同时确定血清学特征和评估hiv感染后持续时间的方法

同时确定血清学特征和评估hiv感染后持续时间的方法
【专利摘要】本发明公开了同时检测针对人免疫缺陷病毒(HIV)的两种或更多种抗原的抗体和确定HIV感染后的大概时间(持续时间)，从而确认感染，和确定HIV感染的近度的方法和其变型。在给定时间段内最近感染HIV的个体的数量可进一步用于评估群体中HIV的发病率。
【专利说明】同时确定血清学特征和评估ΗIV感染后持续时间的方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求于2014年10月8日提交的美国临时申请号62/061,569的益处，其通过 引用以其整体并入本文。
技术领域
[0003] 本发明涉及同时确定针对人免疫缺陷病毒(HIV)的两种或更多种抗原的抗体和确 定HIV感染后的大概时间（持续时间），从而确认感染，以及确定HIV感染的近度的方法。在给 定时间段内最近感染HIV的个体的数量可进一步用于评估群体中HIV的发病率。
【背景技术】
[0004] 人免疫缺陷病毒(HIV)的感染使得病毒在Τ淋巴细胞中复制。HIV的复制使得病毒 组分，例如，核酸和蛋白质的量增加。病毒蛋白质的产生引起宿主的免疫应答，包括产生特 异性针对HIV抗原的抗体。可通过直接检测病毒组分，即，病毒核酸或蛋白质或间接检测引 起的针对HIV抗原的抗体实现HIV感染的诊断。因为可使用各种方法，例如，聚合酶链式反应 (PCR)扩增核酸，所以可在感染之后的最早的近度检测到病毒核酸，随后检测到病毒蛋白 质，和再之后检测到针对病毒抗原特异性的抗体。
[0005] HIV感染的确诊通常涉及两个步骤:使用HIV诊断测试的初始诊断，随后使用更特 异性的确认试验来确认初始有反应性的样品。经检测对HIV抗原特异性抗体的HIV感染的初 始诊断是最经济和广泛使用的用于HIV感染诊断的方法。这些试验或测试通常称为诊断或 筛选试验或测试。检测样品中HIV抗体的最常用试验是称为酶免疫试验(EIA)、酶联免疫吸 附试验(ELISA)和基于侧流的免疫试验的那些试验。因为这些方法可产生假阳性测试结果， 通过这些试验测试为阳性的样品需要进一步测试，以使用通常称为HIV确认试验或HIV补充 试验的另一类型的试验来确认感染。
[0006] -种常用的确认试验是蛋白质印迹试验，其能够检测和区分针对大于一种HIV抗 原的抗体。当使用蛋白质印迹试验，样品中的抗体与下述任何两种或更多种HIV抗原反应 时，确认HIV感染:p24、p65、gp41和/或gpl20/gpl60。但是，进行蛋白质印迹试验是浪费时间 的和劳动密集的，并且结果通常非常主观。
[0007] 最近这些年，已经认识到在没有有效的疫苗或治疗疗法的情况下，如今进一步减 少HIV扩散的最有效方式是预防。所以，大量的努力和资源被投入到各种HIV预防程序中。可 通过测量群体中新的感染率或发病率来监测预防程序的效果。传统上，通过跟踪代表群体 的研究组来确定HI V发病率，其是昂贵且困难的方法。因此，开发了 HIV感染"摄政 (regency)"或近度(recency)试验。这些试验设计为确定感染是否是最近出现的（例如，12 个月内）。某些时间段，例如6个月、12个月、18个月、或24个月内群体中最近感染率是群体的 HIV发病率。HIV发病率是用于流行病学表征、评估HIV/AIDS预防程序的效果以及设计和评 估HIV干预试验的重要手段。
[0008] 已经为HIV近度试验开发了三种不同类型的血清学试验。这些试验包括本质上评 估在一个近度的抗体滴度的"失谐(detuned)"试验、测量与总的IgG相比抗HIV抗原的IgG百 分数的BED-CEIA试验，以及测量抗体-抗原结合强度的亲和力试验。这些试验中，亲和力试 验好像是用于HIV感染的近度确定的最精确试验。一种亲和力试验使用用于近度确定的次 包被的（undercoated，未完全包被的）固相，其称为限制抗原亲和力EIA或LAg亲和力-EIA， 如在科学出版物中公开(Wei等，Aids Res Hum Retroviruses.2010;26:61 和Duong等，PLoS One. 2012; 7: e33328)，其仅仅作为参考引入本文。LAg亲和力-EIA是基于这样的观察:越长 的HIV感染产生越多的针对HIV抗原具有较高亲和性（即，强的结合)和/或更好的亲和力的 抗体并且因此越多的结合的抗体，即使在具有次包被抗原的固相上。
[0009] 但是，这些近度试验可仅仅用于先前已经确认HIV抗体阳性的样品，即，已经使用 确认试验进行了测试的那些样品。因为初始HIV-1诊断和近度试验的分离，并非所有的HV-1 阳性样品测试为新的感染，从而导致群体中的发病率的评估可能不精确。而且，因为对于样 品的HIV感染近度确定至少进行两个试验，因此评估群体中的HIV近度仍是昂贵的。
