一种用于食品中肠侵袭性大肠杆菌检测的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于食品中肠侵袭性大肠杆菌检测的试剂盒。肠侵袭性大肠杆菌主要侵犯较大儿童和成人。不产生肠毒素，侵袭和破坏结肠粘膜上皮细胞。所致疾病象菌痢，有发热、腹痛、腹泻、脓血便及里急后重等症状。现有技术的检测方法耗时耗力，检测不便，而本发明提供了特异性检测肠侵袭性大肠杆菌的试剂盒，试剂盒中含有特异性结合肠侵袭性大肠杆菌的适配子，所述适配子为单链DNA。本发明试剂盒具有检测时间短、研发周期短、质量稳定、操作简单等优点，在食品与卫生安全检测中得到广泛应用。
【专利说明】一种用于食品中肠侵袭性大肠杆菌检测的试剂盒 发明领域
[0001] 本发明属于食品检测技术领域，具体涉及一种用于食品中肠侵袭性大肠杆菌检测 的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 据世界卫生组织统计，除中国外，全世界每年有10亿人患腹泻，其中5亿人发生在 第三世界，导致每年5百万小儿死亡；中国每年有8.36亿人次患腹泻，其中5岁以下小儿有3 亿人次。目前已知引起腹泻的病原体有数十种之多，中国国内报告以细菌性和病毒性腹泻 占多数。虽然不同自然环境、不同生产生活方式的地区引起腹泻病的主要病原体有所不同， 但统计表明致泻性大肠杆菌居第二位，为主要的致泻病原体。
[0003] EIEC是志贺菌样大肠杆菌。主要特点是能侵入大、小肠粘膜，穿入上皮细胞内，使 细胞蛋白溶解并在其中生长繁殖，使粘膜刷状缘受损，局部发生溃疡甚至出血，所以临床大 便表现似痢疾。其侵入性受控于在质粒，消除此质粒细菌即丧失其侵袭力，质粒可转移给无 毒力菌株。
[0004] 侵袭性大肠杆菌不产生肠毒素，而主要是侵入结肠粘膜内并增殖，引起有嗜中性 粒细胞等炎症细胞浸润的炎症反应，致使粪便中含有血细胞和粘液。
[0005] 目前，国内外在食品中大肠杆菌检测时常用的检测方法因其检测手段、识别对象 各有不同而各具优缺点。传统检测大肠杆菌的方法需要先分离再培养，然后用经典的方法 鉴定，耗时、不灵敏是这些方法普遍存在的问题。免疫学方法简单、方便、迅速、特异性较好， 但是仍有交叉反应比较严重、假阳性多、灵敏度偏低等不足之处。聚合酶链式反应(PCR)技 术虽具有准确、灵敏、快速的特点，但其在检测数目较多的样品时操作比较繁杂，因此在聚 合酶链式反应(PCR)技术的基础上又衍生出很多新型聚合酶链式反应(PCR)技术，如多重 PCR技术，然而多重PCR虽简化了PCR实验的操作，但是由于该技术需数对引物同时进行扩 增，很容易产生非特异性条带或假阳性，影响检测结果。
[0006] 通过指数富集配体的系统进化（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)技术筛选获得的寡核苷酸序列称为适配子(aptamer)。其 原理就是利用分子生物学技术，构建人工合成的单链随机寡核苷酸文库，其随机序列长度 在20-100个碱基左右，将随机寡核苷酸文库与靶分子相互作用，保留结合的寡核苷酸配基， 经反复扩增、筛选数个循环，即可使与该靶子特异结合的寡核苷酸序列得到富集，最终获得 靶分子的特异寡核苷酸配基。该技术具有库容量大、靶分子范围广、亲和力高、特异性强等 优点。在临床检测方面，特别是对一些未知的致病性细菌或病毒的研究，虽然不知道其内部 结构、功能以及这些物质的表位，但将其作为靶物质，通过SELEX技术筛选到其相应的适配 子，以检测靶物质，已成为该领域的研究热点。
[0007] 利用SELEX技术筛选获得的适配子识别分子的模式与蛋白抗体类似，但与蛋白类 抗体相比，核酸类配基具有更多的优越性，如不受免疫条件和免疫源性限制，可体外人工合 成，变性与复性可逆，可修饰并有利于长期保存和室温运输等。更重要的是，适配子的靶分 子更为广泛，包括金属离子、有机染料、氨基酸、细胞因子、辅因子、氨基糖苷、抗生素、碱基 类似物、核苷酸和多肽等。其中蛋白质类靶分子最多，包括酶、生长因子、抗体、转录因子、细 胞粘附分子和选择素等。完整的病毒颗粒和细菌病原体，甚至完整的细胞也可以通过复合 靶子SELEX技术或消减SELEX技术筛选出高亲和力的寡核苷酸配基。适配子比抗体具有更高 的特异性和精确识别能力，甚至能识别单抗不能区分的蛋白质分子。这些特性使得适配子 在生物医药和食品卫生研究领域得到广泛应用，成为不可缺少的有力工具。
