一种用于观察空气凤梨叶片解剖结构的标本制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于观察空气凤梨叶片解剖结构的标本制作方法，包括以下步骤：(1)叶片选取；(2)材料固定；(3)材料软化；(4)材料脱水、透明；(5)材料封蜡；(6)材料渗蜡；(7)材料包埋；(8)材料修块、切片；(9)材料粘片；(10)材料染色；(11)材料封片观察。相对于现有技术，本发明方法改进了软化过程，使用了新的软化试剂组合，针对空气凤梨叶片可获得理想的软化效果。此外，创新了包埋过程，操作方法简便，可获得完整的蜡块，简化了原有包埋操作程序。解决了现有技术无法获得清晰的空气凤梨叶片解剖结构观察材料的问题。
【专利说明】
一种用于观察空气凤梨叶片解剖结构的标本制作方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种用于观察空气凤梨叶片解剖结构的标本制作方法，属于叶片标本制作技术领域。
【背景技术】
[0002]空气凤梨(Tillandsia)，原产于中、南美洲的热带、亚热带地区，属于凤梨科(Bromeliaceae)多年生草本植物，其中以凤梨科铁兰属为主。由于空气凤梨的观赏性和价值较为独特，21世纪初我国开始了对这一物种的引进，空气凤梨便逐渐在园林艺术、环境保护等方面崭露头角。
[0003]空气凤梨生长所需要的水分和营养物质均来自于空气，无需借助于土壤，而叶片作为其暴露在空气中最多的部分，势必会成为吸收水分和营养物质的主要器官，结构是功能的基础，所以气生凤梨叶片内部一定特殊的结构存在。空气凤梨种类繁多，为了对空气凤梨进行更合理的利用，不同品种的叶片结构特性急需深入研究。
[0004]但是空气凤梨的叶片结构较常规植物有很大不同，常规叶片解剖结构的研究方法对其很难适用。
【发明内容】
[0005]发明目的:为了解决上述技术问题，本发明提供一种用于观察空气凤梨叶片解剖结构的标本制作方法。
[0006]技术方案:为了实现上述发明目的，本发明公开了一种用于观察空气凤梨叶片解剖结构的标本制作方法，包括以下步骤:
[0007](I)叶片选取:选择无病虫害、生长状况良好的单株，选取其中部健康叶片；
[0008](2)材料固定:将叶片切成长方形小块，用清水冲洗后投入FAA固定液中固定，固定24-36小时;
[0009](3)材料软化:先将步骤(2)所得样品放入50%甘油+50%乙醇1:1溶液中，浸泡20-30天，然后再放入过氧化氢和丙酸的混合液中，每隔30分钟-1小时取出样品，重复6-10次，流水冲洗；
[0010](4)材料脱水、透明:经过软化的材料，利用不同浓度的乙醇溶液以及二甲苯，按设定程序进行脱水；
[0011 ] (5)材料封蜡:将白色石蜡完全融化后再室温冷却，如此重复30-40次，直至石蜡完全变成乳黄色;然后将熬制好的乳黄色蜡块融化待用，将材料放入容器内，再倒入石蜡完全淹末；
[0012](6)材料渗蜡:封蜡完毕后置于37 0C的电热恒温培养箱中24_48h，将电热恒温箱升温至60°C0.5h，然后倒去1/3体积石蜡与二甲苯的混合物，再加入等体积纯蜡l-2h，再倒去1/2体积石蜡与二甲苯的混合物，加入等体积纯蜡l_2h，最后依次纯蜡I l_2h，纯蜡Π l-2h，
0.5h后进行包埋；