[0010] 本发明提供了将HIV感染近度试验并入确认试验的方法，从而由试验确认的所有 HIV阳性样品将自动具有近度试验结果。广泛采用该试验将显著增加 HIV发病率评估的样品 量，使得更精确评估群体中的HIV发病率。因为无论如何初始对于HIV诊断试验有反应性的 所有样品都应通过确认试验，所以当HIV近度试验并入确认试验时，获得用于评估群体中 HIV发病率的明显更多近度试验结果的成本并不会显著大于进行确认试验本身。
[0011] 根据本发明，各种另外的功能可添加至试验。功能包括但不限于区分HIV-ι和HIV-2感染和诊断具有未知状态HIV感染的样品。

【发明内容】

[0012] 在一个实施方式中，提供了确定HIV感染和评估HIV感染近度的方法，该方法包括 下述步骤:a)提供包含HIV特异性抗体的样品；b)对样品进行HIV感染确认试验;和c)对样品 进行HI V感染近度确定试验;其中步骤(b)和步骤(c)同时进行，从而能够同时确定样品中的 HIV感染和HIV感染近度。在一些实施方式中，该方法进一步包括下述步骤:d)对样品进行 !11￥-1/!11￥-2感染区分试验 ;从而能够区分样品中的!11￥-1和!11￥-2感染。
[0013] 在其他实施方式中，HI V感染确认试验是免疫试验，其包括包被对HI V抗体特异性 的抗原的多个固相。在进一步的实施方式中，多个固相的每一个包被有源自HIV gag基因、 HIV env基因或HIV pol基因的不同HIV抗原。在另外的实施方式中，源自HIV gag基因的不 同HIV抗原是衣壳蛋白p24或其片段、变体或衍生物。在进一步的实施方式中，源自HIV env 基因的不同HIV抗原是包膜蛋白gpl60、gpl20或gp41或其片段、变体或衍生物。在另外的实 施方式中，源自HIV pol基因的不同HIV抗原是调节蛋白p65或其片段、变体或衍生物。在进 一步的实施方式中，当HIV感染确认试验检测到针对至少两种HIV基因产物的HIV特异性抗 体时，样品被确认为HIV阳性样品。
[0014] 在其他实施方式中，HI V感染近度确定试验是免疫试验，其包括次包被有HI V抗原 的固相。在进一步的实施方式中，使用另外的固相，其包被有最佳量的与次包被相同的HIV 抗原。在另外的实施方式中，近度确定试验包括检测来自固相的信号和使用信号确定样品 是否来自最近感染HIV的个体。在进一步的实施方式中，当信号低于截止值时，样品来自最 近感染HIV的个体。
[0015] 在其他实施方式中，HIV-1/HIV2感染区分试验是免疫试验，其包括包被有源自 HIV-2基因的抗原或其片段、变体或衍生物的固相。在进一步的实施方式中，免疫试验进一 步包括第二固相，其包被有源自HIV-2基因的第二抗原或其片段、变体或衍生物。在另外的 实施方式中，HI V-2特异性抗原是GANN-5肽或其片段、变体或衍生物。在进一步的实施方式 中，当包被固相的HIV-2特异性抗原或其片段、变体或衍生物对于样品中的两个或更多个抗 体有反应性时，样品被确认为HI V-2阳性样品。
[0016] 在其他实施方式中，HIV感染确认试验、HIV感染近度确定试验和HIV-1/HIV-2感染 区分试验中的固相由相同的材料制备并且在各自的反应容器中。在另外的实施方式中，将 反应容器组织为适于进行检测样品中抗体的条状容器。在进一步的实施方式中，条状容器 是包括多个孔的条状微孔平板。在另外的实施方式中，反应容器是微流体设备中分开的通 道。在进一步的实施方式中，反应容器是滤纸片上适合基于侧流或流通的试验的不同点。在 另外的实施方式中，反应容器是用不同的标记物编码的不同微粒。
[0017] 在其他实施方式中，HIV感染确认试验、HIV感染近度确定试验和HIV-1/HIV-2感染 区分试验各自是酶联免疫吸附试验(ELISA)或酶免疫试验(EIA)。在其他实施方式中，当样 品之前还未用HIV诊断或筛选试验测试时，试验包括HIV感染诊断或筛选试验。
[0018] 在其他实施方式中，提供了评估群体中HIV发病率的方法，该方法包括:a)提供包 括HIV特异性抗体的一组样品，其中该组样品源自一个时间段内群体中的多个个体;b)对该 组样品进行HIV感染近度确定试验；c)确定该时间段内最近HIV感染的百分数;其中该时间 段内最近HIV感染的百分数提供了群体中HIV发病率的评估。在进一步的实施方式中，时间 段是6个月、12个月、18个月或24个月。在另外的实施方式中，HIV感染近度确定试验是免疫 试验，其包括次包被有HIV抗原的固相。在进一步的实施方式中，使用另外的固相，其包被有 最佳量的与次包被相同的HIV抗原。在另外的实施方式中，试验包括检测来自固相的信号和 使用信号确定该组样品中的样品是否来自最近感染HIV的个体。在另外的实施方式中，当信 号低于截止值时，样品来自最近感染HIV的个体。
[0019] 附图简述
[0020] 已经如此大体上描述了本发明，现参考没有必要按比例绘制的附图，并且其中：
[0021] 图1显示了包被有HIV-ι和HIV-2抗原的8孔条状微孔的图，所述HIV-ι和HIV-2抗原 用于确认和确定HIV感染的近度以及区分HIV-1和HIV-2感染。图中显示的是第一抗原(孔D、 E、F和H)、第二抗原(孔C和G)、第三抗原(孔B)以及未包被有HIV抗原的对照孔(孔A)。该设计 用在实施例2和3中。
