金银花中绿原酸、木犀草苷和总黄酮含量的测定方法
【专利摘要】本发明提供一种简单、快捷、重现性好的方法检测金银花中绿原酸、木犀草苷和总黄酮的含量，能同时对金银花中的绿原酸和木犀草苷进行定量分析，其步骤包括：（1）供试品溶液的制备：取金银花粉末适量，精密称量，按每克加入25毫升体积浓度70%的乙醇溶解、超声、定容、过滤即得供试品；（2）采用高效液相色谱法进行分析测定，色谱条件为：Luna 5u Phenyl?Hexyls(250×4.60mm)色谱柱；流动相A为0.5％冰醋酸水溶液，流动相B为乙腈，流动相梯度洗脱，检测波长为325?330nm或345?355nm。
【专利说明】
金银花中绿原酸、木犀草苷和总黄酮含量的测定方法
技术领域
[0001] 本发明涉及药物检测领域，具体是一种金银花中绿原酸、木犀草苷和总黄酮含量 的测定方法。
【背景技术】
[0002] 金银花为忍冬科植物忍冬(Zoflicera Japoflica Thunb.)的干燥花蕾或带初开的 花，其味甘，性寒，具有清热解毒、疏散风热的功能，可用于治疗痈肿疔疮、喉痹、丹毒、热毒 血痢、风热感冒、温热发病等多种疾病。在我国主产于山东、河南、湖南省，四川、贵州、广西、 江西、江苏等省也有分布。我国人工栽培金银花已有270多年的历史，以山东、河南为主产 区，通常认为山东产量大，而河南品质佳。近年来，广西融安县、忻城县等地进行人工栽培金 银花，建立了大面积金银花商品种植基地。金银花中的主要活性成分有绿原酸类、黄酮类、 苷类、环烯醚萜类等。按2010版中国药典规定，金银花中的标志性成分是绿原酸和木犀草 苷，而是否含有木犀草苷是区别金银花和山银花的主要指标，也是正品金银花和山银花等 同科植物在疗效上差异的主要原因。黄酮类化合物的生物活性日益被人们所关注，并逐渐 成为研究热点，现代药理研究表明，金银花的黄酮成分有多种药理作用，如抗菌、抗病毒、抗 炎、止咳祛痰、增强机体免疫等，故测定金银花中总黄酮的含量有重要意义。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一种更加简单、快捷、重现性好的方法检测金银花中绿原酸、 木犀草苷和总黄酮的含量。
[0004] 本发明提供一种同时测定金银花中绿原酸和木犀草苷含量的方法，能同时对金银 花中的绿原酸和木犀草苷进行定量分析，其步骤包括： (1) 供试品溶液的制备:取金银花粉末适量，精密称量，按每克加入25毫升体积浓度70% 乙醇溶解、超声、定容、过滤即得供试品； (2) 采用高效液相色谱法进行分析测定，色谱条件为:Luna 5u Phenyl-Hexyls(250 X 4.60mm)色谱柱;流动相A为0.5 %冰醋酸水溶液，流动相B为乙腈，流动相梯度洗脱，检测波 长为325-330nm或345-355nm，流速0 ? 5-1 ? 5 ml/min，柱温30-40°C，进样量5-20y 1。
[0005] 所述梯度洗脱的程序为： (1) 0-10min时，流动相A:流动相B=90:10 (2) 10min时，流动相A:流动相B=78:22 (3) 40min时，流动相A:流动相B=70:30 (4) 60min时，流动相A:流动相B=90:10 (5) 60min开始冲洗并平衡色谱柱15min。
[0006] 本发明还提供一种测定金银花中总黄酮的含量的方法，采用紫外分光光度法测 定，用芦丁对照品配置成标准溶液，金银花粉末配置成供试品溶液，直接测定梯度标准溶液 吸光度，建立标准曲线，再测定待测液吸光度，从标准曲线查出待测液浓度，最后根据配置 溶液时的稀释倍数计算出金银花提取物的总黄酮含量，具体操作步骤如下： (1) 对照品溶液的制备:精密称取芦丁对照品，按每0.01克加入50毫升体积浓度55%的 乙醇，超声溶解，定容，摇匀，配制成对照品标准母液； (2) 供试品溶液的制备:取金银花样品药材粉末，精密称定，按每1克加入加入20毫升体 积浓度的55%乙醇，回流，过滤，取续滤液，作为供试品溶液； (3) 标准曲线绘制:精密量取不同体积的芦丁对照品标准母液，置于容量瓶中，分别加 水至相同体积，加入5%亚硝酸钠溶液摇匀放置，加10%硝酸铝溶液摇匀放置，加lmol/L氢氧 化钠溶液，再加水至刻度，摇匀放置，以相应试剂为空白，照紫外-可见分光光度法，以510nm 的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线； (4) 总黄酮含量测定:取供试品溶液测定吸光度，代入线性方程，计算总黄酮含量。
