降技术(GST pull downs)。
[0164]在一个实施方案中，使用高通量筛选法，其涉及提供含有大量候选化合物的文库。 此类文库随后在一种或多种测定中被筛选，以识别显示所需的特征性结合或活性的那些文 库成员（具体的化学物种或子类）。
[0165] 高通量筛选系统是市售可用的，并且通常使全部程序自动化，包括所有样本和试 剂移液、液体分配、定时孵育、适合于该测定的检测器中的微板的最终读数。这些可配置系 统提供高通量并且迅速启动以及高度的灵活性和定制性。此类系统的制造商提供用于各种 高通量系统的详细规程。
[0166] 表面等离子体共振(SPR)或生物分子相互作用分析(BIA;例如，Biacore)实时检测 生物特异相互作用，而不对任何相互作用物加标记。BIA芯片的结合表面处的质量改变(指 示结合事件)导致该表面附近的光的折射率变化。折射性的变化产生可检测信号，其作为生 物分子之间的实时反应的指示来加以测量。
[0167] 在一个实施方案中，该筛选法包括使烯丙基甲基硫化物、1-甲硫基丙烷、（E)-1-甲 硫基-1-丙烯和（z)-i-甲硫基-1-丙烯中的一种或多种与细胞（诸如酵母细胞）中表达的 GPCR的文库（例如，味觉GPCR或嗅觉GPCR，或其组合，来自线虫或昆虫的GPCR)接触，并且识 别结合一种V0C的特异性受体。此类酵母细胞将通常包括基因工程化的报告系统以检测受 体结合（参见，例如，Fukutani等人，2012;与Dowell和Brown，1999)。 实施例
[0168] 实施例1-材料和方法
[0169] 受控制的人类疟疾感染
[0170] 该研究经医疗研究人类研究伦理委员会昆士兰研究所(Queensland Institute of Medical Research Human Research Ethics Committee)(QIMR_HREC)批准，并且由 CSIR0动物、食品和健康科学人类研究伦理委员会（CSIR0 Animal,Food and Health Sciences Human Research Ethics Committee)资助(计划编号：13/03)。
[0171]该研究是控制性研究，使用血液阶段恶性疟原虫(BSPC)接种体攻毒来表征两种抗 疟疾药物针对早期恶性疟原虫血液阶段感染的效力。将呼吸挥发物的研究"加入"该抗疟疾 效力研究。使用不同抗疟疾药物，在两个组（1组n = 8,并且2组n = 7)中进行该研究。1组中研 究的抗疟疾药物是0Z439,并且2组中所用药物是哌喹。0Z439,作为青蒿素(artemisin)衍生 物，迅速被吸收，迅速起作用，并且在身体内寿命短。哌喹被缓慢吸收并且在身体内具有长 半衰期哌喹从60年代到80年代被广泛用作抗疟疾药，但已发展出耐药性并且不再受欢迎。 然而，其现在作为与青蒿素的组合疗法来试验，以平衡其短期活性。
[0172] 组中各参加者在第0天被接种约1，800个有活力的恶性疟原虫-静脉内施用来感染 人类红细胞。基于门诊患者，从第3天，每日（AM)或早上(AM)和傍晚（PM)监测参加者，直至 PCR针对疟疾寄生虫的存在，针对不良事件和疟疾的症状、迹象或寄生虫学证据的意外早期 发作为阳性。
[0173] 如通过qPCR结果确定，在指定开始治疗的当天(通常第7/8天AM)，容许参加者进入 研究单位并限制行动以便安全监测和抗疟疾药物施用，并且监测寄生虫负载和药物水平。 治疗开始的阈值是当PCR定量被证实为2 1，000个寄生虫/mL。如果存在疟疾的临床特征或 寄生虫学证据，或在第7天(AM)上午之前检测到2 1，000个寄生虫/mL的PCR定量，指定的治 疗在这时候开始(表1和2)。
[0174] 在用抗疱疾药治疗之后，参加者作为住院患者被追踪至少48小时，以确保治疗和 临床响应的容许偏差，随后，如果基于门诊患者，经由PCR，针对安全性和疟疾寄生虫的连续 存在临床上良好。在第24/25天开始用Riamet? (活性成分为蒿甲醚和苯芴醇)强制开始治 疗。如果在抗疟疾治疗之后观察到弱响应或快速响应，可进行早期干预。完成此举以确保患 者安全。表3归纳1组和2组的疟疾研究的事件。
[0175] 表1:针对用抗疟疾药物0Z439治疗的1组，呼吸收集的日期（如勾号指示）。呼吸收 集是在基准日（第0天AM)，在疟疾感染之后和在施用抗疟疾药之前(第0天PM-第7天AM)，在 施用抗疟疾药物之后(第7天PM-第9天PM)和在恢复期(第28天AM)。
[0177]表2:针对用抗疟疾药物哌喹治疗的2组，呼吸收集的日期(如勾号指示）。呼吸收集 是在基准日（第0天AM)，在疟疾感染之后和在施用抗疟疾药之前(第0天PM-第8天AM)，在施 用抗疟疾药物之后(第8天PM-第10天PM)和在恢复期(第29天AM)。
[0180] 呼出气收集
[0181] 要求志愿者正常呼吸，并且在几秒钟后志愿者被要求使用"ha"呼气呼出少量，暂 停，然后连续呼出，只要他们可以舒适地执行。为了呼吸收集，要求志愿者重复所述"ha"并 且在暂停期间在嘴唇间放入硬纸板。要求志愿者通过呼出来完成向袋内呼气，只要他们可 以舒适地进行。一旦他们结束呼出，则他们关闭阀门（d)(图1)。未使用鼻夹，也未使用V0C过 滤器。
[0182] 表3:1组和2组中疟疾研究的事件归纳。
[0184] 通过溶剂管吸附