[0022]图2显示了来自SeraCare的HIV-1近度/流行性能平板PRB-601的样品的近度因子 (R-因子）图。R-因子值被分成两个组:所有的近度样品属于低R-因子组1，而所有的流行样 品属于高R-因子组2。
[0023]图3显示了包被有HIV-1和HIV-2抗原的8孔条状微孔的变化的图，所述HIV-1和 HIV-2抗原用于确认和确定HIV感染的近度以及区分HIV-1和HIV-2感染。图中显示的是第一 抗原(孔D、E、F和H)、第二抗原(孔C和G)、第三抗原(孔B)以及未包被有HIV抗原的对照孔(孔 A)。该设计更详细描述在实施例4中。
[0024]发明详述
[0025]下文将参考显示了本发明的一些但是不是所有的实施方式的附图更充分描述本 发明。遍及全文，相同的数值表示相同的元件。本发明可具体化为许多不同的形式并且不应 解释为限于本文阐释的实施方式;而是，提供这些实施方式，使得本公开满足适当的法律要 求。的确，本发明所属技术领域的技术人员在具有了前述说明书和相关附图中呈现的教导 的好处下，能想到本文阐释的本发明的许多修饰和其他实施方式。所以，应当理解本发明不 限于公开的【具体实施方式】并且期望修饰和其他实施方式包括在所附权利要求的范围内。
[0026] 本发明提供了一种方法，其将HIV感染近度试验并入确认试验、HIV-1与HIV-2感染 的鉴定和/或HIV感染的诊断/筛选试验。近度数据可用于评估HIV发病率，即，给定的群体中 给定的时间段，例如1年内最近HIV感染的百分数。HIV发病率是用于流行病学表征、评估 HIV/AIDS预防程序的效果，以及设计和评估HIV干预试验的重要手段。
[0027] 在许多国家中，对于用诊断或筛选试验初始测试有反应性的样品强制进行HIV感 染的确认试验。本发明的实施方式将近度试验模块并入HIV确认试验模块，从而当样品用根 据本发明的测试确认HIV阳性时自动和同时产生近度试验结果。在另一实施方式中，将用于 区分HIV-1和HIV-2感染的另外模块并入试验，使得试验确认HIV感染、断定感染是否是最近 感染并且确定其是否是HIV-1和/或HIV-2感染。在仍另一实施方式中，试验用于筛选具有 HIV感染的未知HIV感染状态的样品。
[0028] HIV确认和近度试验模块是免疫试验，其组织为使两个模块如单个试验同时进行 的方式。免疫试验通常使用包被在固相上的HIV抗原，用于检测样品中HIV抗体。适当的固相 的例子包括但不限于微孔平板孔、条状微孔平板和其他确保多通道的固相。HIV感染确认模 块由两个或更多个固相组成，每个固相包被有源自不同HIV基因的HIV抗原。如果检测到针 对两种或更多种源自不同HIV基因的个体HIV抗原的抗体，则确认HIV感染。近度试验模块可 以是任何血清学试验，只要其与HIV感染确认模块兼容，即，其可与确认试验同时进行。近度 试验模块的例子是次包被有HIV抗原，即，包被小于最佳量的HIV抗原比如HIV-lgpl60的固 相。
[0029] 因为抗HIV抗原的抗体滴度和对于HIV抗原的亲和力在感染之后随着时间的推移 而增加，亲和力和/或抗体滴度测量试验可用于HIV感染的近度确定。例如，来自次包被抗原 的固相的信号强度已经显示与HIV感染的近度密切负相关。使用用于近度确定的次包被的 固相的试验称为限制抗原亲和力EIA或LAg亲和力-EIA，如在科学出版物中显示(Wei等， Aids Res Hum Retroviruses.2010;26:61 和Duong等，PLoS One.2012;7:e33328)，其仅仅 作为参考引入本文。在某些实施方式中，具有次包被的HIV抗原的固相被并入HIV确认测定， 用于确定HIV感染的近度。
[0030] 在另一实施方式中，抗原被包被在两个固相中，一个固相是最佳包被的，而另一个 固相是次包被的；来自两个固相的信号一起用于确定HIV感染的近度。例如，用于最佳包被 固相和次包被固相的信号倍数用于指示感染的近度。应理解，用于近度确定的HIV抗原对于 广谱的HIV-1毒株或分支都是有反应性的，使得毒株差异不会造成次包被的固相的信号强 度的显著差异。由对于所有主要HIV-1组Μ分支的免疫显性结构域组成的复合HIV-1抗原可 用于检测近度，如在科学出版物中描述(Wei等，Aids Res Hum Retroviruses 2010;26:61_ 71)。也应理解，用于最佳包被和/或次包被固相的条件以及用于近度检测的截止值需要根 据实验确定。因为世界上HIV-1的感染主要类型的HIV，所以近度的检测可集中在HIV-1感染 上。
[0031]在其他实施方式中，将用于区分HIV-ι和HIV-2感染的模块并入试验。尽管HIV-2感 染局限于世界上的某些地区，但是并入HIV-2区分模块将有助于使用和采用本发明中描述 的HIV感染确认和近度试验。可使用包被HIV-2特异性抗体的另外固相。这样的抗原的例子 是GANN-5抗原，其对于HIV-2感染是特异性的。针对HIV-2特异性抗原的抗体的存在表示 HIV-2感染或HIV-1/HIV-2同时感染。
