一种熟肉制品中n?二甲基亚硝胺检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种熟肉制品中N?二甲基亚硝胺检测方法，所述检测方法包括标准品溶液溶液配制、待测样品溶液的制备、待测样品定性检测和定量检测等步骤。本发明通过简便、快速、高效的待测样品制备方法，并利用GC?MS/MS分析仪，通过外标法建立标准曲线，检测、计算得到N?二甲基亚硝胺的含量。该方法与传统的气相色谱?质谱仪法相比，省去水蒸气蒸馏和水浴浓缩等步骤，操作更简单，所需仪器减少；且检出限更低，准确性更高。
【专利说明】
一种熟肉制品中N-二甲基亚硝胺检测方法
技术领域
[0001]本发明属于检测技术领域，具体涉及一种熟肉制品中N-二甲基亚硝胺检测方法。
【背景技术】
[0002 ] N-二甲基亚硝胺在环境中广泛存在。在鱼、肉等动植食品中可达0.1 _300yg/kg。在 烟草、蔬菜、谷类中均可检出，属高毒，已确定为动物致癌物，经消化道、呼吸道吸收迅速，经 皮肤吸收缓慢，靶器官主要为肝和肾。
[0003 ] 酒类、肉及鱼类腌制品、豆制品等食品中含有N-二甲胺亚硝基、N-二乙胺亚硝基等 等。亚硝胺类化合物有一定的急性毒性、强致癌性，主要引起肝坏死出血，其致癌性更为人 们所关注，迄今已发现的亚硝胺有300多种；其中N-二甲基亚硝胺是极具代表性的物质之 一。食物中的亚硝胺的来源如下：（1)腌制时盐中亚硝酸盐的作用，如咸鱼、咸肉等；（2)在加 热干燥时，空气中氮气被氧化成氮氧化物的作用，如啤酒、奶粉、豆制品。近年来对于挥发性 亚硝胺的检测显示食品和饮料以及肉类、酒类中存在的N-二甲胺亚硝胺在yg/kg或yg/L数 量级，所以需要建立一种高灵敏度和高选择性的方法对痕量N-二甲胺亚硝胺进行检测。
[0004] 我国曾规定肉类中的N-二甲胺亚硝胺含量应该兰3yg/kg，目前，GB/T5009.26-2003规定的仪器检测方法中气相色谱-质谱仪法，N-二甲基亚硝胺分离步骤繁琐，仪器成本 高;最新食品安全国家标准《食品中N-亚硝胺类化合物的测定》征求意见稿采用三种方法： 第一法为气相色谱一氮化学反光检测器法、第二法为气相色谱-热能分析仪法、第三法为气 相色谱高分辨质谱法，这些方法最大缺点就是对仪器的特异性要求高，检测物分离步骤繁 琐，时间成本高。
【发明内容】
[0005] 针对现状，本发明提供一种熟肉制品中N-二甲基亚硝胺检测方法，能够减少分离 步骤，减少时间成本低，提高准确率。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
[0007] -种熟肉制品中N-二甲基亚硝胺检测方法，所述检测方法包括如下步骤：
[0008] (1)配制不同浓度的标准品溶液:首先制备标准储备液，称取N-二甲基亚硝胺标准 品，用乙腈配制成N-二甲基亚硝胺的浓度为1000mg/L的储备液，于4°C冰箱中避光保存;然 后将标准储备液用乙腈配制成浓度为〇? 5ng/mL、lng/mL、2.5ng/mL、4ng/mL、5ng/mL的标准 品曲线点备用；
[0009] (2)待测样品溶液的制备：
[0010] A、称取待测样品5.00g，加入乙腈中含1%醋酸的溶液10mL，在2500r/min转速下的 涡混振荡器中涡混5min;
[0011 ] B、再加入5g无水硫酸镁、lg氯化钠和lg梓檬酸二钠后祸混3min，然后在5000r/min 转速下离心5min后收集上清液；
[0012] C、吸取6mL上清液移入装有0? 5gPSA、0? SgC^Plg无水硫酸镁的15mL离心管中，涡 混3min，5000r/min离心5min后再次收集上清液；
[0013] D、再次取上清液，用〇. 22mi有机滤膜过滤后作为待测样品溶液；
[0014] (3)待测样品定性和定量检测：
[0015] A、取1.0此待测样品溶液进样，用三重四级杆气相色谱-质谱联用仪分析检测，得 到待测样品溶液的总离子流色谱图、定量离子对色谱图和定性离子对相对丰度色谱图；