[0185] 使用含有200mg TenaxTA和200mg Sulficarb(Markes International Limited， UK)的双层吸附管。将管暴露于1L呼吸样本。用于将呼吸挥发物转移到该管的方法是通过使 用在5分钟内将呼吸样本从袋中抽取并且穿过该管的电动栗来进行（图2)。将管存储在冷藏 箱中4°C下，直至进一步分析。将含有小体积呼吸气的袋子保持在低温室中，并且带冰寄回 Canberra,Aus tra1i a 〇
[0186] 环境空气样本
[0187] 收集环境空气的方法如下:针对2组，空袋（用于呼吸收集的相同类型的袋)经由其 一个阀门连接至吸附管，然后将吸附管连接至电动栗。将袋的两个阀门打开，以允许环境空 气被栗抽取来穿过该袋和吸附管。栗的流速为200ml/min，并且环境空气收集5分钟。发明人 使用袋来收集环境空气以提供用于呼吸样本的"背景"条件。
[0188] 针对1组，发明人使用与上文相似的方法来收集环境空气，但无袋，替代地，栗直接 连接至吸附管。
[0189] 通过气相色谱-质谱分析法进行呼出气分析
[0190]呼吸样本的GC-MS分析使用吸附管，在280°C下经过热处理来解除吸附10分钟 (Unity2，Markes International，UK)，并且转移至冷讲（用Tenax TA和Unicarb填充），保持 在30°C并且随后加热到300°C以使谱带增宽最小化。施加冷阱之后的分流比为6:1。气相色 谱仪（Bruker 451Model GC，Bruker Daltonik Inc.，USA)，其使用GC毛细管柱ZB-5MS (Phenomenex Australia Pty Ltd.)，使用长度 30m，内径 0.25mm 和薄膜厚度 0.25_ 以及以 下温度程序:初始温度35°C，5分钟，并且保持5分钟，以5°C/分钟升高至250°C。最终温度为 250°C保持2分钟。该分析的总运行时间为50分钟。氦载气的流速为0.8ml/min。
[0191] 单个四极杆质谱检测器(Scion SQ，Bruker Daltonik Inc.，USA)设置有全扫描检 测(扫描时间=250ms )，在正极性下覆盖从35至350m/z的离子质量范围。
[0192]在针对2组的样本的GCMS分析期间，离子源被污染并且仪器灵敏度降低。因此，组 间的绝对定量比较被认为是无效的，并且针对各组分别地进行数据分析。结果表明检测到 挥发性有机化合物的相同一般模式。 _3] 通过电子鼻进行呼出气分析
[0194] 仅针对1组:通过电子鼻的直接呼吸分析是通过直接从袋中取样喘出气来进行分 析(图4)。针对各样本，在40ml mirT1的流速下分析200ml的呼吸。
[0195] DiagNose(C_it，The如1:1161'1311(18)电子鼻由7个11型氧化物传感器(掺杂和无掺杂 Sn02和W03)组成;一种传感器类型是一式三份存在，三种传感器类型是一式两份，并且其它 三种类型为单个传感器，得到总计12个传感器的阵列（表4)。连续地调整传感器阵列温度。 以20秒的周期产生温度波形，并且在所述周期期间收集32个数据点。总分析时间是5分钟。 虚拟传感器的总数为一个循环内传感器数目X时间步长X热回路的组合，8卩，12 X 15 X 32 等于5760个虚拟传感器。各时间步长代表20秒的分析。流速为400ml mirT1的仪器空气被用 作载气。各呼吸分析之后，该装置用仪器空气净化大约35分钟以允许基准恢复。 _6] 用疟疾生物标记加标的呼吸
[0197] 纯呼吸用不同浓度的烯丙基甲基硫化物加标。纯呼吸如上所述那样收集。在该情 况下，单个样本代表三种呼吸呼气(总计大约6L的呼吸）。
[0198] 表4:DiagNose中的传感器类型。
[0200] 注意：除GC-MS分析以外，并非所有袋均含有足够呼吸来执行电子鼻分析。样本大 小在n = 3至7之间。
[0201] 发明人称之为患者模拟器的装备示于图5中。含有2L健康呼吸的袋（1)被连接至微 量栗（2)(SP 100EC，Schwarzer Precision)。微量栗的出口附接至两颈圆底长颈烧瓶(3)的 侧颈中。该烧瓶的直颈被用作加标点（4)，并且同时，作为将加标/抽吸的呼吸转移至名为 "加标呼吸"的袋(5)的途径。为确保烧瓶的底部达到至少250°C，将烧瓶放置入具有微粒并 且用热板加热器(6) (Haines Educational，Australia)加热的床中。当达到烧瓶的所需温 度时，在加标点(4)，用气密注射器(SGE Analytical Science，Pty Ltd.，Australia)注入3 yl烯丙基甲基硫化物。立即蒸发化合物。不久之后，流速为180ml/min的栗（2)将纯呼吸（1) 和疟疾生物标记一起转移至"加标呼吸"袋(5)。当初始健康呼吸袋清空时，停止所述栗。"加 标呼吸"袋中的最终烯丙基甲基硫化物浓度为330ppm。通过将300ml的浓缩加标呼吸注入填 充有2L纯呼吸的二级袋中以达到43ppm的浓度来制备稀释物。在新的个别袋中制备其它稀 释物，以达到10ppm、500ppb和lOppb的三种最终加标浓度水平。使用这种方式来构建校准曲 线，以估计呼吸中挥发性有机化合物的绝对浓度。
[0202] 总计，为每个浓度(纯、10ppb、500ppb、10ppm)制备三个重复。对于每个样本，将1L 体积的纯呼吸或加标呼吸转移至吸附管中以用于GC-MS分析。对于电子鼻分析，直接从袋中 分析样本。
[0203] 化学品