[0007] 本发明的优点为： (1)精密度好。取测定绿原酸和木犀草苷的供试品溶液，按以上的色谱条件，连续进样6 次，测得绿原酸和木犀草苷峰面积的RSD值分别为0.74%和0.42 % ;精密量取芦丁对照品溶 液适量并定容，测定吸光度，连续测定6次，于51 Onm波长处测溶液吸光度，RSD值为0.54%，表 明本法精密度良好。
[0008] (2)稳定性好。取广西融安金银花的测定绿原酸和木犀草苷的供试品溶液，按以上 的色谱条件分别于0,2,4，12,2处进样测定，测得样品中绿原酸和木犀草苷峰面积的1?0值 分别为2.51%和3.77%，结果表明，供试品溶液在24h内稳定;精密量取测定总黄酮含量的供 试品溶液适量并定容，分别于0、10、20、30、40、50min时依法测定吸光度，测得的RSD值为 1.02%。结果表明，供试品溶液加显色剂后50min内稳定；制备测定总黄酮含量的供试品溶 液，分别于0、lh、2h、3h、4h、1 Oh时，各精密量取供试品溶液适量并定容，依法测定吸光度，测 得的RSD值为0.68%。结果表明，供试品溶液10h内稳定。
[0009] (3)重复性好。取广西融安金银花样品，制取测得样品中绿原酸和木犀草苷的供试 品共6份，按以上色谱条件进行含量测定。绿原酸和木犀草苷含量的RSD值分别为2.47%和 2.01 %。另取测定总黄酮含量的供试样品6份，精密称定，溶解定容后依法测定吸光度，计算 得到的RSD值为0.87%，表明本法重复性良好。
[0010] (4)准确度高。精密量取已知含量的6份样品的测得样品中绿原酸和木犀草苷的供 试品溶液，在以上色谱条件进行测定，得出峰面积，代入线性方程，得总绿原酸和木犀草苷 的质量，求绿原酸和木犀草苷的平均加样回收率分别为100.06%和100.05%，RSD值分别 1.10%和1.67%，另取6份测定总黄酮含量的供试品，依法测定吸光度，计算得至IjRSD为1.22%， 说明该方法可行。
【附图说明】
[0011] 图1为芦丁在200-700nm处扫描吸收图谱。 具体实施例
[0012] 本实施例通过采用高效液相色谱法同时测定金银花中绿原酸和木犀草苷含量，采 用紫外_可见分光光度法测定金银花中总黄酮含量，并比较广西产金银花与其他不同产地 的金银花指标成分含量的差异，为广西开发金银花的生药资源和建立GAP基地提供依据。
[0013]本发明涉及的仪器与材料如下： (1)仪器:TU-1901双光束紫外-可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）， EL204电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司），LX-010A型多功能粉碎机(上海江信科技有 限公司），KQ-500DB型数控超声仪（昆山市超声仪器有限公司），数显恒温水浴锅HH-2(国华 电器有限公司），岛津LC-20A型高效液相色谱仪（日本岛津公司），色谱柱(Luna 5u Phenyl-Hexyls(250X4.60mm)。
[0014] (2)试剂无水乙醇（分析纯，成都市科龙化工试剂厂，批号：20130804);氢氧化钠 (分析纯，成都市科龙化工试剂厂，批号= 20110524);亚硝酸钠(分析纯，西陇化工股份有限 公司，批号：120516);九水合硝酸铝（分析纯，成都市科龙化工试剂厂，批号：120413);冰醋 酸（分析纯，成都市科龙化工试剂厂，批号= 20120424);乙腈（色谱纯，美国飞世尔，批号： 20120920)。
[0015] (3)对照品：芦丁（中国药品生物制品检定所，批号：100080-200707);绿原酸（中国 药品生物制品研究院，批号：111720-20110806);木犀草苷（中国药品生物制品研究院，批 号：110712-201111)。
[0016] (4)样品：金银花药材分别采自于广西融安、广西忻城、广西马山、河北巨鹿、河南 封丘、河南新密、江西横峰、山东费县、湖南新化、山东平邑和贵州铜仁。经广西中医药研究 院赖茂祥研究员鉴定为忍冬科植物忍冬(I〇/3i'cera Japoflica Thunb.)的干燥花蕾。