[0016] B、将步骤（1)配制的不同浓度的N-二甲基亚硝胺标准品溶液，用三重四级杆气相 色谱-质谱联用仪分析检测，检测条件与待测样品溶液相同，获得标准品溶液的总离子流色 谱图、定量离子色谱图和定性离子对相对丰度色谱图；
[0017] C、以N-二甲基亚硝胺的定量离子对和定性离子对的色谱峰制作得到N-二甲基亚 硝胺标准曲线；
[0018] D、根据待测样品溶液中N-二甲基亚硝胺的定量离子对和定性离子对的色谱峰，结 合标准曲线，计算得到待测样液中N-二甲基亚硝胺的浓度C，并按以下公式计算得到熟肉制 品中N-二甲基亚硝胺的含量X，含量计算公式为：
[0019] X = C*V/(M*1000)
[0020] 其中X为待测样品中N-二甲基亚硝胺的含量，单位为mg/kg;C是待测样品中N-二甲 基亚硝胺的浓度，单位为ng/mL;V是待测样品溶解体积，单位为mL;M是待测样品质量，单位 为g。
[0021] 优选地，所述定量离子对为74-42.1，定性离子对为73.9-42.1。
[0022]优选地，三重四级杆气相色谱-质谱联用仪分析检测时所采用的参数分别为：
[0023] A、色谱条件
[0024]色谱柱为安捷伦HP-IN0WAX毛细管色谱柱，进样口温度250 °C，不分流进样，载气 (氦气多99.999 % )流速0.887mL/min，进样量1此;程序升温:初始温度60°C保持lmin，以40 °(：/1^11升到120°(：，然后再以5°(：/111111升到250°(：保持3111111。
[0025] B、质谱条件
[0026] 离子源:230°C，四级杆：150°C，传输线：250°C，扫描模式MRM，电离能量70eV，溶剂 延迟 4.5min〇
[0027]其中，上述待测样品为N-二甲基亚硝胺的判定方法为：待测样品和N-二甲基亚硝 胺标准品保留时间相同，在相同的定量离子对为74-42.1、定性离子对为73.9-42.1条件 下，两者的定量离子对和定性离子对相对丰度比值在80%_120%之间，判定为待测样品为 N-二甲基亚硝胺。
[0028]本发明的有益效果是：
[0029]与GB/T5009.26-2003中所提到的气相色谱-质谱仪法相比，省去水蒸气蒸馏和水 浴浓缩等步骤，操作更简单，所需仪器减少;且检出限更低，准确性更高。
【附图说明】
[0030]图1是样品溶液的总离子流色谱图；
[0031 ]图2是样品溶液的定量离子对色谱图；
[0032]图3是样品溶液的定性离子对相对丰度色谱图；
[0033]图4是标准品溶液的总离子流色谱图；
[0034] 图5是标准品溶液的定量离子对色谱图；
[0035] 图6是标准品溶液的定性离子对相对丰度色谱图；
[0036] 图7是N-二甲基亚硝胺标准曲线。
【具体实施方式】
[0037] 下面将通过具体实施例对本发明进行详细的描述。提供这些实施例是为了能够更 透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
[0038] 如在通篇说明书及权利要求当中所提及的"包含"或"包括"为一开放式用语，故应 解释成"包含但不限定于"。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃 以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权 利要求所界定者为准。以下通过具体实验对本发明进行进一步解释。
[0039] -、试剂和仪器
[0040] 色谱柱：安捷伦GC-MS 7890B-7000C，离心机：SIGMA 3K15,涡混振荡器：德国 heidolph，移液枪:德国eppendorf，祸混振荡器:V0RTEXGEIE2,超声振荡器，十万分之一天 平：METTER TOLEDO XS205,万分之一天平：METTER TOLEDO ME204E，PSAAgela，C18Agela， 0.22mi有机滤膜Age la，N-二甲基亚硝铵(色谱纯），50mL离心管，熟肉制品(超市购买）。
[0041] 二、标准品溶液的配制
[0042] 标准储备液:称取N-二甲基亚硝铵标准品，用乙腈配制成1000mg/L的储备液，于4 °C冰箱中避光保存；