[0204] 来自Sigma-Aldrich(Belgium)的稀丙基甲基硫化物以及1-甲硫基-丙烷是购自 ABCR GmbH&Co(Karlsruhe，Germany)。（E)-l_甲硫基-1-丙稀和（Z)-l_甲硫基-1-丙稀由 Advanced Molecular Technologies Pty Ltd(Melbourne，Australia)合成。
[0205] 统计分析
[0206] 使用提供于MATLAB本身和MATLAB STATISTICS TOOLBOX中的标准程序，在MATLAB (MathWorks，Natick MA)中执行统计数据分析。使用UscramblerX(版本10? 2，CAM0软件）来 进行主要组分分析。
[0207] 描述性水平
[0208] 使用箱线图来评估抗疟疾药物治疗之前和之后的差异。应用单向AN0VA，并且该函 数比较所述样本的平均值，并且针对所有样本抽取自相同群体的无效假设而得出P值。并且 为进一步评价挥发物的丰度是否与抗疟疾治疗之前或之后显著不同，我们使用多重比较试 验（Bonferroni校正）〇
[0209]多元分析
[0210] 主要组分分析(PCA)被用作降维技术，并且观察组的不同阶段之间是否存在差异。 借助于投射至PCA子空间中，进行数据简化。使确定添加个别挥发物是否可以一致地鉴别样 本的进一步多元统计分析经受MAN0VA (MATLAB中Statistical Toolbox的工具）。
[0211] 电子鼻中的特征选择
[0212] 用于确定响应疟疾生物标记的最佳传感器的数据是在10PPb的上文所述的呼吸加 标数据(2类)与Oppb的对照呼吸（1类)之间的响应差异。用于传感器选择的方法是Q_(F)值。 所谓特征F，我们意指从得自电子鼻的测量值的高维向量中求出的单个实值测量值。
[0213] 在预测一组样本的类别时，针对任何特征F的质量，具有Q的传感器定义质量指标q (F)：
[0214] 通过所考虑类别的样本间F的平均值的距离除以每个类别中个别样本的标准偏差 的乘积之商，计算q。在两个类别情况下，例如对照物(1类)和感染样本(2类），这等于：
[0216] 其中]ii(F)表不1类样本的所有F值的平均值，U2(F)Error!Reference source not found.为2类样本的平均值，并且cn(F)和〇2(F)为对应标准偏差。该测量的动机在于q(F)很 大，无论何时所考虑类别中F的平均值在各类别之间相异很大时，所述类别内F值的散布(标 准偏差)都很小。在该情形下，F是用于区分所讨论类别的良好特征。另一方面，如果不同类 别中F值的平均值(几乎)相同，或所述类别中每者内F的值的散布很大，则q为(接近于)零。 在那种情况下，F并非用于区分所述类别的良好特征。通常q值在区间[0，~]内，并且值至少 大于1，指示F可以用于分类。
[0217] 对于该研究，q值高于5的传感器被认为是所述两个类别的最具信息量的传感器和 潜在鉴别器。
[0218] 分类
[0219] 两种常见分类器(支持向量机和k_最近邻算法)经训练来分类样本，使用〃留一法〃 交叉验证结果(Wang等人，2014):
[0220] (1)支持向量机(SVM) (Cortes和Vapnik，1995)构造出超平面来将训练数据分离入 不同类别中。我们使用C-SVC(成本参数C的SVM分类)使用libsvm文库(Lin，2011)来执行该 分类。使用两种类型的SVM:使用高斯径向基核函数的线性和非线性SVM。高斯径向基核函数 是Error!Reference source not found.，其中Error!Reference source not found?是样 本i的数据的向量，并且y是核宽度。发明人选择y，使用特征数目的倒数(libsvm中的缺省 Y值），因为先前研究表明这提供最佳的分类性能(Wang等人，2014)。发明人发现，对于该数 据集，径向SVM比线性SVM执行得更好，因此我们在这里使用径向SVM且C = 256来报告分类结 果。
[0221] (2)k_最近邻(kNN)算法通过计算距离度量来比较输入数据与现有的一组训练数 据(Russell和Norvig，1995)。输入数据的邻近值为具有最小距离度量的k数据点。输入数据 的类别被确定为在邻域中具有最多数据点的输入数据类别。发明人针对1^={1，3,5,7}测试 邻域大小。k的最大值设定为7,因为在该数据集中每个类别存在至多7个样本，所以在可出 现于任何测试数据的邻域中的训练数据中，相同类别将有至多7个样本。发明人在这里报道 k=l的结果，因为不同k值之间不存在显著差异。
[0222] 交叉验证
[0223] 发明人用数据集执行两种类型的交叉验证。针对每个个别试验，发明人执行一对 全部（留一法)交叉验证。也就是说，针对每个试验的全部数据集被分割成训练集(N-1个数 据样本)和测试集(剩余1个数据样本)的N个对，其中N为数据集的大小。该过程重复N次以覆 盖集中的所有数据。分类器使用训练集来训练，并然后应用于测试集。
[0224] 除一对全部交叉验证以外，发明人使用来自所述组中一者的数据来训练分类器， 并且对剩余组上的数据进行测试。为了该测试，使用分析的每日空白样本（即，空吸附管的 分析)来归一化该数据，因为GC-MS灵敏度在两个组之间有所变化。
[0225] 恶性疟原虫寄生虫血症的PCR定量