[0013](7)材料包埋:用硬度适中且光滑的纸张制成两边带有扶手的长方形纸盒，将处理好的材料放入纸盒，一个纸盒内靠近两扶手边各放置一块材料;将融化好的乳黄色石蜡倒入纸盒中，倒入量占纸盒的2/3，然后把镊子在酒精灯上烧热，赶走石蜡内的气泡，用镊子将材料放入纸盒内，迅速把材料排列整齐，待石蜡开始凝固时，迅速将纸盒放入凉水中，并在水中立即翻转纸盒，底部朝上，蜡块可完整脱离纸盒，完成包埋；
[0014](8)材料修块、切片:将石蜡块修成梯形，用刀片将材料周围多余的石蜡切去，使切面尽可能小，但不要挤压到材料，装置材料，调整厚度标志器，使所指刻度正适合所要厚度，得蜡带；
[0015](9)材料粘片
[0016]将一小滴粘贴剂涂在载玻片上，用手指涂匀，将步骤(8)所得蜡带轻放到载玻片上，并滴加3%的福尔马林，使蜡带展开，将带有蜡带的载玻片放在温台上，使表面烤干，将载玻片置于37 °C电热恒温培养箱中2-5d，加速其干燥；
[0017](10)材料染色:采用番红-固绿对染法进行染色；
[0018](11)材料封片观察:将处理后的盖玻片迅速中取出，滴1-2滴中性树胶封片，盖上盖玻片，避免有气泡产生，37°C电热恒温培养箱中烘干过夜后，即得，可用光学显微镜观察并拍照。
[0019]作为优选，所述空气凤梨为霸王、扭叶铁兰、三色铁兰、维路缇娜、青铜气花、斯垂科特、贝吉、哈里斯、松萝或线叶铁兰。
[0020]作为另一种优选，步骤(2)中所述FAA固定液体积为固定组织的20倍，其配置为:70 %或50 %乙醇90mL:冰醋酸:甲醛=18:1:1。
[0021]作为另一种优选，步骤(3)中所述过氧化氢和丙酸的混合液中，过氧化氢和丙酸的体积比为1:1或2:1。
[0022]作为另一种优选，步骤(4)中所述设定程序如下:
[0023]依次使用30%的乙醇，70%乙醇(每10ml 70%的乙醇里加0.5g的番红)，85%乙醇(l-2h)，95%乙醇(l-2h)，无水乙醇(l-2h)，无水乙醇(0.5-lh)，3/4乙醇+l/4二甲苯(l-2h)，l/2乙醇+l/2二甲苯(l-2h)，l/4乙醇+3/4二甲苯(l-2h)，二甲苯(l-2h)，二甲苯(0.5-1h)进行脱水。
[0024]作为另一种优选，步骤(10)中所述染色过程如下:
[0025]二甲苯I(20-30min)，二甲苯Π (20-30min)，l/2二甲苯+1/2乙醇(5-10min)，100%乙醇(5-10min)，95% 乙醇(5-10min)，85% 乙醇(5-10min)，70% 乙醇(5_10min)，50% 乙醇(5-1 Omin)，30% 乙醇(5-lOmin)，I % 番红(12h)，50% 乙醇(5-1 Omin)，70% 乙醇(5-1 Omin)，85% 乙醇(5-lOmin) ,95% 乙醇(5-lOmin) ,0.1% 固绿(l-3min)，95% 乙醇(5-1 Omin), 100%乙醇1(5-1011^11)，100%乙醇11(5-101^11)，1/2二甲苯+1/2乙醇(5-101^11)，二甲苯1(20-30min)，二甲苯Π (20-30min)。
[0026]技术效果:相对于现有技术，本发明方法改进了软化过程，使用了新的软化试剂组合，针对空气凤梨叶片可获得理想的软化效果。此外，创新了包埋过程，操作方法简便，可获得完整的蜡块，简化了原有包埋操作程序。解决了现有技术无法获得清晰的空气凤梨叶片解剖结构观察材料的问题
【附图说明】
[0027]图1:为霸王叶片解剖结构；
[0028]图2:为扭叶铁兰叶片解剖结构。
【具体实施方式】
[0029]实施例1
[0030]1、叶片选取
[0031]选取无病虫害、生长状况良好单株，选取植株中部健康叶片。选择品种为霸王。