[0017] 实施例i 同时测定绿原酸和木犀草苷的含量的方法 1.色谱条件 Luna 5u Phenyl_Hexyls(250 X4 ? 60mm)色谱柱;流动相：乙腈(B)-〇 ? 5%冰醋酸水溶液 (A)流动相，流动相梯度洗脱(见表1)，流速1.0 ml/min，检测波长为327nm，柱温30°C，进样 量10yl。在上述条件下，绿原酸和木犀草苷分离良好。
[0018] 2.系统适应性试验 理论塔板数用木犀草苷计算应不低于2000。
[0019] 3.对照品溶液的配制 精密称取绿原酸对照品9.03mg，用体积浓度70%的乙醇定容至25ml，制备成0.3612mg/ ml对照品溶液;精密称取木犀草苷对照品9.60mg，用体积浓度70%乙醇定容至50ml，制备成 0.1920mg/ml对照品溶液。
[0020] 4.供试品溶液的配制 取广西融安金银花药材粉末2.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积浓度70% 乙醇50 ml，称定重量，超声60 min(功率250w，频率40kHz)，放冷后，称量，补足减失的重量， 摇匀，过滤，取续滤液即可。
[0021] 5.线性关系的考察 精密吸取 1 ? 〇ml、1 ? 5ml、2 ? 0ml、2 ? 5ml、3 ? 0ml、3 ? 5ml绿原酸储备液和0 ? lml、0 ? 5ml、 1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml木犀草苷储备液分别置12个10ml的棕色容量瓶中，加70%乙醇至 刻度。按以上的色谱条件测定绿原酸和木犀草苷的峰面积，分别以峰面积为纵坐标，进样浓 度为横坐标，绘制标准曲线。求得绿原酸和木犀草苷的回归方程分别为:y=28830x-3866.5， r=0.9992; y=18087x-9724.7，r=0.9996。表明绿原酸和木犀草苷进样浓度分别在36.12yg/ ml~126 ? 42μg/ml和1 ? 92μg/ml~48 ? OOμg/ml的范围内线性良好。
[0022] 6.精密度试验 取绿原酸和木犀草苷对照品溶液，按以上的色谱条件，连续进样6次，测得绿原酸和木 犀草苷峰面积的RSD值分别为0.74%和0.42%。结果表明仪器分析的精密度良好。
[0023] 7.稳定性试验 取广西融安金银花样品的供试品溶液，按以上的色谱条件分别于0,2,4，12,2处进样测 定，测得样品中绿原酸和木犀草苷峰面积的RSD值分别为2.51%和3.77%。结果表明，供试品 溶液在24h内稳定。
[0024] 8.重复性试验 取广西融安金银花样品，按3项下方法制备供试品溶液，共6份，按2.1.1项下的色谱条 件进行含量测定。绿原酸和木犀草苷含量的RSD值分别为2.47%和2.01%。结果表明此法重 复性良好。
[0025] 9.加样回收率试验 取已知含量的样品，每份约o.lg，共6份，精密称定，置于50ml具塞锥形瓶中，分别精密 加入0 ? 3786mg/ml绿原酸对照品7 ? 0ml和0 ? 0666mg/ml木犀草苷对照品5 ? 0ml，按2 ? 1 ? 3项下 方法制备供试品溶液，并按上述1项下色谱条件进行测定，得出峰面积，代入线性方程，得总 绿原酸和木犀草苷的质量，求绿原酸和木犀草苷的平均加样回收率分别为100.06%和 100.05%，RSD值分别1.10%和1.67%，说明该方法可行。（见表1、表2。）
10.绿原酸和木犀草苷的测定结果 将不同产地的金银花药材，分别按2.1.3项下方法制备供试品溶液，按2.1.1项下色谱 条件注入高效液相，测定峰面积，分别代入线性方程，计算绿原酸和木犀草苷的含量。（见表 3)
实施例2 总黄酮的含量测定方法 1.对照品洛液的制备 精密称取芦丁对照品0.011 g(实际称量0.01134g，标示量为92.5%，即含11.34 X 0.929mg芦丁），精密称定，置50ml容量瓶中，加体积浓度55%的乙醇适量。超声使其溶解，加 体积浓度55%乙醇至刻度，摇匀。配制成209.79ug/ml的对照品溶液。