[0226] 修改其它地方所述的共有的疟原虫属RT-PCR方法(McCarthy等人，2013)，以利用 TaqMan水解探针化学。该PCR测定被设计成扩增多拷贝的保守的199个-碱基对(bp)靶标以 及高度保守的18S核糖体RNA基因。从500yL浓集红细胞中定量寄生虫。在研究期间每个样本 一式两份地测试。研究完成之后，所有样本一式三份再测试。当变异系数变化>20%时，再测 试样本。
[0227] 来自细胞培养物的挥发物收集。
[0228] 使用用于呼吸收集的相同类型吸附管，执行顶部空间收集。修改烧瓶口，以便吸附 管可连接。所述管一端连接至管，并且另一末端连接至电动栗（图3S)，将200ml顶部空间以 200ml mirT1转移至所述管。该系统未气密封闭，所以在收集顶部空间的同时，存在稀释效果 (来自环境的空气也进入该系统）；进行此举以允许收集用于GC-MS分析的足够体积。管在4 °C下存储，直至分析。在分析的时候还收集环境空气样本以检测目标化合物是否不来自环 境。
[0229]实施例2-患有疟原虫感染的患者中水平增加的挥发性有机化合物
[0230] 使用气相色谱-质谱分析法，观察到存在9种在疟疾感染之后和抗疟疾药物注射之 后有改变的化合物(表5)。
[0231] 4种硫化合物，烯丙基甲基硫化物、1-甲硫基丙烷、（E)-1-甲硫基-1-丙烯和(Z)-1-甲硫基-1-丙烯具有极相似的模式，而表5中列出的其它化合物具有各种模式。虽然所有9种 挥发物都表现出变化，但分析集中在4种硫衍生的VOC，因为（1)在某些志愿者中，这些化合 物在第〇天时不存在或水平不可检测，以及(2)所述化合物似乎作为整体移动，表明其生化 路径中一些可能的连接。
[0232] 三种硫化合物烯丙基甲基硫化物、（E)-1-甲硫基-1-丙烯和(Z)-1-甲硫基-1-丙烯 的色谱以及其在该组过程中的变化被示于图6和图7(分别是1组和2组）。
[0233] 实施例3-统计分析
[0234] 组群 1
[0235] 多元分析
[0236] 为了可视化在疟疾感染和药物施用之后的变化，对所有个体和所有4种硫醚（图8a 至8e)执行PCA。为了使图清晰明了，仅在PCA中使用来自第0天（图8a)、第7天AM(图8b)、第7 天PM(图8c)和第28天（图8d)的样本。可注意到，所述阶段间存在明确区别，并且V0C提供疟 疾感染之后呼吸中存在变化的证据（图8e)。
[0237] 表5:用于半定量的呼吸中疟疾生物标记、停留时间和特征性质荷比。
[0239] 描述性水平
[0240]使用峰下面积计算各化合物在呼吸收集的不同日的箱线图（图9) AN0VA测试表明 化合物在呼吸收集日（疟疾阶段)间的丰度平均值存在显著差异。具体而言，第7天-PM，即抗 疟疾药物之后约6.5小时收集的样本，示出最高的浓度增加。
[0241] 呼吸组成物中最显著变化是由（Z)-1-甲硫基-1-丙烯示出（图9)。针对(Z)-1-甲硫 基-1-丙烯的多重比较测试(图10)表明，在第7天-PM(即，抗疟疾药施用之后6.5小时收集的 样本)存在显著更高水平的化合物(无重叠区间）。
[0242] 多元方差分析(MAN0VA)
[0243] 使用所有4种呼吸疟疾生物标记(烯丙基甲基硫化物、1-甲硫基丙烷、（Z)-1-甲硫 基-1-丙烯和(E)-1-甲硫基-1-丙烯），使在第0天AM和第7天PM收集的样本经受MAN0VA，随 后，每次移除一种化合物，并且再执行MAN0VA来寻查差异是否仍显著。结果表明，即便在仅 两种化合物的情况下(表6)，差异也很显著，提供最大差异的化合物为(Z)-1-甲硫基-1-丙 稀。
[0244]表6:用于执行MANOVA的化合物(变量）以及该测试对1组的显著性。用于分析的数 据来自第〇天AM和第7天PM。
[0246] 组群 2
[0247] 在2组中，收集了来自7位个体的呼吸样本，然而，一位个体被从数据分析中排除， 因为该个体不能执行"ha'呼气以排除肺泡气，这影响总色谱图（样本的稀释效果=肺泡气+ 肺气）。下文所示数据分析因此来自6位个体。
[0248] 多元分析
[0249] 为了使在疟疾感染和药物注射之后的变化可视化，针对所有个体和针对所有4种 硫醚(烯丙基甲基硫化物、1-甲硫基丙烷、（Z)-1-甲硫基-1-丙烯和(E)-1-甲硫基-1-丙烯） (图11a至9e)执行主组分分析(PCA)。为了图清晰明了，仅在PCA中使用了基准日（第0天） (BL)(图11a)、疟疾感染期间（第6天）（If)(图11b)、抗疟疾药施用之后(第8天-PM)(药物） (图11c)和恢复期（第29天）（Rec)(图lid)的样本。可注意到，所述阶段间存在明确区别，并 且V0C提供疟疾感染之后呼吸中存在变化的证据（图11 e)。
[0250] 描述性水平
[0251] 在呼吸收集的不同日间的各化合物的箱线图（图12) jNOVA测试表明化合物在呼 吸收集日（疟疾阶段)间的丰度平均值存在显著差异。具体而言，第8天-PM，即抗疟疾药物之 后约6.5小时收集的样本，示出最高的浓度增加。
[0252] 呼吸组成物中最显著变化是由（Z)-1-甲硫基-1-丙烯示出（图12)。针对(Z)-1-甲 硫基-1-丙烯的多重比较测试（图13)表明，在第7天PM(即，抗疟疾药施用之后6.5小时收集 的样本)存在显著更高水平的化合物(无重叠区间）。
[0253] 多元方差分析(MANOVA)