【发明内容】
[0008] 本发明公开了一种高特异高敏感检测肠侵袭性大肠杆菌EIEC的方法，提高了它的 检测和诊断效率。
[0009] 为了解决现有大肠氏菌检测中存在的检测周期长、灵敏度低、假阳性多等问题，本 发明提供一种特异识别肠侵袭性大肠杆菌EIEC的试剂盒及其应用。
[0010] 上述试剂盒，适配子可以采用生物素标记。
[0011] 本发明中，所述的核酸适配体能够特异结合肠侵袭性大肠杆菌。
[0012] 本发明另外提供一种肠侵袭性大肠杆菌EIEC适配子的筛选方法。
[0013] 随机单链DNA文库和引物由上海生物工程有限公司合成。
[0014] 随机单链DNA文库：5 ' -TTGGACAGTGGACGTGAAGC(N36)GACCAAGTGACAGTGACGAG-3 ' (注:n36代表36个A、T、C、G碱基中任意一种的36个集合）。
[0015] 引物 1:5 ' - TTGGACAGTGGACGTGAAGC-3 '
[0016] 引物 Π : 5 ' -CTCGTCACTGTCACTTGGTC-3 '
[0017]
[0018] 引物IV: 5 ' -生物素-CTCGTCACTGTCACTTGGTC-3 '。
[0019] 2. SELEX筛选获得肠侵袭性大肠杆菌EIEC特异的寡核苷酸适配子
[0020] 1) SELEX 筛选过程：
[0021] a.首轮筛选，取合成的随机单链DNA 10yg加入到400ul IX结合缓冲液，95度变性 5min，然后迅速置于冰上lOmin;
[0022] b.加入lmL肠侵袭性大肠杆菌EIEC菌悬液2.0 X 108，于37°C摇床lOOrpm结合1.2小 时，使单链DNA文库与菌充分作用；
[0023] c.更换离心管，以去除与管壁结合的单链DNA，室温下离心10 OOOrpm离心10min分 离未与菌结合的单链DNA文库；
[0024] d.弃上清，加入600yL 1 X冲洗缓冲液，离心10 OOOrpm离心10min，重复此过程4 次，目的是洗去未与菌结合的核酸片段；
[0025] e ·接上步离心后去上清，加入100yL去离子水99°C加热3min，高速离心18 OOOrpm 离心15min弃沉淀，换管留上清(核酸片段存于上清中），-20°C保存备用。
[0026] 2)PCR富集与肠侵袭性大肠杆菌EIEC特异结合的寡核苷酸适配子：
[0027] 每轮筛选后获得的与肠侵袭性大肠杆菌EIEC特异结合的寡核苷酸适配子文库通 过PCR扩增得到富集；
[0028] a.以上述上清为模板，通过引物I和引物IV扩增产生一端带生物素标记的双链 DNA；
[0029] b. PCR扩增条件:95 °C预变性3min，然后进行30循环95 °C变性35s，60 °C退火37s，72 °C延伸33s，最后72°C延伸lOmin;
[0030] c. PCR产物纯化后，一端带生物素标记的双链DNA通过生物素-链亲合素之间的作 用与链亲合素交联的磁珠结合，经过IX连接（the standard Binding and Washing Buffer，B&W)缓冲液洗涤3次，用lOOmM的新鲜NaOH 37°C变性30min，使不带生物素的单链 DNA从链亲合素交联的磁珠上洗脱下来，测定其单链DNA的浓度，用作下一轮筛选的富集库。
[0031] 3)重复筛选:重复上述SELEX筛选过程和PCR扩增富集过程，共进行15轮筛选，其中 第7、12轮分别用克雷伯菌、肠出血性大肠杆菌进行反筛。
[0032]特异识别肠侵袭性大肠杆菌EIEC的寡核苷酸适配子的核苷酸序列如下：