[0032]血清学试验也通常用于使用具有未知HIV感染状态的样品的诊断/筛选HIV感染。 确认模块也可用于使用还未用血清学诊断/筛选试验测试的样品筛选HIV感染。因此，在某 些实施方式中，本发明中描述的试验可用于同时诊断/筛选HIV感染、确认感染、区分HIV-1 和HIV-2感染和确定HIV感染近度。
[0033] 参考表1更好地理解本发明，表1列举了由HIV基因组编码的蛋白质。有三类HIV蛋 白：病毒结构蛋白、基本调节蛋白/元件和辅助调节蛋白。三个病毒结构蛋白，包膜蛋白 gpl20和gp41(或未切割的包膜蛋白gpl60)、衣壳蛋白（CA或p24)和逆转录酶(p65)通常用于 检测样品中的HIV抗体。免疫试验通常包含这些蛋白质的组合，其作为混合物包被至固相用 于检测针对这些抗原的抗体。当免疫试验中的样品对抗原有反应性时，使用可区分哪种HIV 抗原对样品中的抗体有反应性的确认试验，比如蛋白质印迹试验进一步测试样品。当试验 检测到样品中存在针对至少两个基因产物，例如，gpl60和p24的抗体时，确认获得样品的个 体具有HIV感染。
[0034] 表1:由HIV基因组编码的蛋白质
[0035]
[0036] 为了检测和区分针对不同抗原的抗体，将不同的抗原包被在可区分的固相上。适 当的固相包括但不限于微孔平板孔、颜色编码的微粒和微阵列，其中微孔、用特定颜色或微 阵列中特定的点或位置编码的微粒用特定的HIV抗原包被。通过条中微孔的位置、微粒的颜 色或微阵列中的位置区分不同的HIV抗原。可将对抗原特异性的抗体捕获在固相上并且随 后检测。在一个实施方式中，将不同的抗原包被在条状微孔上。将至少两个第一抗原，例如 gpl60和p24,分别以最佳浓度包被在两个分开的微孔上并且然后将一个或两个以减少的浓 度包被在两个不同的孔上；以减小的浓度包被在固相上的第一抗原称为第二抗原。任选地， pol基因产物可作为第三抗原以最佳浓度包被在另一孔上。当第二抗原单独使用或结合来 自第一抗原的信号用于确定HIV近度时，包被第一抗原的孔用于确认HIV的感染。第三抗原 可用于提供确定HIV近度的另外信息。
[0037]许多方法可用于检测对HIV抗原特异性的抗体的存在。在典型的夹心形式中，用缀 合酶，比如辣根过氧化氢酶(HRP)的二抗，即，山羊抗人I gG抗体检测经包被的HI V抗原与固 相结合的人抗体。冲洗之后，使用底物检测与固体表面结合的酶。在其他实施方式中，酶直 接结合与包被在固相上的抗原相同的抗原。因为抗体中有两个结合位点，所以可用缀合可 检测的酶比如HRP的抗原检测对HIV抗原特异性的抗体的存在。
[0038]可对上述试验作出改变。在一些实施方式中，阴性对照，包被HIV-2特异性抗原和/ 或HIV-1组0抗原的固相可添加至试验。阴性对照可以是没有任何包被的HIV抗原的固相。 HIV-2特异性抗原可以是HIV-2特异性肽，比如与牛血清白蛋白（BSA)缀合的GANN-5肽。所 以，HIV-1组0特异性抗原也可以是与BSA缀合的肽。
[0039] 在其他实施方式中，固相是颜色编码的微粒。不同的HIV抗原包被在用不同颜色编 码的微粒上。可通过用不同颜色的荧光分子嵌入微粒来实现微粒的颜色编码。HIV抗原包被 在用一种颜色编码的微粒上。可用标记不同的荧光分子的二抗或用标记荧光分子的相同抗 原检测结合的对HIV抗原特异性的抗体。微粒可被分开并且使用流式细胞计数器检测。在另 一实施方式中，固相是微阵列或类似平台中的点。将第一、第二和任选地第三抗原沉积在微 阵列中的不同点上。可用结合可检测的酶或化学物质，比如荧光分子的二抗或抗原检测结 合的抗体。
[0040] 如本文所使用，"蛋白质片段"是蛋白质的区段、结构域、部分或区域，其占蛋白质 氨基酸序列的小于100%。例如，蛋白质片段可包括所述蛋白质的至多99%、95%、90%、 85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、 10%、5%、3%、2%或1%。在具体的方面中，蛋白质片段可包括，例如，!11￥抗原的至少5、10、 20、30、40、50 60、70、80、90、100、120、140、150、200、250、300、350、400、450或500个连续氨 基酸。肽可以是蛋白质片段，例如包括至少6、10、12、15、20、30、40和至多50个连续氨基酸。 [0041 ]如本文所使用，"变体"它们的范围包括天然存在的变体，比如例如等位基因变体、 直向同源物和同系物和人工产生的变体。本文使用的术语"突变体"、"突变"和"突变的"一 般指包括引入分离的蛋白质或其片段的保守或非保守氨基酸替换、缺失和/或插入。一般而 言，蛋白质变体与分离的感兴趣的蛋白质具有至少80 %的氨基酸序列同一性。在本发明的 某些方面中，蛋白质变体与分离的感兴趣的蛋白质具有至少85%、90%、91 %、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%或99%氨基酸序列同一性。用于描述各自核酸或蛋白质之间序 列关系的术语包括"比较窗口"、"序列同一性"、"序列同一性的百分数"和"基本同一性"。