[0032]2、材料固定:
[0033]不同品种叶片大小不同，视叶片大小选取一种规格，将叶片切成3mmX 5mm、4mmX6mm、5mm X 7mm或6mm X 8mm的长方形小块，切好的材料用清水冲洗后投入FAA固定液中固定，固定液体积为固定组织的20倍。FAA固定液配置:70 %或50 %乙醇90mL:冰醋酸:甲醛=18:1:1，固定30小时。
[0034]3、材料软化:
[0035]I)将样品放入50 %甘油+50 %乙醇(95 % ) 1:1溶液中，浸泡25天。
[0036]2)将材料放入过氧化氢和丙酸(1:1)的混合液中，每隔30分钟-1小时用镊子取出样品，视叶片材料软硬，重复6-10次，流水冲洗约10分钟后，用刀片试切，若手感柔软即可。
[0037]4、材料脱水、透明:
[0038]经过软化的材料脱水前先用自来水冲洗干净，再转入30%的乙醇进行脱水—70%乙醇(番红预染，过夜)(每10ml 70%的乙醇里加0.5g的番红)—85%乙醇(l-2h)—95%乙醇(l-2h)—无水乙醇(l-2h)—无水乙醇(0.5-lh)—3/4乙醇+1/4 二甲苯(l-2h) —1/2乙醇+1/2 二甲苯(l-2h) — l/4 乙醇+3/4 二甲苯(l-2h)—二甲苯(l-2h)—二甲苯(0.5-lh)。
[0039]5、材料封蜡
[0040]I)熬蜡
[0041 ]将白色石蜡放入瓷缸内于微波炉上加温，待石蜡完全融化室温冷却。如此重复30-40次，直至石蜡完全变成乳黄色。
[0042]2)封蜡
[0043]将熬制好的黄色蜡块至于60°C的电热恒温箱中，融化待用。将材料放入容器内，倒入石蜡完全淹末。
[0044]6、材料渗蜡
[0045]封蜡完毕后置于放在37°C的电热恒温培养箱中36h。将电热恒温箱升温至60°C约0.5h，倒去1/3体积石蜡与二甲苯的混合物，加入等体积纯蜡(I?2h)—倒去1/2体积石蜡与二甲苯的混合物，加入等体积纯蜡(I?2h)—纯蜡I(I?2h)—纯蜡Π (I?2h)。0.5h后进行包埋。
[0046]7、材料包埋
[0047]制盒:
[0048]用硬度适中且光滑的纸张(如杂志封面)制成3cmX5cm，两边带有扶手的长方形纸盒。并准备一盆凉水、一个镊子、一盆冷水、一个酒精灯备用。
[0049]包埋:
[0050]将处理好的材料放入纸盒，一个纸盒内靠近两扶手边各放置一块材料。将融化好的黄色石蜡倒入纸盒中，倒入量占纸盒的2/3。然后把镊子在酒精灯上烧热，赶走石蜡内的气泡。用镊子将材料放入纸盒内，迅速把材料排列整齐。待石蜡开始凝固时，迅速将纸盒放入凉水中，并在水中立即翻转纸盒，底部朝上，蜡块可完整脱离纸盒，完成包埋。
[0051 ] 8、材料修块、切片
[0052]将石蜡块修成梯形，用刀片将材料周围多余的石蜡切去，使切面尽可能小，但不要挤压到材料。装置材料，调整厚度标志器，使所指刻度正适合所要厚度。蜡块硬度和切片速度都会影响切片质量。
[0053]9、材料粘片
[0054]将一小滴粘贴剂涂在载玻片上(载玻片需事先经过95%酒精浸泡数小时，用布擦干)，用手指涂匀，将所得蜡带轻放到载玻片上，并滴加3%的福尔马林，使蜡带展开。将带有蜡带的载玻片放在温台上，使表面烤干。将载玻片置于37°C电热恒温培养箱中3d，加速其干燥。
[0055]10、材料染色