[0054] 本发明通过SELEX技术的筛选过程，获得高亲和性特异识别肠侵袭性大肠杆菌 EIEC的寡核苷酸适配子(适配体），用于快速、准确检测肠侵袭性大肠杆菌EIEC。
[0055] 以上述核酸适配子筛选文库为基础，可对文库两端的固定序列的个别核苷酸进行 替换、颠倒、移位，或对其长度进行小幅延长或缩短，或对文库中间的随机序列进行延长或 缩短，或对扩增文库的引物作相应的简单改造，然后制备简单改造后的文库和引物进行核 酸适配子的筛选、PCR扩增和分析与应用。
[0056] 本发明的有益效果:本发明设计出了一个性能优秀的随机单链寡核苷酸文库。文 库具有接近长度下限的短固定序列和较长的随机序列，充分保证了文库中单链寡核苷酸的 多样性。文库固定序列（引物序列）的独特设计能使用高退火温度进行PCR扩增，既能有效获 得目的产物，又能有效抑制非特异性产物。本文库及引物应用于肠侵袭性大肠杆菌EIEC的 核酸适配子筛选获得成功，所述的适配子可以用于制备检测试剂盒，从而用于食品中的肠 侵袭性大肠杆菌EIEC的检测。本方法具有检测时间短、研发周期短、质量稳定、操作简单等 优点，在食品与卫生安全检测中能够得到广泛应用。
【具体实施方式】
[0057]实施例1肠侵袭性大肠杆菌EIEC菌液的制备
[0058]将侵袭性大肠杆菌0143菌株，在LB液体培养基试管中，37摄氏度，180r/min摇动过 夜，备用。
[0059] 实施例2适配子的获得
[0060] 1、随机单链DNA文库和引物由上海生物工程有限公司合成。
[0061 ]随机单链DNA文库：5 ' -TTGGACAGTGGACGTGAAGC(N36)GACCAAGTGACAGTGACGAG-3 ' (注:n36代表36个A、T、C、G碱基中任意一种的35个集合）。
[0062] 引物 1:5 ' - TTGGACAGTGGACGTGAAGC-3 '
[0063] 引物 Π : 5 ' -CTCGTCACTGTCACTTGGTC-3 '
[0064] 引物 m : 5 地高辛-TTGGACAGTGGACGTGAAGC-3 '
[0065] 引物IV: 5 ' -生物素-CTCGTCACTGTCACTTGGTC-3 '。
[0066] 2. SELEX筛选获得肠侵袭性大肠杆菌EIEC特异的寡核苷酸适配子
[0067] 1)SELEX 筛选过程：
[0068] a.首轮筛选，取合成的随机单链DNA 10yg加入到400ul IX结合缓冲液，95度变性 5min，然后迅速置于冰上lOmin;
[0069] b ·加入lmL肠侵袭性大肠杆菌EIEC菌悬液2 · 0 X 108，于37°C摇床lOOrpm结合1 · 2小 时，使单链DNA文库与菌充分作用；
[0070] C.更换离心管，以去除与管壁结合的单链DNA，室温下离心10 OOOrpm离心10min分 离未与菌结合的单链DNA文库；
[0071] d.弃上清，加入600yL 1 X冲洗缓冲液，离心10 OOOrpm离心10min，重复此过程4 次，目的是洗去未与菌结合的核酸片段；
[0072] e ·接上步离心后去上清，加入100yL去离子水99°C加热3min，高速离心18 OOOrpm 离心15min弃沉淀，换管留上清(核酸片段存于上清中），-20°C保存备用。
[0073] 2)PCR富集与肠侵袭性大肠杆菌EIEC特异结合的寡核苷酸适配子：
[0074]每轮筛选后获得的与肠侵袭性大肠杆菌EIEC特异结合的寡核苷酸适配子文库通 过PCR扩增得到富集；
[0075] a.以上述上清为模板，通过引物I和引物IV扩增产生一端带生物素标记的双链 DNA；
[0076] b. PCR扩增条件:95 °C预变性3min，然后进行30循环95 °C变性35s，60 °C退火37s，72 °C延伸33s，最后72 °C延伸lOmin;