[0043]标准品溶液：将标准储备液用乙腈稀释至浓度分别为0.5ng/mL，Ing/mL，2.5ng/ mL，4ng/mL和5ng/mL的标准品溶液备用。
[0044]三、待测样品溶液的制备
[0045] A、称取待测样品5.00g，加入乙腈中含1%的醋酸的溶液10mL，在2500r/min转速下 涡混振荡器中涡混5min;
[OO46] B、再加入5g无水硫酸钠、lg氯化钠和lg梓檬酸二钠后祸混3min，然后在5000r/min 转速下离心5min后收集上清液；
[0047] C、吸取6mL上清液移入装有0.5gPSA、0.5g C^Plg无水硫酸镁的15mL离心管中，涡 混3min，5000r/min离心5min后再次收集上清液；
[0048] D、再次取上清液，用0.22mi有机滤膜过滤后作为待测样品溶液。
[0049] 四、样品定性和定量检测
[0050] 将标准溶液和样品溶液按照以下三重四级杆气相色谱-质谱联用仪的工作参数进 行测定。
[0051] 三重四级杆气相色谱-质谱联用仪分析检测时所采用的参数分别为：
[0052] A、色谱条件
[0053]色谱柱为安捷伦HP-IN0WAX毛细管色谱柱，进样口温度250 °C，不分流进样，载气 (氦气多99.999 % )流速0.887mL/min，进样量1此;程序升温:初始温度60°C保持lmin，以40 °(：/1^11升到120°(：，然后再以5°(：/111111升到250°(：保持3111111。
[0054] B、质谱条件
[0055] 离子源:230°C，四级杆：150°C，传输线：250°C，扫描模式MRM，电离能量70eV，溶剂 延迟 4.5min〇
[0056] C、表1为标准出峰时间(保留时间）和离子对、碰撞能量表 [0057] 表1标准出峰时间和离子对、碰撞能量表
[0059] 首先根据待测样品和N-二甲基亚硝铵标准品保留时间相同，定量离子对为74- 42.1、定性离子对为73.9-42.1条件下，两者的定量离子对和定性离子对相对丰度比值在 80 %-120 %之间，判定为同一化合物。
[0060] D、待测样品定性和定量具体检测如下：
[0061] A、取1.0此待测样品溶液进样，用三重四级杆气相色谱-质谱联用仪分析检测，得 到待测样品溶液的总离子流色谱图（图1 )、定量离子对色谱图（图2)和定性离子对相对丰度 色谱图（图3);
[0062] B、将步骤（1)配制的不同浓度的N-二甲基亚硝胺标准品溶液，用三重四级杆气相 色谱-质谱联用仪分析检测，检测条件与待测样品溶液相同，获得标准品溶液的总离子流色 谱图（图4)、定量离子对色谱图（图5)和定性离子对相对丰度色谱图（图6)。
[0063] C、以N-二甲基亚硝胺的定量离子对74-42.1和定性离子对73.9-42.1的色谱峰 制作得到N-二甲基亚硝胺标准曲线（图7);并且得出Y = 6375.486881*X-967.980516,线性 相关系数R2 = 〇. 9954，检出限为0.5ng/mL，定量限为1.5ng/mL，其中：X表示样品浓度，Y表示 响应值；
[0064] D、根据待测样品溶液中N-二甲基亚硝胺的定量离子对74-42.1和定性离子对 73.9-42.1的色谱峰，结合标准曲线，计算得到待测样液中N-二甲基亚硝胺的浓度C，并按 以下公式计算得到熟肉制品中N-二甲基亚硝胺的含量X，含量计算公式为：
[0065] X = C*V/(M*1000);其中X为待测样品中N-二甲基亚硝胺的含量，单位为mg/kg;C是 待测样品中N-二甲基亚硝胺的浓度，单位为ng/mL; V是待测样品溶解体积，单位为mL; M是待 测样品质量，单位为g。
[0066] 根据含量的多少和国家标准来确定所检测的熟肉制品是否属于合格品。
[0067] 以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发 明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领 域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