[0254] 使用所有4种呼吸疟疾生物标记，使在第0天和第8天PM收集的样本经受MANOVA，随 后，每次移除一种化合物，并且再执行MANOVA来寻查差异是否仍显著。结果表明，即便在仅 两种化合物的情况下(表7)，差异也很显著，提供最大差异的化合物为(Z)-l_甲硫基-1-丙 稀。
[0255] 在1组和2组两者中，可在药物施用6.5小时内检测到药物的效果。
[0256] 表7:用于执行MANOVA的挥发性有机化合物(变量）以及该测试对2组的显著性。用 于该分析的数据来自第〇天和第8天-pm。
[0258] 实施例4-通过电子鼻(DiagNose)来检测挥发性有机化合物
[0259] 本发明人还示出，电子鼻可用于检测所述V0C。本发明人还示出，电子鼻可鉴别含 有较高水平的这些化合物的呼吸与具有较低水平、或零水平的这些化合物的呼吸。与GC-MS 分析相反，样本直接从袋中分析。
[0260]本发明人发现，在呼吸收集的每一天观察到V0C的不同模式（图14)。例如，当与基 准日和疟疾感染期间相比时，施用抗疟疾药之后的日子出现较高传感器响应。
[0261] 发明人使用Q值来选择对烯丙基甲基硫化物最灵敏的传感器，（图15)并且该方法 提供5760个传感器中的118个能在呼吸样本中鉴别烯丙基甲基硫化物的虚拟传感器(表8)。 图15中可见，具有最大距离的区域是在图的右上角，其对应于传感器1(掺杂Ag的Sn0 2)。
[0262] 表8:能够鉴别对照呼吸与具有稀丙基甲基硫化物的加标呼吸的最佳虚拟传感器。
[0264] 箱线图（图16)是针对在呼吸收集的不同日间的传感器编号2314(具有最大距离的 传感器hANOVA测试表明传感器在呼吸收集日（疟疾阶段)间的响应存在显著差异。特别地， 第0天显著地不同于药物治疗之后收集的样本。
[0265] 传感器2314的多重比较测试（图17)确认在第8天和第9天(AM和PM)存在显著更高 的传感器响应(无重叠区间）。
[0266] 实施例5-挥发性有机化合物的水平
[0267] 抗疟疾药注射之后6.5小时收集的呼吸样本的GCMS光谱的覆盖图以及针对加标呼 吸样本的校准曲线（图19)确认在约RT 3.75下的V0C是烯丙基甲基硫化物。
[0268] 通过使用得自校准曲线的线性方程，计算2组(表9)的烯丙基甲基硫化物(AMS)的 绝对浓度。使用的方程如下：
[0269] Y = 3E-07x
[0270] 其中x是峰下面积，并且y是以ppb计的计算浓度。表9中计算的值是仅当制备标准 的浓度不很接近分析物在未知物中的期待浓度时的近似值。
[0271 ]表9:烯丙基甲基硫化物在来自2组的呼吸样本中的近似绝对浓度。
[0273] *在第29天存在离群值，并且该数据点退出计算。
[0274] 检测到>15ppt的AMS则指示疟疾感染，并且高于300ppt的尖峰表明治疗成功。
[0275] 表10和表11示出最高倍数变化、第X天/第0天曲线下面积比率(其中（X =不等于0 的一天），针对各挥发性有机化合物(烯丙基甲基硫化物、1-甲硫基丙烷、（z)-i-甲硫基-1-丙烯和(E)-1-甲硫基-1-丙烯)和各组之间，样本是在药物施用之后6.5小时收集(加粗）。存 在一个例外，针对1组中的化合物AMS，最高变化是在第4天。
[0276] 表10:1组挥发性有机化合物的倍数变化。
[0278]发明人预期，该倍数变化值可能在现场取得的疟疾患者中更高，其中寄生虫血症 将在0.1%至10%之间。本样本收集自先导物诱发的血液阶段恶性疟原虫感染，其中志愿者 受低剂量感染并且感染限于〇. 001 %寄生虫血症，
[0279] 在第28天/第29天观察到倍数变化升高，这可能是因为样本收集之前4日刚进行了 Riamet (抢救药物)治疗。
[0280] 实施例6-鉴别诊断
[0281] 硫化物化合物是体外普遍细菌代谢物(例如二甲基硫化物）。为了排除所识别V0C 是感染的一般指标并且对疟疾不具有选择性的可能性，本发明人重新检查医院急诊部提供 的细菌性诱发发热的患者的呼吸色谱。他们发现烯丙基甲基硫化物、1-甲硫基丙烷、（z)-i-甲硫基-1-丙烯和(E)-1-甲硫基-1-丙烯的各者的水平极低，并且在发热和对照组中相同。 这些热病非疟疾患者中的微生物被识别为大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)、大芬戈尔德菌（Finegoldia magna)、白色念珠菌（Candida albicans)、无乳链球菌（Streptococcus agalactiae)、酿胺链球菌（Streptococcus pyogenes)〇
[0282] 表11:2组挥发性有机化合物的倍数变化。
[0284] ZMP=(Z)-1_甲硫基-1-丙烯，AMS =烯丙基甲基硫化物，MP=1_甲硫基丙烷，EMP = (E)-l_甲硫基-1-丙稀
[0285] 应该注意到，为上述试验取自患有细菌感染的患者的呼吸体积是用于疟疾试验 (1L)的一半体积(0.5L)，但即使药物治疗之后峰的强度值得注意，人们仍可坚信即便在所 分析呼吸的体积较低的情况下，那些硫醚大体上不存在。
[0286] 这些结果表明，对选自烯丙基甲基硫化物、1-甲硫基丙烷、（Z)-1-甲硫基-1-丙烯 和(E)-1-甲硫基-1-丙烯的V0C中的一种或多种的水平的检测可用于识别作为感染原因的 疟疾。烯丙基甲基硫化物还已知由于大蒜食用而产生。发明人考虑化合物的水平的饮食来 源可能对疟疾诊断造成困惑。发明人所进行的测试的结果表明，即便在食用高大蒜含量的 膳食之后，呼吸上的烯丙基甲基硫化物的水平比临床试验志愿者中观察到的那些低得多。