[0026] 2.供试品溶液的制备 取广西融安金银花样品药材粉末(过40目筛）1 g，精密称定，置50ml圆底烧瓶中，加入体 积浓度55%乙醇20ml，回流lh，过滤，取续滤液，作为供试品溶液。
[0027] 3 ?测定波长的选择 取对照品溶液2ml，置25ml容量瓶中，加入5%亚硝酸钠溶液lml，摇匀，放置6min。加10% 硝酸铝溶液lml，摇匀，放置6min。加lmol/L氢氧化钠溶液10ml，再加水至刻度，摇匀，放置 15min。以相应试剂为空白，照紫外-可见分光光度法，在200~700nm处扫描记录吸收图谱。结 果在510nm处有吸收峰，故采用510nm作为检测波长。如图1 〇 [0028] 4.标准曲线绘制 精密量取上述芦丁对照品溶液 1. 〇〇ml、2.00ml、3.00ml、4.00ml、5.00ml、6.00ml、 7.00ml与8.00ml分别置于25ml容量瓶中，加水至8ml。加入5%亚硝酸钠溶液lml，摇匀，放置 6min。加10%硝酸铝溶液lml，摇匀，放置6min。加lmol/L氢氧化钠溶液10ml，再加水至刻度， 摇匀，放置15min。以相应试剂为空白，照紫外-可见分光光度法，以510nm的波长处测定吸光 度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。求得芦丁回归方程为:7=〇.〇12&-0.01，r=0.9997。表明芦丁在8.39μg/ml~67.13μg/ml的范围内线性良好。
[0029] 5.精密度试验 精密量取对照品溶液2ml，置25ml容量瓶中，照4项下的方法操作，依法测定吸光度，连 续测定6次，于51 Onm波长处测溶液吸光度，RSD值为0.54%，表明本法精密度良好。
[0030] 6.稳定性试验 精密量取样品的供试品溶液2ml，置于25ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，精密量取 lml稀释液置于25ml容量瓶中，照4项下的方法操作，分别于0、10、20、30、40、50min时依法测 定吸光度，测得的RSD值为1.02%。结果表明，供试品溶液加显色剂后50min内稳定。
[0031] 制备样品的供试品溶液，分别于0、lh、2h、3h、4h、10h时，各精密量取供试品溶液 2ml，置于25ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，精密量取lml稀释液置于25ml容量瓶中，照4 项下的方法制备样品后，依法测定吸光度，测得的RSD值为0.68%。结果表明，供试品溶液10h 内稳定。
[0032] 7.重复性试验 取样品6份，精密称定，照2项下制备供试品溶液，各精密量取2ml，置于25ml容量瓶中， 加蒸馏水稀释至刻度，精密量取lml稀释液置于25ml容量瓶中，照4项下的方法制备，依法测 定吸光度，计算得到的RSD值为0.87%，表明本法重复性良好。
[0033] 8.加样回收率试验 精密量取已知含量的6份样品的供试品溶液各2ml，置于25ml容量瓶中，加蒸馏水稀释 至刻度，精密量取lml稀释液置于25ml容量瓶中，分别加入对照品溶液3ml，照4项下的方法 制备，依法测定吸光度，计算得到RSD为1.22%，说明该方法可行。（见表4) 表4金银花总黄酮的加样回收率
9.总黄酮含量测定结果 取另五批金银花粉末(过40目筛)各三份，每份lg，精密称定，照供试品溶液制备项下方 法制备样品溶液，各精密量取2.0ml，置于25ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，精密量取 lml稀释液置于25ml容量瓶中，照标准曲线的制备项下的方法制备，依法测定吸光度，分别 代入线性方程，计算总黄酮含量。（见表5 ) 表5不同产地金银花总黄酮的含量
结论 金银花中木犀草苷的含量比较低，而绿原酸的含量相对比较高，本发明使用的方法是 参照2010版中国药典金银花中木犀草苷含量测定的方法进行改进。梯度洗脱会因为某些因 素而发生较大变化，比如流动相的改变，不同样品的测定等等。通过改变梯度洗脱的浓度和 时间，最终发现流动相梯度:〇 min(10%B)-10 min(22%B)-30 min(22%B)-40 min(30% B)-60min(10%B)可以使得绿原酸和木犀草苷这两种成分更好地分离。绿原酸的最大紫外吸 收波长为327nm，而木犀草苷为350nm，在预实验中，通过327nm和350nm波长的转换中，发现 在327nm的波长下同时测定绿原酸与木犀草苷时为最佳检测波长。
