一种检测人血浆中氟甲喹对映体的方法
【专利摘要】本发明涉及一种检测人血浆中氟甲喹对映体的方法，配置标准氟甲喹溶液，加入到人血浆中，然后利用UFLC?MS/MS对其检测。本发明对固相萃取条件进行了优化，使得固相萃取的时间缩短、效率变高，而UFLC?MS/MS分析氟甲喹对映体的浓度精度高，速度快，操作简单、成本较低；检测方法对目标化合物的线性关系好，回收率高，相对偏差小，使用的试剂低毒，使用量少，对环境友好。
【专利说明】
一种检测人血浆中氟甲喹对映体的方法
技术领域
[0001 ]本发明涉及一种快速高效检测人血浆中氟甲喹对映体的方法。【背景技术】
[0002]氟甲喹(FLU)为第二代氟喹诺酮类抗菌药，是动物专用抗菌药物，对治疗革兰氏阴性菌感染，特别是对大肠杆菌、支原体、嗜水气单胞菌引起的畜、禽及水产动物疾病有较好疗效。其作用机理主要是抑制DNA旋转酶A亚单位，破坏它的活性，结果使脱氧核糖核酸、核糖核酸及蛋白质的合成受干扰，使细胞不能再进行分裂，从而起到杀菌作用。由于氟甲喹具有高安全性、耐受性和独特的高渗透性。已有研究发现高剂量氟甲喹可引起大鼠胚胎发育畸变，虽然低剂量氟甲喹对人体的危害尚未见报道，但长期摄入有氟甲喹残留的食品，其潜在风险不容低估。氟甲喹是一种手性药物，具有一个手性碳原子，两个手性对映体。手性药物的不同对映体间往往显示出不同的药效学、药动学和毒理学特征，因此，对手性药物的不同对映体进行检测尤为重要。目前，针对氟甲喹外消旋体在水产品中的残留检测研究不少，但是尚没有针对氟甲喹对映体在人血浆中的残留检测。因此，开展检测人血浆中氟甲喹对映体的研究，将为氟甲喹在人血浆中残留的风险评估以及合理、安全使用提供依据。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于为了解决现有结晶法检测氟甲喹对映体成本高、分离时间长， 适用性窄，操作复杂，精度不高的缺陷而提供一种快速、精度高，操作简单、成本较低的检测人血浆中氟甲喹对映体的方法。
[0004]为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案:一种检测人血浆中氟甲喹对映体的方法，包括以下步骤:1)用体积比90%:10%的异丙醇与正庚烷的混合物作为流动相将氟甲喹溶解并稀释配置成40-50iig/mL的溶液，并用微孔滤膜过滤后得到氟甲喹溶液备用;称取lmg普萘洛尔标准品，用体积比70%:30%的异丙醇与正庚烷的混合物定容至1」1001^，超声101^11后得到普萘洛尔溶液在4°C下保存备用；2)取成人血浆置于离心管中，加入步骤1)配置的氟甲喹溶液，料液比为lmL: 120-150mL，振荡后加入无水硫酸铜及单乙醇胺，8000-12000rpm离心处理l〇-15min，取上清液， 残渣用单乙醇胺溶解并离心处理，合并上清液，在上清液中加入人血浆1/2体积的普萘洛尔溶液，再加入人血浆30倍体积的MTBE，在14000rpm下离心5-10min，得到样品液；3)在步骤2)的样品液中加入样品液体积2-3倍的正己烷溶液，静置分层后弃正己烷层， 将剩余溶液过柱萃取，萃取完成后用去离子水淋洗，负压抽干，分2-5次洗脱，洗脱后的溶液在氮吹仪内于30_35°C水浴中，氮气吹干，残余物用乙醇复溶，微孔纳滤，滤液备用；4)采用高效液相色谱仪对步骤3)得到的滤液进行检测;检测时选用CHIRALCEL 0J-RH 手性柱，该手性柱的填料为5y硅胶表面涂布纤维素-10-羟基喜树碱。在本技术方案中，本发明所用的萃取方法效果好，时间短，降低了试剂的消耗量。