[0287] 环境空气的GCMS分析表明来自临床的房间空气中所述硫醚(Z)-1-甲硫基-1-丙 烯、烯丙基甲基硫化物和(E)-1-甲硫基-1-丙烯无显著峰（图18a)，指示环境空气样本中不 存在(可检测水平的)这些V0C。对1-甲硫基丙烷(图18b)获得类似结果。
[0288] 实施例7-呼吸中挥发物与寄生虫水平相关
[0289] 莖里
[0290] 发明人研究硫醚水平和寄生虫血症水平之间的关系。治疗之前，存在硫醚(特别是 烯丙基甲基硫化物和(E)-甲硫基-1-丙烯）的水平与寄生虫血症的水平这两者周期性改变 的证据（图20)。在两种情况下，该周期似乎大约48小时，虽然取样方案不允许任何更大分辨 率，并且被强加于寄生虫血症的一般上升趋势(如PCR确定）以及硫醚的水平。硫醚水平的周 期性变动似乎与寄生虫血症异相。向后相移硫醚数据24小时，揭示出寄生虫血症与挥发物 水平之间的直接相关（图21a)。对于1组，烯丙基甲基硫化物与(E)-甲硫基-1-丙烯是具有最 高相关性的化合物，分别为:r 2 = 0.94和r2 = 0.97。对于2组，稀丙基甲基硫化物(r2 = 0.97)再 次与1-甲硫基-丙烷(r2 = 0.92)-起与寄生虫血症高度相关联。
[0291] 在两个组中，观察到，最高水平的硫醚是出现于在药物施用之后(6.5小时)收集的 第一呼吸样本中（图20)，这可能指示在驱动硫醚产生中寄生虫死亡或溶解的作用。挥发物 水平在初始药物治疗之后单调下降，这与寄生虫血症的清除有关（图20)。对于1组，与在2组 中用更慢作用的双喹啉4-氨基喹啉观察到的清除相比，快速作用合成臭氧化物的施用导致 寄生虫血症和硫醚水平的更快减少（图20)。对于1组，治疗后，寄生虫血症的水平与（Z)-甲 硫基-1-丙稀(r 2 = 0.76)、（E)-甲硫基-1-丙稀(r2 = 0.98)和1-甲硫基-丙烷(r2 = 0.99)的丰 度之间存在直接相关（图3b)。对于2组，在硫醚的水平与寄生虫血症的水平之间存在较低但 仍显著的相关性，特定而言对于(E)-甲硫基-1-丙烯而言为r 2>0.79并且对于烯丙基甲基硫 化物而言为r2>0.76(图21b)。
[0292] 过造
[0293] 寄生虫与挥发物水平之间观察到的24小时相移表明，所述挥发物可能与血液阶段 寄生虫的48小时生命周期有关联，并且该峰对应于被感染红血细胞何时胀裂(裂殖体破裂） 而释放裂殖子并且感染新红血细胞以再开始红血球循环。在恶性疟原虫感染中，裂殖体破 裂每48小时发生。
[0294] 实施例8-基于硫醚水平的机器学习疟疾感染分类
[0295] 使用存在于第0天预感染和第7/8天PM的呼吸样本中的4种硫醚的峰下面积，据发 现，使用留一法交叉验证与支持向量机(SVM)或k最近邻(KNN)分类器，所有样本可基于挥发 物水平被完美地分类，这表明在基准日和药物施用不久之后的统计显著差异。理想地，有可 能在一个组上训练分类器并且使用其来分类另一个组。这稍微有些复杂，因为事实上发明 人GC-MS离子源已被清洁并且在两个组之间再校准。然而，在执行数据归一化来说明这些改 变之后，发明人使用1组数据来训练所述分类器，并且所述分类器能够完美地从2组中分类 数据。以同样的方法，使用2组来训练分类器，提供1组数据的完美分类。
[0296] 实施例9-体外挥发物
[0297] Wong等人(2012)先前报道，当体外红细胞培养物受恶性疟原虫感染时，可能检测 到顶部空间挥发物无变化。发明人明确地在100mL红血细胞悬浮体（1 %红细胞压积，起始寄 生虫血症0.5%)的顶部空间中搜索4种硫醚，显示最终寄生虫血症水平约39%。在用lOOOng mr1抗疟疾哌喹四磷酸盐四水合物治疗之后，以及在用清洁剂使细胞膜破裂之后，在恶性疟 原虫受感染细胞培养物(5.5h)的顶部空间中也未检测到硫醚。作为阳性对照物，发明人按 以下水平将4种硫醚加标至红血细胞培养物中：烯丙基甲基硫化物:2.7nmol I/1; 1-甲硫基-丙烷:4.4nmol L'即，健康个体中先前检测的值(Mochalski等人，2013);以及异构体(Z)-甲硫基-1-丙烯和(E)-甲硫基-1-丙烯各2.5nmol I/1。发明人随后将样本孵育4天，并且正常 收集顶部空间。所有硫醚均容易检测到。体外样本还示出了来源于塑料烧瓶的V0C，但它们 不妨碍对4种硫醚的检测，此外，在收集的环境样本中未检测到硫醚。
[0298] 血液培养物中存在的寄生红血细胞（RBC)的生物量（0.1L X 0.01红细胞压积X 0.39寄生虫血症=0.39g被感染红细胞）比志愿者中存在的感染RBC的生物量(5L X 0.43红 细胞压积X 0.00001寄生虫血症= 0.02g被感染红血细胞）高约18倍。在体外取样可用的 400mL顶部空间中的大约200mL，与取样自志愿者的1L呼吸进行比较。在人类志愿者中，每次 呼吸存在"吹走(blow off)"硫醚的可能性，所以必须假定志愿者中测量的硫醚水平代表生 成与耗散之间的暂时平衡，而在用于我们的体外研究的封闭烧瓶中存在硫醚累积的显著可 能性。这些考虑表明，如果硫醚确实以相当水平在体内产生，则该体外规程应该能够检测硫 醚。
[0299] 这些结果表明，宿主响应涉及在裂殖体破裂期间生产挥发物。以同样的方法，在感 染RBC的溶解(裂殖体破裂)期间释放的寄生虫毒素与吞噬性人类细胞之间的交互作用在疟 疾热病发作中达到极点，其它分子事件可能发生在产生硫醚的裂殖体破裂期间。