因 为各自的核苷酸或氨基酸序列可分别包括：（1)各个核酸或蛋白质共有的完整序列的仅仅 一个或多个部分，和(2)核酸或蛋白质之间不同的一个或多个部分，所以通常通过对"比较 窗口"比较序列来进行序列比较，以鉴定和比较序列相似性的局部区域。"比较窗口"指概念 上的区段，其通常具有与参考序列比较的至少6、10、12、20或更多个连续残基。与参考序列 (不包括添加或缺失)相比，比较窗口可包括约20%或更少的（例如5、10或15%)添加或缺失 (即，缺口），用于各自序列的最佳比对。用于对齐比较窗口的序列的最佳比对可通过计算机 化执行的算法（例如WebAngis GCG，2D Angis提供的ECLUSTALW和BESTFIT，GCG和GeneDoc程 序，通过参考并入本文)或通过选择的各种方法的任何一种产生的观察和最佳比对（即，在 比较窗口中产生最高的同源性百分数)来进行。
[0042]如本文所使用，"衍生的蛋白质"是包括感兴趣的氨基酸序列的一个或多个化学 和/或结构修饰或改变。仅仅作为例子，衍生的蛋白质可包括一个或多个修饰，包括氨基酸 侧链修饰、非天然氨基酸、糖基化氨基酸残基、交联的氨基酸残基和/或另外的氨基酸残基。 衍生物的范围也包括分离的融合蛋白，其包括另外的氨基酸序列，比如N-或C-末端融合伴 侣序列。
[0043]分离的感兴趣的蛋白质，比如HIV抗原，包括片段、变体和衍生物，可以以重组或化 学合成形式制备。一般而言，重组蛋白可常规上由本领域技术人员使用本领域熟知的标准 方案制备。 实施例
[0044] 包括下述实施例，以为本领域普通技术人员提供用于实施本公开主题的代表性实 施方式的指南。根据本公开和本领域的一般水平，本领域技术人员可认识到下述实施例旨 在仅仅是示例性的并且在不背离本公开主题的情况下可采用许多改变、修饰和变化。下述 合成描述具体实施例仅仅期望为了阐释的目的，并且绝不解释为限制性的，以通过其他方 法制备本发明的化合物。
[0045] 实施例1
[0046] 用于确认HIV感染和确定HIV感染的近度的条状孔试验
[0047]该实施例使用包含12个条的标准微孔平板。每个条包含8个孔。微孔用作包被有 HI V抗原的固相。如图1中阐释，条中的八个微孔包被HI V-1和HI V-2抗原，用于确认HI V-1或 HIV-2感染和确定HIV感染的近度。
[0048]用于HIV-1的第一抗原是gpl60、gp41和p24，其包被在孔D、E和F中，而用于HIV-2的 第一抗原是与BSA结合的GANN-5肽，其包被在孔Η中。用于HIV-1和HIV-2的第二抗原是gpl60 和与结合BSA的GANN-5肽，其分别以与对应的第一抗原相比减少的浓度包被在孔C和G中。第 三抗原是P〇l基因产物(本文称为P65)，其以最佳浓度包被在孔B上。另外，阴性对照孔(孔A) 不包含包被的HIV抗原。
[0049] 因为预期来自最近感染HIV的个体的样品包含较小的抗体滴度和较少的亲和力抗 体，所以预期在包被第二抗原的孔中几乎没有信号，而在包被第一抗原的孔中仍可以明显 的信号水平检测到抗体。
[0050] 实施例2
[00511 用于诊断和/或确认HIV感染的试验
[0052]在哺乳细胞系（用于gpl60)或大肠杆菌（用于gp41、p24和pol基因产物）中产生与 !11￥-18?16〇4?41、？24和全长?〇1基因产物基本上等价的重组蛋白。合成!11￥-264顺-5肽并 且使用成熟的化学方法与BSA结合。将最佳浓度的HIV-lgpl60、gp41、p24、pol基因产物 (p65)和与BSA结合的HIV-2GANN-5肽分别包被在孔D、E、F、B和Η中。将减少浓度的HIV-lgpl60和与BSA结合的HIV-2GANN-5肽分别包被至在C和G中。孔Α中不包被抗原，其用作阴性 对照。
[0053] 为了检测对gpl60、gp41、p65和HIV-2GNN-5特异性的抗体，将这些HIV抗原（gpl60、 p65和HIV-2GANN-5)缀合至辣根过氧化物酶(HRP)。为了检测p24,使用生物素化的p24和抗 生物素蛋白-HRP缀合物。
[0054]为了进行检测，首先将抗原包被的条状微孔浸渍在80微升的样品稀释剂缓冲液， 比如PBS中，随后向每个孔添加20微升的样品。温育之后，去除样品并且然后用冲洗缓冲液 冲洗四次。然后用包含生物素化的P24的溶液温育孔。冲洗之后，孔装载包含缀合gpl60、 p65、HIV-2GANN-5和抗生物素蛋白的HRP的溶液。温育之后，去除孔中的溶液并且冲洗孔四 次。用包含HRP底物3，3 '，5，5 ' -四甲基联苯胺（TMB)的溶液检测捕获的HRP，所述底物在与 HRP反应之后改变颜色。应理解，需要为每个试验优化试验条件，比如温育时间和温度。
[0055] 可通过对用阴性对照样品温育的条中所有孔的吸光度取平均值来确定截止值。大 于截止值的信号（即，信号与截止值之比，S/C0,大于1.0)视为阳性。如果两个或更多个第一 HI V-1抗原孔的S/C0值大于1.0，那么贡献样品的个体确认为HI V-1感染阳性。