[0056]采用番红-固绿对染法，染色过程如下:二甲苯I(20-30min) —二甲苯Π (20-30!11；[11)4 1/2二甲苯+1/2乙醇(5-10111；[11)4 100 % 乙醇(5-10min)—95 % 乙醇(5-lOmin) —85% 乙醇(5-10!11；[11)4 70%乙醇(5_10111；[11)4 50% 乙醇(5-10!11；[11)4 30%乙醇(5-10111；[11)41% 番红(12h)—50% 乙醇(5-10min)—70% 乙醇(5-10min)—85% 乙醇(5-10min)—95% 乙醇(5-1 Omin)—0.1 % 固绿(l-3min)—95% 乙醇(5-10min) — 100% 乙醇I (5-10min) — 100%乙醇 Π (5-10min) — l/2二甲苯+1/2乙醇(5-lOmin)—二甲苯I(20-30min)—二甲苯Π (20-30min)。
[0057]11、材料封片观察
[0058]迅速将盖玻片从二甲苯中取出(不能使二甲苯干很久后才封片)，滴1-2滴中性树胶封片，盖上盖玻片，尽量避免有气泡产生，37°C电热恒温培养箱中烘干过夜后，用光学显微镜观察并拍照。
[0059]实施例2:
[0060]选择品种为扭叶铁兰。
[0061 ]步骤2材料固定中，固定时间为24小时；
[0062]步骤3材料软化中，将样品放入50%甘油+50%乙醇(95% )1:1溶液中，浸泡20天；混合液中入过氧化氢和丙酸的体积为2:1 ；
[0063]步骤6材料渗蜡中，封蜡完毕后置于放在37°C的电热恒温培养箱中24h;
[0064]步骤9材料粘片中，将载玻片置于37°C电热恒温培养箱中2d。
[0065]实施例3:
[0066]选择品种为三色铁兰。
[0067]步骤2材料固定中，固定时间为36小时；
[0068]步骤3材料软化中，将样品放入50%甘油+50%乙醇(95% )1:1溶液中，浸泡30天；混合液中入过氧化氢和丙酸的体积为I: I;
[0069]步骤6材料渗蜡中，封蜡完毕后置于放在37°C的电热恒温培养箱中48h;
[0070]步骤9材料粘片中，将载玻片置于37°C电热恒温培养箱中5d。
【主权项】
1.一种用于观察空气凤梨叶片解剖结构的标本制作方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)叶片选取:选择无病虫害、生长状况良好的单株，选取其中部健康叶片； (2)材料固定:将叶片切成长方形小块，用清水冲洗后投入FAA固定液中固定，固定24-36小时; (3)材料软化:先将步骤(2)所得样品放入50%甘油+50 %乙醇1:1溶液中，浸泡20-30天，然后再放入过氧化氢和丙酸的混合液中，每隔30分钟-1小时取出样品，重复6-10次，流水冲洗； (4)材料脱水、透明:经过软化的材料，利用不同浓度的乙醇溶液以及二甲苯，按设定程序进彳丁脱水； (5)材料封蜡:将白色石蜡完全融化后再室温冷却，如此重复30-40次，直至石蜡完全变成乳黄色；然后将熬制好的乳黄色蜡块融化待用，将材料放入容器内，再倒入石蜡完全淹末； (6)材料渗蜡:封蜡完毕后置于37°C的电热恒温培养箱中24-48h，将电热恒温箱升温至60 °C0.5h，然后倒去1/3体积石蜡与二甲苯的混合物，再加入等体积纯蜡l_2h，再倒去1/2体积石蜡与二甲苯的混合物，加入等体积纯蜡I_2h，最后依次纯蜡I l_2h，纯蜡Π