[0005]作为优选，步骤3)中，依次用甲醇、二对甲苯甲酰-1-酒石酸，含柠檬酸铁铵的水杨酸水溶液活化HLB固相萃取柱。
[0006]作为优选，水杨酸水溶液中水杨酸的质量分数为5-6.5%，柠檬酸铁铵的质量分数为0.4-0.7%。
[0007]作为优选，步骤3)洗脱液为含体积分数15%的甲醇溶液，过柱的流速为6-9mL/ min，洗脱液流速为1.2-1.5mL/min。[00〇8]作为优选，纤维素-10-轻基喜树碱的制备方法为:将纤维素纤维放入45-55 °C的质量分数为25-30%的氢氧化钾溶液中，然后加入纤维素纤维质量2倍的环氧季铵盐化合物和纤维素纤维质量5倍阳离子聚丙烯酰胺类化合物，55-85kw的功率下超声处理20-30min，然后升温至150°C，加入纤维素纤维质量10倍的10-羟基喜树碱，反应2-4h，冷却后水洗，用醋酸中和至中性。
[0009]作为优选，纤维素纤维为粘胶纤维或棉纤维。
[0010]作为优选，无水硫酸铜的加入量为人血浆的质量的3倍，单乙醇胺的加入量为lg人血浆加入20mL。[〇〇11] 作为优选，色谱条件为:色谱柱:CHIRALCEL 0J-RH;流动相:水-乙腈(82:18，v/v， 乙醇中含有体积比为〇.4 %的冰乙酸和0.5 %的醋酸铵)；流速:0.5mL/min ;检测波长: 294nm;进样量:2yL;柱温:40 °C。
[0012]作为优选，质谱条件为:三重串联四极杆质谱条件:离子模式:正离子电喷雾模式； 离子源气体1:60psi ;离子源气体2:60psi ;喷气压力:40psi ;碰流量:8L/min;离子喷雾电压:5500V;温度:500 °C本发明的有益效果是本发明对固相萃取条件进行了优化，使得固相萃取的时间缩短、 效率变高，而高效液相色谱方法分析氟甲喹对映体的浓度精度高，速度快，操作简单、成本较低;检测方法对目标化合物的线性关系好，回收率高，相对偏差小，使用的试剂低毒，使用量少，对环境友好。【附图说明】[〇〇13]图1是本发明实施例1中S-(-)-FLU的色谱图。
[0014]图2是本发明实施例1中R-( + )-FLU的色谱图。【具体实施方式】
[0015]下面通过【具体实施方式】对本发明做进一步的描述。
[0016]在本发明中，若非特指，所有设备和原料均可从市场购得或是本行业常用的，下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域常规方法。
[0017]高效液相色谱仪Agilent 1200购自安捷伦(中国)科技有限公司；质谱仪API6500 购自AB SCIEXOntar1，Canada;水浴氮吹仪WD-12购自河南天驰仪器设备有限公司；固相萃取仪HSE-12B购自天津市恒奥科技发展有限公司；固相萃取柱Waters Oasis HLB购自杭州伽钛科学仪器有限公司；冰乙酸(分析纯)、三乙胺(分析纯)购自国药集团化学试剂有限公司;氟甲喹购自大赛璐药物手性技术(上海)有限公司。
[0018]色谱条件为:色谱柱:CHIRALCEL 0J-RH;流动相:水-乙腈(82:18，v/v，乙醇中含有体积比为0.4%的冰乙酸和0.5%的醋酸铵)；流速:0.5mL/min;检测波长:294nm;进样量:2y L;柱温:40°C。
[0019]质谱条件为:三重串联四极杆质谱条件:离子模式:正离子电喷雾模式;离子源气体1:60psi ;离子源气体2:60psi ;喷气压力:40psi ;碰流量:8L/min;离子喷雾电压:5500V; 温度:500 °C。