[0056] 基本上如上述进行试验并且用于检测人样品。根据上述方案测试十个阴性人血清 和十个阴性血浆样品。计算信号与截止值之比并且呈现在表2(血清样品）和表3(血浆样品） 中。如预期的，所有样品的所有孔具有小于1.0的S/C0,指示试验不是非特异性反应的。 [0057]表2:来自低风险群体的随机血清样品（S/C0值）
[0060]表3:来自低风险群体的随机血浆样品（S/C0值）
[0062] 六个孔(孔43、04、？和!〇的测试结果用于检测样品中的!11￥抗体，作为诊断和/或 确认HIV感染的手段。
[0063] 孔A的信号（信号与截止之比）用作阴性试验对照并且预期小于1.0,以便验证试 验。孔B、D、E和F用于检测HIV-1和/或HIV-2感染，而孔Η用于区分HIV-1和HIV-2感染(见用于 区分HIV-1和HIV-2感染的实施例3)。为了确认HIV感染，样品应包含与源自不同HIV基因的 至少两种HIV抗原有反应的抗体。
[0064]使用试验测试了十个HIV-1阳性人样品。这十个HIV-1阳性样品的S/C0值显示了四 个HIV-1抗体反应性模式（表4)。样品1、3和8包含针对HIV-1主要基因产物pol(p65)、env (gp 160、gp41)和gag(p24)的抗体。针对gp 160的抗体水平好像较高，如由反应性结果（> 2.0S/C0)指示，即使在包被减少浓度的gp 160的孔(孔C)中。样品2、6、7和10包含针对相同 HIV-1主要基因产物的抗体，但是针对gpl60的抗体水平好像较低，如由包被减少浓度的 gpl60的孔(孔C)中的非反应性结果所指示。这些样品可能来自具有最近HIV-1感染的个体。 [0065] 样品4和5包含针对相同HIV-1主要基因产物的抗体，但是针对gpl60的抗体水平好 像是中等的，如由包被减少浓度的gpl60的孔(孔C)中的低反应性(S/C01.0-2.0)指示。 [0066]样品 9仅仅包含针对!11￥-16]1￥(8口160、8口41)和838(口24)的抗体，所以对口〇1(口65) 没有反应性。针对gp 160的抗体水平好像较低，如通过包被减少浓度的gp 160的孔(孔C)中的 非反应性结果所指示。因为这10个HIV-1样品的每一个包含针对源自至少两个HIV-1基因的 至少两个抗原而不是对HIV-2特异性抗原的抗体有反应性(表3)，所有这些样品被诊断并且 确认为HIV-1感染。
[0067] 表4:检测HIV-1抗体阳性样品（S/C0值）
[0069] HIV-1分类为数个遗传上不同的分支(亚型）。表5显示了来自表示各种HIV-1组Μ分 支的八个样品的S/C0值。由于有限的样品体积，在测试之前，所有的都被1:100稀释。尽管稀 释，但是分支Α至G仍与三个HIV-ι基因产物pol(p65)、env(gpl60、gp4lWPgag(p24)SS。* 支Η与两个HIV-1基因产物pol(p65)和env(gpl60、gp41)反应。它们对HIV-2肽抗原都不显示 反应性(孔G和H)。因此，这些样品被确认具有HI V-1感染。
[0070] 表5:HIV-1 分支样品（S/C0 值）
[0071]
[0072] 实施例3
[0073] 用于区分HIV-1和HIV-2感染的试验的用途
[0074]实施例1和2中描述的试验中的孔G和Η包被HIV-2特异性肽抗原，GANN-5，但是孔G 是次包被的。孔Η中包含对该抗原有反应性的抗体的样品指示HIV-2感染。表6显示了十个 HI V-2抗体阳性样品的S/C0值。所有十个样品展示对HI V-2特异性肽的抗体反应性。
[0075] 表6:检测HIV-2抗体阳性样品（S/C0值）
[0076]
[0077] 实施例4
[0078] 用于HIV-1感染近度确定的试验的用途
[0079]实施例1-3中描述的试验包含次包被有HIV抗原的两个孔。孔C次包被HIV-lgpl60， 而孔G次包被HIV-2肽抗原。来自次包被孔的信号单独或与最佳包被相同的抗原的孔一起可 用于确定HIV感染近度。因为可用的HIV-2近度样品较少，所以使用相关HIV-1样品使用来自 包被HIV-lgpl60的孔的信号来评估试验确定感染近度的能力。
[0080] 表7和8显示了来自SeraCare(Milford，MA)HIV-l近度/流行性能平板PRB-601的15 个血浆样品的S/C0值。近度样品获得自新的或短期HIV-1感染的个体。流行(长期感染)样品 获得自具有慢性或长期HIV-1感染的个体。平板中的所有的样品包含针对三种HIV-1基因产 物pol(p65)、env(gpl60、gp4lMPgag(p24W^J^·^。
[0081 ]如表7中所显示，从具有最近感染的个体收集的近度样品在包被减少水平gpl60 (孔C)的孔中无反应性，S/C0小于1.0。相反，从已经已知感染HIV较长一段时间的个体收集 的所有流行样品在包被减少水平gpl60的孔中是低反应性的（样品6和15, S/C0值在1.0和 2.0之间）或是有反应性的(样品3、4、8、10、11和13,3/0)值>2.0)(表7)。因此，来自单独次包 被HIV-lgpl60的孔的信号足够确定HIV-1感染的近度。