[0300] 实施例10-患有间日疟原虫感染的患者中水平增加的挥发性有机化合物
[0301] 越
[0302] 在第0天用静脉内施用的约100个有活力的间日疟原虫感染的人类红细胞来接种 志愿者。基于门诊患者，直至第7天当志愿者每日访问临床单位以便血液收集，然后在每日 两次(AM和PM)针对以下进行寄生虫检测之后通过电话每日监测志愿者：
[0303] ?寄生虫血症的定量（如通过两种寄生虫基因组等效物的PCR并且针对配子母细 胞特异性转录物Pvs25进行评价），
[0304] ?暗示疟疾的症状或迹象的意外早期发作，以及
[0305] ?不良事件。
[0306] 在开始治疗之前3天或4天期间（约第11天、第12天、第13天和第14天），进行传播研 究。在所述日期，将2X6ml血液收集(AM和/或PM)至肝素化真空采集管中以用于用斯氏按蚊 (八11.3丨6口116118；0进行膜饲养测定。为其它目的（寄生虫定量的？〇?，根据需要的血液和安全 血液探索性研究）收集额外血液。为预防早熟小配子形成，将血液保持在38°C下（至多35分 钟），直至分散至膜饲养器中。随后将志愿者护送至位于昆士兰医学研究院（Queensland Institute of Medical Research)的检疫昆虫研究所，并且要求他们允许在其前臂或大腿 的掌侧表面上饲养媒介蚊子持续1〇±5分钟的周期(直接饲养测定）。通过参加者的直接饲 养，蚊子的实验性感染执行至多3次，并且通过人工膜饲养至多6次，直至抗疟疾治疗开始。 仅通过膜进行额外蚊子饲养是在Q-Pharm临床点收集的傍晚样本上进行。
[0307]在指定开始治疗的那天，如通过临床上明显的疟疾感染所确定（预期是约第14 天），容许志愿者进入研究单位并且限制行动以便安全监测和抗疟疾治疗。允许转入临床单 位将是阳性寄生虫血症以及疟疾临床特征的发作，基于我们的先前研究(McCarthy等人， 2013)，预期是在约第14天发生。在治疗之前执行单个手指刺扎试验来与周边血液样本比较 配子母细胞数。
[0308]在治疗之后，志愿者作为住院患者被追踪36小时以确保治疗耐受性与临床响应。 一旦临床上良好，则针对抗疟疾药物的连续给药基于门诊患者追踪安全性与疟疾寄生虫的 清除，如通过灵敏定量PCR评价。
[0309] 除血液收集以外，呼吸样本在接种之前收集并且至多14次后感染。在预指定时间 点，要求志愿者通过附接至呼吸储器(袋子)的单个吹口呼出（至多3次）。呼吸样本被转移至 吸附管，并随后通过本文所述的气相色谱-质谱分析法分析，以评估挥发性有机化合物的存 在。
[0310] 为了代谢研究，在接种之前以及开始抗疟疾治疗24小时之后，收集第一天上午排 泄的尿。
[0311] 针对安全性评定的追踪访问是在疟疾攻毒之后第28天执行，并且需要志愿者在结 束研究访问之后至多2周时是可接触且可用的。
[0312] RiametK片剂（蒿甲醚(2〇mg)和苯芴醇（120mg))单个剂量4片每天两次在时间0、 12、24、36、48和60小时处随脂肪食品口服，总剂量为6剂24片，将此作为抢救治疗。
[0313] ^
[0314] 可注意到，间日疟原虫寄生虫血症的生长和清除动力学不同于恶性疟原虫（图 22)。该模式是该属种典型的，并且先前已有所描述(McCarthy等人，2013)。
[0315] 关于挥发物，在治疗之前，挥发物的水平存在增加和降低的48小时循环，随后在治 疗之后水平降低（图22)。在该研究中，发明人未观察到在治疗之后V0C立刻较大初始增加， 这归因于治疗的性质。
[0316] 本领域技术人员应了解的是，可在不脱离如广泛描述的本发明的精神或范围的情 况下对如特定实施方案中所示的本发明做出众多变化和/或修改。因此，本实施方案视为在 所有方面是说明性的而不是限制性的。
[0317] 本申请要求于2013年11月28日提交的AU 2013904616的优先权，所述申请的全部 内容以引用的方式并入本文。
[0318] 本文所讨论和/或参照的所有出版物都整体并入本文。
[0319] 对文件、法案、材料、装置、物品等已包括在本说明书中的任何论述都仅出于提供 本发明的上下文的目的。不应视为认可的是任何或所有这些事项因为在本申请的各权利要 求的优先日期之前存在而形成先前技术基础的一部分或是与本发明相关的领域中的普通 常识。
[0320] 参考文献
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【主权项】
1. 一种用于识别患有疟原虫感染的受试者的方法，所述方法包括在所述受试者或得自 其的样本中检测一种或多种挥发性有机化合物，所述挥发性有机化合物选自由烯丙基甲基 硫化物、1-甲硫基丙烷、（E)-I-甲硫基-1-丙烯和(Z)-I-甲硫基-1-丙烯组成的组，其中所述 一种或多种挥发性有机化合物的水平指示疟原虫感染。2. 如权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种挥发性有机化合物的水平还指示所 述疟原虫感染的状态。3. -种用于监测患有疟原虫感染的受试者的方法，所述方法包括在所述受试者或得自 其的样本中检测一种或多种挥发性有机化合物，所述挥发性有机化合物选自由烯丙基甲基 硫化物、1-甲硫基丙烷、（E)-I-甲硫基-1-丙烯和(Z)-I-甲硫基-1-丙烯组成的组，其中所述 受试者先前已知具有疟原虫感染，并且其中所述一种或多种挥发性有机化合物的水平指示 所述疟原虫感染的状态。