[0077] c. PCR产物纯化后，一端带生物素标记的双链DNA通过生物素-链亲合素之间的作 用与链亲合素交联的磁珠结合，经过IX连接（the standard Binding and Washing Buffer，B&W)缓冲液洗涤3次，用lOOmM的新鲜NaOH 37°C变性30min，使不带生物素的单链 DNA从链亲合素交联的磁珠上洗脱下来，测定其单链DNA的浓度，用作下一轮筛选的富集库。 [0078] 3)重复筛选:重复上述SELEX筛选过程和PCR扩增富集过程，共进行15轮筛选，其中 第7、12轮分别用克雷伯菌、肠出血性大肠杆菌进行反筛。
[0079] 4)富集寡核苷酸适配子与菌结合率的测定：
[0080] 第8、13、14、15轮SELEX筛选的产物，以标记地高辛的引物ΙΠ和标记生物素的引物 IV进行PCR扩增，纯化的PCR产物与链亲和素标记的磁珠充分反应并用NaOH解链，地高辛标 记的单链DNA游离在上清中；
[0081] 5)富集寡核苷酸适配子文库的测序结果与分析：
[0082] a.将最后的富集文库扩增为双链，连接pEGM-T载体，转化E. coli DH5a，随机挑取 70个阳性克隆进行DNA序列测定，其中21个为可用序列，见SEQ ID NO: 1-21所示；
[0083] 实施例3结合特性验证
[0084] 将适配子分别取1.5yg，用牛小肠碱性磷酸酶(CIP)37°C消化lh，纯化回收去磷酸 化的DNA;通过T4多核苷酸激酶标记[γ-32P]ATP于去磷酸化的DNA分子末端。lOnmol放射性 标记的DNA适配子分别与不同浓度的菌体37°C孵育30min，各组反应液经硝酸纤维素膜滤 过，洗涤滤膜，干燥滤膜，液闪计数仪测定滤膜上残留的放射量，同一样品平行做两次测定。 计算各个适配子与菌体的解离常数。结果如下：
[0087]从以上结果可以看出，本发明的21个适配子具有非常强的结合特性，现有技术中 也没有所述结合特性的适配子能够结合所述的菌体。
[0088]实施例5菌体的鉴定
[0089]寡核苷酸适配子SEQ ID N0:1-21的序列送上海生物工程有限公司合成并在5'端 标记羟基荧光素(FAM)。
[0090] 取5'FAM荧光标记的寡核苷酸适配子SEQ ID N0:l-21(100nM)各300yL，分别与肠 侵袭性大肠杆菌EIEC，肠致病性大肠杆菌，肠出血性大肠杆菌、化脓性链球菌、金黄色葡萄 球菌、沙门氏菌（1.5X108)于37°C孵育lh，用lXBB(50mM Tris-HCl(pH 7.4)，5mM KC1, IOOmM NaCl,ImMMgC12)洗涤2次后，将菌体重悬于500yL IX B B，用BD FACSC alibur流式 细胞分析仪检测结合上FAM标记的适配子的菌体百分率(测三次取平均值），结果显示肠侵 袭性大肠杆菌EIEC寡核苷酸适配子竞争结合肠侵袭性大肠杆菌EIEC的能力为99.8%，而针 对肠致病性大肠杆菌，肠出血性大肠杆菌、化脓性链球菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌菌没 有结合率。
[0091] 这充分说明，本发明的适配子具有较好的特异性和稳定性。
[0092] 以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人 员来说，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本 发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种用于食品中肠侵袭性大肠杆菌检测的试剂盒，其含有能特异性结合肠侵袭性大 肠杆菌的核酸适体。2. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述核酸适体序列如SEQ ID No: 1-21任一 所示。3. -种检测食品中肠侵袭性大肠杆菌的方法，其特征在于利用权利要求1-2任一项所 述的试剂盒。
【文档编号】G01N33/569GK106018803SQ201610483845
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月27日
【发明人】杨国林
【申请人】杨国林