[0082]来自最佳包被和次包被HIV-lgpl60(孔C和D)的信号也都可以一起用于确定感染 近度。本文表示为R-因子的孔C和D的信号倍数可用于指示感染的近度。所有近度样品的R-因子值小于9.0,范围是1.30至8.98,平均值是3.21(表7)。相反，所有流行样品的R-因子值 大于34.0,范围是34.95至284.03,平均值是122.29(表8)。基于R-因子值，近度样品和流行 样品被清晰地分成两个组:近度样品的低R-因子值组和流行样品的高R-因子值组（图2)。 [0083] 表7:来自平板PRB-601的近度样品（S/C0值）
[0085] 表8:来自平板PRB-601的流行（长期)样品（S/C0值）
[0086]
[0087]实施例1-4中描述的试验使用来自CEPHIA(评估和实施HIV发病率试验的财团）的 样品组进一步评估HIV感染近度确定。这些样品视为是良表征的HIV近度样品。在该样品组 中，有25个HIV阴性样品和75个HIV-1阳性样品。75个HIV-1阳性样品中，25个收集自12个月 内（包括第12个月）感染的个体和50个收集自超过12个月感染的个体。使用实施例1-4中描 述的试验测试这些HIV阴性和阳性样品。利用该试验，所有25个HIV阴性样品是无反应性的， 而所有75个HIV-1阳性样品确认是HIV-1阳性。
[0088] 为每个样品计算R-因子值，即，来自最佳包被和次包被Hiv-lgpl60的孔的信号倍 数。如表9中显示，在感染之后R-因子值随着时间的推移而增加并且与HIV感染的近度紧密 相关。为了进一步评估用于确定HIV感染近度的试验的精确性，将HIV-1阳性样品分组：在 HIV感染之后头12个月收集的那些(最近感染)和在感染后12个月之后收集的那些(流行的/ 长期感染）。通过比较其试验结果与在这里视为金标准结果的预期结果的那些，评估试验的 精确性。使用20的R-因子值作为截止，根据本发明的试验对于检测最近和流行/长期样品分 别具有88 %和96 %的精确性(表10)。试验可精确地确定HIV感染的近度。因此，根据本发明 的试验可用于同时确认HIV感染和确定HIV感染的近度。
[0089] 耒9,伸用枏抿太发明试骀对CFPHTA钼的涮试
[0091] 表10:用于HIV-1感染近度确定的试验
[0092]
[0093] 1.试验的灵敏性是通过根据本发明的试验所确定的12个月内（包括第12个月）收 集的HIV-1阳性样品是最近感染样品的百分数；
[0094] 2.试验的特异性是通过根据本发明的试验所确定的感染超过12个月之后收集的 HIV-1阳性样品为流行样品的百分数；
[0095] 实施例5
[0096] 试验的变型
[0097] 实施例1-4中描述的试验的许多变型可由本领域技术人员构建，以实现相同的主 要目标。其他变型可具有另外的或不同的辅助功能。在该实施例中，包被次包被的HIV-2特 异性抗原的孔用最佳包被的HIV-2gag基因产物(p24)作为抗原的孔替换，如图3中所描绘。 因为HIV-2特异性肽(GANN-5)源自HIV-2gp36，在该实施例中的试验具有两个孔，其每个孔 用源自不同HIV-2基因的抗原最佳包被，并且可用于确认HIV-2感染。
[0098] 因此，在该实施例中的试验可用于确认HIV-1和/或HIV-2感染、区分HIV-1和HIV-2 感染和确定HIV感染的近度。
[0099] 来自实施例1-4中描述的这些研究的结果显示根据本发明进行的试验可用于同时 确认HIV感染、区分HIV-1和/或HIV-2感染和确定HIV感染的近度。应理解，试验的变型(实施 例5中描述了一种)可由本领域技术人员进行，以实现相同的主要目标。
[0100] 参考文献
[0101] 在说明书中提到的所有的出版物、专利申请、专利和其他参考文献代表本公开主 题所述领域技术人员的水平。所有的出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用并入 本文，如同每一篇出版物、专利申请、专利和其他参考文献特定和独立地指示通过引用并 入。应当理解，尽管本文提及许多专利出版物、专利和其他参考文献，这样的参考文献不表 示承认任何这些文档形成本领域公知常识的一部分。
[0102] 尽管为了清楚理解的目的，通过阐释和实施例较详细描述了前述主题，但是本领 域技术人员理解，在所附的权利要求范围内可实施某些改变和修饰。
【主权项】