l-2h，0.5h后进行包埋； (7)材料包埋:用硬度适中且光滑的纸张制成两边带有扶手的长方形纸盒，将处理好的材料放入纸盒，一个纸盒内靠近两扶手边各放置一块材料;将融化好的乳黄色石蜡倒入纸盒中，倒入量占纸盒的2/3，然后把镊子在酒精灯上烧热，赶走石蜡内的气泡，用镊子将材料放入纸盒内，迅速把材料排列整齐，待石蜡开始凝固时，迅速将纸盒放入凉水中，并在水中立即翻转纸盒，底部朝上，蜡块可完整脱离纸盒，完成包埋； (8)材料修块、切片:将石蜡块修成梯形，用刀片将材料周围多余的石蜡切去，使切面尽可能小，但不要挤压到材料，装置材料，调整厚度标志器，使所指刻度正适合所要厚度，得蜡带； (9)材料粘片 将一小滴粘贴剂涂在载玻片上，用手指涂匀，将步骤(8)所得蜡带轻放到载玻片上，并滴加3%的福尔马林，使蜡带展开，将带有蜡带的载玻片放在温台上，使表面烤干，将载玻片置于37 °C电热恒温培养箱中2-5d，加速其干燥； (10)材料染色:采用番红-固绿对染法进行染色； (11)材料封片观察:将处理后的盖玻片迅速中取出，滴1-2滴中性树胶封片，盖上盖玻片，避免有气泡产生，37°C电热恒温培养箱中烘干过夜后，即得，可用光学显微镜观察并拍照。2.根据权利要求1所述的用于观察空气凤梨叶片解剖结构的标本制作方法，其特征在于，所述空气凤梨为霸王、扭叶铁兰、三色铁兰、维路缇娜、青铜气花、斯垂科特、贝吉、哈里斯、松萝或线叶铁兰。3.根据权利要求1所述的用于观察空气凤梨叶片解剖结构的标本制作方法，其特征在于，步骤(2)中所述FAA固定液体积为固定组织的20倍，其配置为:70 %或50 %乙醇90mL:冰醋酸:甲醛= 18:1:1。4.根据权利要求1所述的用于观察空气凤梨叶片解剖结构的标本制作方法，其特征在于，步骤(3)中所述过氧化氢和丙酸的混合液中，过氧化氢和丙酸的体积比为1:1或2:1。5.根据权利要求1所述的用于观察空气凤梨叶片解剖结构的标本制作方法，其特征在于，步骤(4)中所述设定程序如下: 依次使用30%的乙醇，70%乙醇(每10ml 70%的乙醇里加0.5g的番红)，85%乙醇(1-210，95%乙醇(1-211)，无水乙醇(1-211)，无水乙醇(0.5-111)，3/4乙醇+1/4二甲苯(1-211)，1/2 乙醇+1/2 二甲苯(l-2h)，l/4 乙醇+3/4 二甲苯(l-2h)，二甲苯(l-2h)，二甲苯(0.5-lh)进行脱水。6.根据权利要求1所述的用于观察空气凤梨叶片解剖结构的标本制作方法，其特征在于，步骤(1)中所述染色过程如下: 二甲苯I(20-30min)，二甲苯Π (20-30min)，l/2二甲苯+1/2乙醇(5-10min)，100% 乙醇(5-10111；[11)，95%乙醇(5-10111；[11)，85%乙醇(5-10111；[11)，70% 乙醇(5_10min)，50% 乙醇(5-1Omin), 30% 乙醇(5-1Omiη)，1%番红(1211)，50%乙醇(5-10111；[11)，70% 乙醇(5-1Omiη)，85% 乙醇(5-lOmin) ,95% 乙醇(5-lOmin) ,0.1% 固绿(l-3min)，95% 乙醇(5-1 Omin), 100%乙醇1(5-1011^11)，100%乙醇11(5-101^11)，1/2二甲苯+1/2乙醇(5-101^11)，二甲苯1(20-30min)，二甲苯Π (20-30min)。
【文档编号】G01N1/28GK106053177SQ201610612203
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年7月28日
【发明人】方敏彦, 章明, 杨鹤同, 汪善锋, 席刚俊
【申请人】江苏农林职业技术学院