[0034]通过本发明研究表明，以绿原酸为指标计算，湖南新化产的金银花含量最高，其次 是广西融安县和河南封丘产的金银花。而以木犀草苷为指标计算，广西融安县产的金银花 含量最高，其次是湖南新化和河南封丘产的金银花。结果表明，广西融安、忻城和马山产的 金银花完全符合中国药典规定。
[0035]金银花含有多种有效成分，其中黄酮类化合物是一类主要成分，具有抗炎、抑菌等 多种药理作用。目前，金银花的质量标准仅以绿原酸和木犀草苷作为质量控制标准不够全 面，存在着局限性，因此有必要建立多指标综合评价该药材的质量。本方法建立了金银花药 材中总黄酮的含量测定方法，该测定方法操作简便、快捷，结果重现性好，特别适用于基层 医药单位对金银花药材质量进行快速分析。实验结果表明，金银花中含有丰富的总黄酮，在 对总黄酮进行定量分析时在特定的碱性条件下加入显色剂使其显特征颜色，可排除其他物 质的干扰，提高准确度。由实验结果可知，不同产地的金银花中总黄酮的含量不同，其中江 西产的金银花总黄酮含量最高，河南产金银花黄酮含量较高，不同产地总黄酮含量差异较 大，广西融安县的金银花总黄酮含量接近河南。总体来说广西融安县的金银花药材质量较 好，可以以此地区为GAP考察目标进行规范种植，以保证和提高金银花药材质量。
【主权项】
1. 一种同时测定金银花中绿原酸和木犀草苷含量的方法，其特征在于，能同时对金银 花中的绿原酸和木犀草苷进行定量分析，其步骤包括： (1) 供试品溶液的制备:取金银花粉末适量，精密称量，按每克加入25毫升体积浓度70% 的乙醇溶解、超声、定容、过滤即得供试品； (2) 采用高效液相色谱法进行分析测定，色谱条件为:Luna 5u Phenyl-Hexyls(250 X 4.60mm)色谱柱;流动相A为0.5 %冰醋酸水溶液，流动相B为乙腈，流动相梯度洗脱，检测波 长为 325-330nm 或 345-355nm。2. 如权利要求1所述同时测定金银花中绿原酸和木犀草苷含量的方法，其特征在于:所 述色谱条件为:流速0.5-1.5 ml/min，柱温30-40°C，进样量5-20μ1。3. 如权利要求1所述同时测定金银花中绿原酸和木犀草苷含量的方法，其特征在于:所 述梯度洗脱的程序为： (1) O-IOmin时，流动相A:流动相B=90:10 (2) IOmin时，流动相Α:流动相Β=78:22 (3) 40min时，流动相Α:流动相Β=70:30 (4) 60min时，流动相Α:流动相B=90:10 (5 )60min开始冲洗并平衡色谱柱15min。4. 一种测定金银花中总黄酮的含量的方法，其特征在于:采用紫外分光光度法，用芦丁 对照品配置成标准溶液，金银花粉末配置成供试品溶液，直接测定梯度标准溶液吸光度，建 立标准曲线，再测定待测液吸光度，从标准曲线查出待测液浓度，最后根据配置溶液时的稀 释倍数计算出金银花提取物的总黄酮含量，具体操作步骤如下： (1) 对照品溶液的制备：精密称取芦丁对照品，按每0.01克加入50毫升体积浓度55%的 乙醇，超声溶解，定容，摇匀，配制成对照品标准母液； (2) 供试品溶液的制备:取金银花样品药材粉末，精密称定，按每1克加入加入20毫升体 积浓度的55%乙醇，回流，过滤，取续滤液，作为供试品溶液； (3) 标准曲线绘制:精密量取不同体积的芦丁对照品标准母液，置于容量瓶中，分别加 水至相同体积，加入5%亚硝酸钠溶液摇匀放置，加10%硝酸铝溶液摇匀放置，加 lmol/L氢氧 化钠溶液，再加水至刻度，摇匀放置，以相应试剂为空白，照紫外-可见分光光度法，以510nm 的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线； (4) 总黄酮含量测定:取供试品溶液测定吸光度，代入线性方程，计算总黄酮含量。
【文档编号】G01N30/02GK105911154SQ201610068079
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年2月1日
【发明人】朱丹, 张春花, 李琼
【申请人】广西医科大学