[0020]实施例1一种检测人血浆中氟甲喹对映体的方法，包括以下步骤:1)用体积比90%:10%的异丙醇与正庚烷的混合物作为流动相将氟甲喹溶解并稀释配置成40iig/mL的溶液，并用微孔滤膜过滤后得到氟甲喹溶液备用;称取lmg普萘洛尔标准品， 用体积比70%:30%的异丙醇与正庚烷的混合物定容到100mL，超声lOmin后得到普萘洛尔溶液在4°C下保存备用；2)取成人血浆置于离心管中，加入步骤1)配置的氟甲喹溶液，料液比为lmL:120mL，振荡后加入无水硫酸铜及单乙醇胺，8000rpm离心处理lOmin，取上清液，残渣用单乙醇胺溶解并离心处理，合并上清液，在上清液中加入人血浆1/2体积的普萘洛尔溶液，再加入人血浆 30倍体积的MTBE，在14000rpm下离心5min，得到样品液;无水硫酸铜的加入量为人血衆的质量的3倍，单乙醇胺的加入量为lg人血浆加入20mL;3)在步骤2)的样品液中加入样品液体积2倍的正己烷溶液，静置分层后弃正己烷层，将剩余溶液过柱萃取，萃取完成后用去离子水淋洗，负压抽干，分2次洗脱，洗脱后的溶液在氮吹仪内于30°C水浴中，氮气吹干，残余物用乙醇复溶，微孔纳滤，滤液备用；依次用甲醇、二对甲苯甲酰-1-酒石酸，含柠檬酸铁铵的水杨酸水溶液活化HLB固相萃取柱;水杨酸水溶液中水杨酸的质量分数为5 %，柠檬酸铁铵的质量分数为0.4 % ;洗脱液为含体积分数15 %的甲醇溶液，过柱的流速为6mL/min，洗脱液流速为1.2mL/min;4)采用UFLC-MS/MS对步骤3)得到的滤液进行检测;检测时选用CHIRALCEL 0J-RH手性柱，该手性柱的填料为5y硅胶表面涂布纤维素-10-羟基喜树碱。
[0021]粘胶纤维-10-羟基喜树碱的制备方法为:将粘胶纤维放入45-55°C的质量分数为 25%的氢氧化钾溶液中，然后加入粘胶纤维质量2倍的环氧季铵盐化合物和粘胶纤维质量5 倍阳离子聚丙烯酰胺类化合物，55kw的功率下超声处理20min，然后升温至150°C，加入粘胶纤维质量10倍的10-羟基喜树碱，反应2h，冷却后水洗，用醋酸中和至中性。[〇〇22] 实施例2一种检测人血浆中氟甲喹对映体的方法，包括以下步骤:1)用体积比90%:10%的异丙醇与正庚烷的混合物作为流动相将氟甲喹溶解并稀释配置成45iig/mL的溶液，并用微孔滤膜过滤后得到氟甲喹溶液备用;称取lmg普萘洛尔标准品， 用体积比70%:30%的异丙醇与正庚烷的混合物定容到100mL，超声10min后得到普萘洛尔溶液在4°C下保存备用；2)取成人血浆置于离心管中，加入步骤1)配置的氟甲喹溶液，料液比为lmL:130mL，振荡后加入无水硫酸铜及单乙醇胺，lOOOOrpm离心处理12min，取上清液，残渣用单乙醇胺溶解并离心处理，合并上清液，在上清液中加入人血浆1/2体积的普萘洛尔溶液，再加入人血衆30倍体积的MTBE，在14000rpm下离心7min，得到样品液;无水硫酸铜的加入量为人血衆的质量的3倍，单乙醇胺的加入量为lg人血浆加入20mL;3)在步骤2)的样品液中加入样品液体积3倍的正己烷溶液，静置分层后弃正己烷层，将剩余溶液过柱萃取，萃取完成后用去离子水淋洗，负压抽干，分3次洗脱，洗脱后的溶液在氮吹仪内于32°C水浴中，氮气吹干，残余物用乙醇复溶，微孔纳滤，滤液备用；依次用甲醇、二对甲苯甲酰-1-酒石酸，含柠檬酸铁铵的水杨酸水溶液活化HLB固相萃取柱;水杨酸水溶液中水杨酸的质量分数为5.8 %，柠檬酸铁铵的质量分数为0.5 % ;洗脱液为含体积分数15 % 的甲醇溶液，过柱的流速为7mL/min，洗脱液流速为1.3mL/min;4)采用UFLC-MS/MS对步骤3)得到的滤液进行检测;检测时选用CHIRALCEL OJ-RH手性柱，该手性柱的填料为5y硅胶表面涂布纤维素-10-羟基喜树碱。