4. 如权利要求3所述的方法，其中所述受试者已施用化合物来治疗所述感染。5. 如权利要求4所述的方法，其中当与治疗之前的水平相比时，在所述治疗之后，所述 一种或多种挥发性有机化合物的水平的初始增加指示所述治疗是有效的。6. 如权利要求4或权利要求5所述的方法，其中在施用所述治疗之后0.5至72小时之间， 监测受试者的所述初始增加。7. 根据权利要求3至6中任一项所述的方法，其中一种或多种挥发性有机化合物的所述 水平的降低指示所述治疗已经有效。8. -种选择用于疟原虫感染的合适治疗的方法，所述方法包括:在所述受试者或得自 其的样本中检测一种或多种挥发性有机化合物的水平，所述挥发性有机化合物选自由烯丙 基甲基硫化物、1-甲硫基丙烷、（E)-I-甲硫基-1-丙烯和(Z)-I-甲硫基-1-丙烯组成的组；以 及基于所述一种或多种挥发性有机化合物的水平来选择合适的治疗。9. 根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中在所述样本中是选自由呼出气、呼吸 冷凝物、唾液、血液、汗水、皮肤微生物、皮肤挥发性样本和尿组成的组。10. 如权利要求9所述的方法，其中所述样本是呼出气。11. 根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其还包括将所述一种或多种挥发性有机 化合物的水平与合适对照物比较。12. 根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。13. -种识别用以治疗疟原虫感染的化合物的方法，所述方法包括 i) 将候选化合物施用于受疟原虫感染的受试者，以及 ii) 针对一种或多种挥发性有机化合物的水平来监测所述受试者或得自其的样本，所 述挥发性有机化合物选自由烯丙基甲基硫化物、1-甲硫基丙烷、（E)-I-甲硫基-1-丙烯和 (Z)-I-甲硫基-1-丙烯组成的组， 其中在步骤i)之后，所述一种或多种挥发性有机化合物的水平的初始增加，和/或所述 一种或多种挥发性有机化合物的水平的降低，指示所述化合物可用于治疗疟原虫感染。14. 一种识别对抗疟原虫化合物已发展出耐药性的疟原虫的菌株的方法，所述方法包 括 i) 将所述抗疟原虫化合物施用于受疟原虫菌株感染的受试者，以及 ii) 针对一种或多种挥发性有机化合物的水平来监测所述受试者或得自其的样本，所 述挥发性有机化合物选自由烯丙基甲基硫化物、1-甲硫基丙烷、（E)-I-甲硫基-1-丙烯和 (Z)-I-甲硫基-1-丙烯组成的组， 其中在步骤i)之后，所述一种或多种挥发性有机化合物的水平缺乏显著改变指示该疟 原虫菌株具有对抗疟原虫化合物的耐药性。15. 如权利要求1至14中任一项所述的方法，其中对所述一种或多种挥发性有机化合物 的所述检测或监测包括使用选自由以下组成的组的至少一种技术:质谱学(MS)(诸如气相 色谱质谱学(GCMS)、液相色谱质谱学(LCMS)和质子转移反应质谱学(PTR-MS));离子迀移光 谱学;场非对称离子迀移光谱学;差分迀移光谱学(DMS);电子鼻装置;生物传感器;基于抗 体的检测系统；比色测定;红外光谱学（IR光谱学）（诸如近红外(NIR)、傅里叶变换-红外线 (FTIR)光谱学和衰荡腔光谱学）；选择离子流动管质谱学(SIFT)，燃料电池电极;光吸收光 谱学;纳米粒技术;柔性平板波(FPW)传感器;电化学传感器;光声设备;基于激光的设备;各 种电离技术和驯养动物检测或其组合。16. 如权利要求15所述的方法，其中对所述一种或多种挥发性有机化合物的所述检测 或监测包括使用选自由以下组成的组的至少一种技术:气相色谱质谱学(GCMS)、液相色谱 质谱学(LCMS)、电子鼻装置、生物传感器、基于抗体的检测系统、比色测定、近红外(NIR)、选 择离子流动管质谱学(SIFT)和质子转移反应质谱学(PTR-MS)。17. 如权利要求16所述的方法，其中对所述一种或多种挥发性有机化合物的检测包括 使用气相色谱质谱学(GCMS)或电子鼻装置。18. -种筛选用于识别患有疟原虫感染的受试者的化合物的方法，所述方法包括 i) 使候选化合物与挥发性有机化合物接触，所述挥发性有机化合物选自由烯丙基甲基 硫化物、1-甲硫基丙烷、（E)-I-甲硫基-1-丙烯和(Z)-I-甲硫基-1-丙烯组成的组，以及 ii) 确定所述化合物是否与所述挥发性有机化合物结合或反应， 其中与所述挥发性有机化合物结合或反应的化合物可被用于根据权利要求1至12中任 一项所述的方法。19. 根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述疟原虫是恶性疟原虫、诺氏疟 原虫、间日疱原虫、卵形疱原虫curt is i亚种、卵形疱原虫wallikeri亚种或三日疱原虫。20. 如权利要求19所述的方法，其中所述疟原虫是恶性疟原虫或间日疟原虫。
【文档编号】G01N33/497GK105899948SQ201480070523
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2014年11月28日
【发明人】S·特罗威尔, A·伯纳, B·帕多万, V·洛克
【申请人】联邦科学技术研究组织