1. 一种确定HIV感染和评估HIV感染近度的方法，所述方法包括下述步骤： a) 提供包括HIV特异性抗体的样品； b) 对所述样品进行HIV感染确认试验;和 c) 对所述样品进行HIV感染近度确定试验； 其中步骤(b)和步骤(c)同时进行，从而确保同时确定所述样品中的HIV感染和HIV感染 近度。2. 权利要求1所述的方法，进一步包括下述步骤： d) 对所述样品进行HIV-1/HIV-2感染区分试验；从而能够区分所述样品中的HIV-1和 HIV-2感染。3. 权利要求1或2所述的方法，其中所述HIV感染确认试验是免疫试验，其包括包被有特 异性针对HIV抗体的抗原的多个固相。4. 权利要求3所述的方法，其中所述多个固相的每一个包被有源自HIV gag基因 、HIV env基因或HIV pol基因的不同HIV抗原。5. 权利要求4所述的方法，其中源自所述HIV gag基因的所述不同HIV抗原是衣壳蛋白 p24或其片段、变体或衍生物。6. 权利要求4所述的方法，其中源自所述HIV env基因的所述不同HIV抗原是包膜蛋白 gpl60、gpl20或gp41或其片段、变体或衍生物。7. 权利要求4所述的方法，其中源自所述HIV pol基因的所述不同HIV抗原是调节蛋白 p65或其片段、变体或衍生物。8. 权利要求1至7任一项所述的方法，其中当通过所述HIV感染确认试验检测到针对至 少两种HIV基因产物的HIV特异性抗体时，所述样品被确认为HIV阳性样品。9. 权利要求1或2所述的方法，其中所述HIV感染近度确定试验是免疫试验，其包括次包 被有HI V抗原的固相。10. 权利要求9所述的方法，其中用于HIV感染近度确定试验的所述免疫试验包括另外 的固相，所述另外的固相包被有最佳量的与所述次包被的相同的HIV抗原。11. 权利要求9所述的方法，包括检测来自所述固相的信号和使用所述信号确定所述样 品是否来自最近感染HIV的个体。12. 权利要求9或10所述的方法，包括检测来自次包被的所述固相和包被有最佳量的相 同抗原的所述固相的信号和使用所述两个固相的信号倍数(R-因子）以确定所述样品是否 来自最近感染HIV的个体。13. 权利要求11或12所述的方法，其中当所述信号或信号倍数小于截止值时，所述样品 来自最近感染HIV的个体。14. 权利要求2所述的方法，其中所述HIV-1/HIV-2感染区分试验是免疫试验，其包括包 被有源自HIV-2基因的抗原或其片段、变体或衍生物的固相。15. 权利要求9或10所述的方法，其中所述HIV抗原本质上与用于确认HIV感染的HIV抗 原之一相同。16. 权利要求14所述的方法，其中所述免疫试验进一步包括第二固相，其包被有源自 HIV-2基因的第二抗原或其片段、变体或衍生物。17. 权利要求14所述的方法，其中所述HIV-2特异性抗原是GANN-5肽或其片段、变体或 衍生物。18. 权利要求14所述的方法，其中当包被所述固相的HIV-2特异性抗原或其片段、变体 或衍生物对所述样品中的一种或多种抗体有反应性时，所述样品被确认为HIV-2阳性样品。19. 权利要求3、9、10或14所述的方法，其中所述固相由相同的材料制备并且存在于各 自的反应容器中。20. 权利要求19所述的方法，其中所述反应容器组织为适于进行检测所述样品中抗体 的条状容器。21. 权利要求19所述的方法，其中所述条状容器是包括多个孔的条状微孔平板。22. 权利要求19所述的方法，其中所述反应容器是微流体设备中分开的通道。23. 权利要求19所述的方法，其中所述反应容器是滤纸片上不同的点，其适合基于侧流 或流通的试验。24. 权利要求19所述的方法，其中所述反应容器是由不同的标记物编码的不同微粒。25. 权利要求19所述的方法，其中所述反应容器是固相上的不同点。26. 权利要求25所述的方法，其中固相上所述不同点在微阵列试验中。27. 权利要求1或2所述的方法，其中所述试验是酶联免疫吸附试验(ELISA)或酶免疫试 验(EIA)〇28. 权利要求1或2所述的方法，其中当所述样品之前还未用HIV诊断或筛选试验测试 时，所述试验包括HIV感染诊断或筛选试验。29. -种评估群体中HIV发病率的方法，所述方法包括： a) 提供包括HIV特异性抗体的样品组，其中所述样品组源自一个时间段内所述群体中 的多个个体； b) 对所述样品组进行HIV感染近度确定试验； c) 确定所述时间段内最近HI V感染的百分数； 其中所述时间段内最近HIV感染的百分数提供了所述群体中HIV发病率的评估。30. 权利要求29所述的方法，其中所述时间段是6个月。31. 权利要求29所述的方法，其中所述时间段是12个月。32. 权利要求29所述的方法，其中所述时间段是18个月。33. 权利要求29所述的方法，其中所述时间段是24个月。34. 权利要求29至33任一项所述的方法，其中所述HIV感染近度确定试验是免疫试验， 其包括次包被有HI V抗原的固相。35. 权利要求29所述的方法，其中所述HIV感染近度确定试验使用另外的固相，所述另 外的固相包被有最佳量的与所述次包被的相同的HIV抗原。36. 权利要求29至33任一项所述的方法，包括检测来自次包被的所述固相和包被有最 佳量的相同抗原的所述固相的信号和使用所述两个固相的信号倍数(R-因子）以确定所述 样品是否来自最近感染HIV的个体。37. 权利要求36所述的方法，其中当所述信号低于截止值时，所述样品来自最近感染 HIV的个体。
【文档编号】G01N33/569GK106030306SQ201580007809
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2015年10月7日
【发明人】尚伦·切蒂, 李兴祥
【申请人】艾维可股份有限公司