[〇〇23]粘胶纤维-10-羟基喜树碱的制备方法为:将粘胶纤维放入50°C的质量分数为28% 的氢氧化钾溶液中，然后加入粘胶纤维质量2倍的环氧季铵盐化合物和粘胶纤维质量5倍阳离子聚丙烯酰胺类化合物，65kw的功率下超声处理25min，然后升温至150°C，加入粘胶纤维质量10倍的10-羟基喜树碱，反应3h，冷却后水洗，用醋酸中和至中性。[〇〇24] 实施例3一种检测人血浆中氟甲喹对映体的方法，包括以下步骤:1)用体积比90%:10%的异丙醇与正庚烷的混合物作为流动相将氟甲喹溶解并稀释配置成50iig/mL的溶液，并用微孔滤膜过滤后得到氟甲喹溶液备用;称取lmg普萘洛尔标准品， 用体积比70%:30%的异丙醇与正庚烷的混合物定容到100mL，超声lOmin后得到普萘洛尔溶液在4°C下保存备用；2)取成人血浆置于离心管中，加入步骤1)配置的氟甲喹溶液，料液比为lmL:150mL，振荡后加入无水硫酸铜及单乙醇胺，12000rpm离心处理10-15min，取上清液，残渣用单乙醇胺溶解并离心处理，合并上清液，在上清液中加入人血浆1/2体积的普萘洛尔溶液，再加入人血衆30倍体积的MTBE，在14000rpm下离心lOmin，得到样品液;无水硫酸铜的加入量为人血浆的质量的3倍，单乙醇胺的加入量为lg人血浆加入20mL;3)在步骤2)的样品液中加入样品液体积3倍的正己烷溶液，静置分层后弃正己烷层，将剩余溶液过柱萃取，萃取完成后用去离子水淋洗，负压抽干，分5次洗脱，洗脱后的溶液在氮吹仪内于35°C水浴中，氮气吹干，残余物用乙醇复溶，微孔纳滤，滤液备用；依次用甲醇、二对甲苯甲酰-1-酒石酸，含柠檬酸铁铵的水杨酸水溶液活化HLB固相萃取柱;水杨酸水溶液中水杨酸的质量分数为6.5 %，柠檬酸铁铵的质量分数为0.7 % ;洗脱液为含体积分数15 % 的甲醇溶液，过柱的流速为9mL/min，洗脱液流速为1.5mL/min;4)采用UFLC-MS/MS对步骤3)得到的滤液进行检测;检测时选用CHIRALCEL OJ-RH手性柱，该手性柱的填料为5y硅胶表面涂布纤维素-10-羟基喜树碱。[〇〇25]棉纤维-10-羟基喜树碱的制备方法为:将棉纤维放入55 °C的质量分数为30 %的氢氧化钾溶液中，然后加入棉纤维质量2倍的环氧季铵盐化合物和棉纤维质量5倍阳离子聚丙烯酰胺类化合物，85kw的功率下超声处理30min，然后升温至150°C，加入棉纤维质量10倍的 10-羟基喜树碱，反应2-4h，冷却后水洗，用醋酸中和至中性。[〇〇26]本发明实施例1的色谱图见图1。
[0027]经高效液相色谱仪检测后，记录峰面积，以氟甲喹对映体的浓度为横坐标，以相对应的峰面积为纵坐标，利用Analyst 1.6.2software from AB SCIEX进行线性拟合，S-(-)_FLU和R-( + )-FLU的回归方程。由结果可知，R2大于0 ? 995，S-( - )-FLU和R-( + )-FLU在0 ? 5ng/ ml_500ng/ml范围内线性良好。
[0028] S-( - )-FLU的回归方程:y = 0 ? 584x-0 ? 00935相关系数0 ? 9969线性范围(ng/ml) 0.5-500〇
[0029]R-( + )-FLU 的回归方程:y = 0.623x+0.0542 相关系数0.9960 线性范围(ng/ml )0.5-500〇
【主权项】