【主权项】
1. 一种熟肉制品中N-二甲基亚硝胺检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步 骤： (1) 配制不同浓度的标准品溶液:首先制备标准储备液，称取N-二甲基亚硝胺标准品， 用乙腈配制成N-二甲基亚硝胺的浓度为1000mg/L的储备液，于4°C冰箱中避光保存;然后将 标准储备液用乙腈配制成浓度分别为0 · 5ng/mL、Ing/mL、2 · 5ng/mL、4ng/mL、5ng/mL的标准 品溶液备用； (2) 待测样品溶液的制备： A、 称取待测样品5.00g，加入乙腈中含1%醋酸的溶液10mL，在2500r/min转速下的涡混 振荡器中涡混5min; B、 再加入5g无水硫酸镁、lg氯化钠和lg梓檬酸二钠后祸混3min，然后在5000r/min转速 下的离心机中离心5min后收集上清液； C、 吸取6mL上清液移入装有0.58?5六、0.58(：18和4无水硫酸镁的1511^离心管中，涡混 3min，在5000r/min转速下的离心机中再离心5min后收集上清液； D、 再次取上清液，用0.22μπι有机滤膜过滤后作为待测样品溶液； (3) 待测样品定性和定量检测： Α、取l.OyL待测样品溶液进样，用三重四级杆气相色谱-质谱联用仪分析检测，得到待 测样品溶液的总离子流色谱图、定量离子对色谱图和定性离子对相对丰度色谱图； B、 将步骤（1)配制的不同浓度的N-二甲基亚硝胺标准品溶液，用三重四级杆气相色谱-质谱联用仪分析检测，检测条件与待测样品溶液相同，获得标准品溶液的总离子流色谱图、 定量离子色谱图和定性离子对相对丰度色谱图； C、 以N-二甲基亚硝胺的定量离子对和定性离子对的色谱峰制作得到N-二甲基亚硝胺 标准曲线； D、 根据待测样品溶液中N-二甲基亚硝胺的定量离子对和定性离子对的色谱峰，结合标 准曲线，计算得到待测样液中N-二甲基亚硝胺的浓度C，并按以下公式计算得到熟肉制品中 N-二甲基亚硝胺的含量X，含量计算公式为： X = C*V/(M*1000) 其中X为待测样品中N-二甲基亚硝胺的含量，单位为mg/kg;C是待测样品中N-二甲基亚 硝胺的浓度，单位为ng/mL;V是待测样品溶解体积，单位为mL;M是待测样品质量，单位为g。2. 根据权利要求1所述的熟肉制品中N-二甲基亚硝胺检测方法，其特征在于，所述定量 离子对为74-42.1，定性离子对为73.9-42.1。3. 根据权利要求1所述的熟肉制品中N-二甲基亚硝胺检测方法，其特征在于，三重四级 杆气相色谱-质谱联用仪分析检测时所采用的参数分别为： A、 色谱条件 色谱柱为安捷伦HP-IN0WAX毛细管色谱柱，进样口温度250 °C，不分流进样，载气流速 0.887mL/min，进样量lyL;程序升温：初始温度60°C保持lmin，以40°C/min升到120°C，然后 再以5°C/min升到250°C保持3min。 B、 质谱条件 离子源：230°C，四级杆：150°C，传输线：250°C，扫描模式MRM，电离能量70eV，溶剂延迟 4.5min〇4. 根据权利要求3所述的熟肉制品中N-二甲基亚硝胺检测方法，其特征在于，所述载气 中氦气彡99.999%。5. 根据权利要求1所述的熟肉制品中N-二甲基亚硝胺检测方法，其特征在于，待测样品 为N-二甲基亚硝胺的判定方法为:待测样品和N-二甲基亚硝胺标准品保留时间相同，在相 同的定量离子对为74-42.1、定性离子对为73.9-42.1条件下，两者的定量离子对和定性 离子对相对丰度比值在80%-120%之间，判定为待测样品为N-二甲基亚硝胺。
【文档编号】G01N30/02GK106053634SQ201610345727
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年5月24日
【发明人】刘清亮, 姜利成, 孙艳丽, 张爽爽, 周秀枝, 代玲玲
【申请人】山东拜尔检测有限公司