1.一种检测人血浆中氟甲喹对映体的方法，其特征在于，包括以下步骤:1)用体积比90%:10%的异丙醇与正庚烷的混合物作为流动相将氟甲喹溶解并稀释配 置成40-50iig/mL的溶液，并用微孔滤膜过滤后得到氟甲喹溶液备用;称取lmg普萘洛尔标准 品，用体积比70%:30%的异丙醇与正庚烷的混合物定容至1」1001^，超声101^11后得到普萘洛 尔溶液在4°C下保存备用；2 )取成人血浆置于离心管中，加入步骤1)配置的氟甲喹溶液，料液比为lmL:120-150mL，振荡后加入无水硫酸铜及单乙醇胺，8000-12000rpm离心处理l〇-15min，取上清液， 残渣用单乙醇胺溶解并离心处理，合并上清液，在上清液中加入人血浆1/2体积的普萘洛尔 溶液，再加入人血浆30倍体积的MTBE，在14000rpm下离心5-10min，得到样品液；3)在步骤2)的样品液中加入样品液体积2-3倍的正己烷溶液，静置分层后弃正己烷层， 将剩余溶液过柱萃取，萃取完成后用去离子水淋洗，负压抽干，分2-5次洗脱，洗脱后的溶液 在氮吹仪内于30_35°C水浴中，氮气吹干，残余物用乙醇复溶，微孔纳滤，滤液备用；4)采用UFLC-MS/MS对步骤3)得到的滤液进行检测；检测时选用CHIRALCEL OJ-RH手性 柱，该手性柱的填料为5y硅胶表面涂布纤维素-10-羟基喜树碱。2.根据权利要求1所述的一种检测人血浆中氟甲喹对映体的方法，其特征在于，步骤3) 中，依次用甲醇、二对甲苯甲酰-1-酒石酸，含柠檬酸铁铵的水杨酸水溶液活化HLB固相萃取 柱。3.根据权利要求2所述的一种检测人血浆中氟甲喹对映体的方法，其特征在于，水杨酸 水溶液中水杨酸的质量分数为5-6.5%，柠檬酸铁铵的质量分数为0.4-0.7%。4.根据权利要求1或2所述的一种检测人血浆中氟甲喹对映体的方法，其特征在于，步 骤3)洗脱液为含体积分数15 %的甲醇溶液，过柱的流速为6-9mL/min，洗脱液流速为1.2-1?5mL/min〇5.根据权利要求1或2或3所述的一种检测人血浆中氟甲喹对映体的方法，其特征在于， 纤维素-10-羟基喜树碱的制备方法为:将纤维素纤维放入45-55 °C的质量分数为25-30 %的 氢氧化钾溶液中，然后加入纤维素纤维质量2倍的环氧季铵盐化合物和纤维素纤维质量5倍 阳离子聚丙烯酰胺类化合物，55-85kw的功率下超声处理20-30min，然后升温至150°C，加入 纤维素纤维质量10倍的10-羟基喜树碱，反应2-4h，冷却后水洗，用醋酸中和至中性。6.根据权利要求5所述的一种检测人血浆中氟甲喹对映体的方法，其特征在于，纤维素 纤维为粘胶纤维或棉纤维。7.根据权利要求1或2或3所述的一种检测人血浆中氟甲喹对映体的方法，其特征在于， 无水硫酸铜的加入量为人血浆的质量的3倍，单乙醇胺的加入量为lg人血浆加入20mL。8.根据权利要求1或2或3所述的一种检测人血浆中氟甲喹对映体的方法，其特征在于， 色谱条件为:色谱柱:CHIRALCEL OJ-RH;流动相:水-乙腈(82:18，v/v，乙醇中含有体积比为 0.4%的冰乙酸和0.5 %的醋酸铵)；流速:0.5mL/min;检测波长:294nm;进样量:2yL;柱温: 4(TC〇9.根据权利要求1或2或3所述的一种检测人血浆中氟甲喹对映体的方法，其特征在于， 质谱条件为:三重串联四极杆质谱条件:离子模式:正离子电喷雾模式；离子源气体1: 60psi ;离子源气体2:60psi ;喷气压力:40psi ;碰流量:8L/min;离子喷雾电压:5500V;温度: 500。。。
【文档编号】G01N30/02GK105987970SQ201610394963
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2016年6月5日
【发明人】杨立业, 胡兆红, 欧阳小琨, 王阳光, 金如娜, 刘超, 王南
【申请人】浙江海洋大学