强力霉素现场检测试纸及其制备、使用方法
【专利摘要】本发明涉及抗生素检测技术的改进，具体涉及现场检测试纸及其制备、使用方法，属于免疫学领域。包括：保藏号为CCTCC—C201680杂交瘤细胞DC?C所分泌的抗强力霉素、胶体金标记的单克隆抗体C，带有不干胶的载体板，在载体板的两端部，分别设有加样端吸水层和手持端吸水层，在该载体板中部设有由硝酸纤维膜制成的检测层，在该检测层与加样端吸水层交界处设有载有金标单抗C的玻璃纤维层块，玻璃纤维层块的一端设置在加样端吸水层之下，另一端设置在检测层之上，在与玻璃纤维层块延续的检测层上设有检测线和质控线，检测线和质控线处分别包被有DC?OVA和羊抗鼠IgG。本发明能够现场快速、简便、准确检测强力霉素，可用于现场对强力霉素药物残留的检测。CCTCC NO:C20168020160520
【专利说明】
强力霉素现场检测试纸及其制备、使用方法
技术领域
[0001] 本发明涉及抗生素检测技术的改进，具体涉及现场检测试纸及其制备、使用方法， 属于免疫学领域。
【背景技术】
[0002] 机制与四环素相同，主要是干扰敏感菌的蛋白质合成。它可以特异性地与细菌核 糖体30S亚基在A位置结合，从而抑制氨基酰-tRNA在该位置上的联结，阻止肽链的延长;强 力霉素还可以改变细菌细胞膜的通透性，使细胞内的核苷酸及其他重要成分漏出，从而抑 制细菌DNA的复制。强力霉素对金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌、淋球菌、脑膜 炎球菌、大肠杆菌、产气杆菌、志贺菌属、耶尔森菌、单核细胞李斯特菌等有较强抗菌活性， 对立克次体、支原体、衣原体、放线菌等也有一定作用。抗菌谱与四环素、土霉素基本相同。 体内、外抗菌力均较四环素强。
[0003] 强力霉素被吸收后广泛分布于各组织和体液，分布容积约为0.7L/kg。因脂溶性较 高，强力霉素对组织的穿透力较强，在胸导管淋巴液、腹腔积液、肠组织、眼和前列腺组织中 的药物浓度均较高，约为血药浓度的60 %~75 %，胆汁中的药物浓度可达血药浓度的10~ 20倍;在乳汁中也能达到较高的药物浓度;强力霉素也可以分布于肝脏、脾脏、骨髓、骨骼、 牙本质和牙釉质中。强力霉素在体内蛋白结合率为80%~95%，清除半衰期为12~22h，肾 功能减退者半衰期延长不明显。药物主要在肝脏内代谢灭活，通过肾小球滤过随尿液排泄， 当肾功能损害时，强力霉素从胃肠道的排泄量增加，成为主要的代谢途径。强力霉素不能经 透析清除。
[0004] 强力霉素目前在水产养殖行业作为一种较为普遍的抗感染药物使用，有着很好地 治疗作用，但在实际生产中往往会出现强力霉素过量的情况，导致水产品及养殖水体中存 在残留。根据农业部2002年12月发布的《动物性食品中兽药最高残留限量》明确规定，动物 性食品肌肉中残留量为100yg/kg，皮脂中最大残留量为300 yg/kg，肝脏中最大残留量为 300iig/kg，肾脏中最大残留量为600iig/kg。
【发明内容】
[0005] 本发明针对强力霉素残留的现状，以及其对人体的危害，设计发明提供一种能够 现场快速、简便、准确检测强力霉素的检测试纸及其制备、使用方法。
[0006] 本发明的技术方案实现如下
[0007] 强力霉素快速检测试纸条，其特殊之处在于包括:保藏号为CCTCC 一 C201680杂交 瘤细胞DC-C所分泌的抗强力霉素、胶体金标记的单克隆抗体C(简称:金标单抗C)，包被原强 力霉素-鸡卵清蛋白（DC-0VA)和羊抗鼠IgG，带有不干胶的载体板3，在载体板3的两端部，分 别设有加样端吸水层1和手持端吸水层7,在该载体板3中部段设有由硝酸纤维膜制成的检 测层6,在该检测层6与加样端吸水层1交界处设有载有金标单抗C的玻璃纤维层块2,玻璃纤 维层块2的一端设置在加样端吸水层1之下，另一端设置在检测层6之上，在与玻璃纤维层块 2延续的检测层6上设有检测线4和质控线5,检测线4和质控线5处分别包被有DC-OVA和羊抗 鼠 IgG;
[0008] 所述金标单抗C是由小分子半抗原强力霉素(DC)与牛血清白蛋白（BSA)通过戊二 醛(GA)法偶联合成的强力霉素-牛血清白蛋白（DC-BSA)完全抗原，将其作为免疫原而制备 的抗强力霉素单克隆抗体，经胶体金标记后而致；
[0009] 所述的胶体金标记的单克隆抗体C的制备步骤如下：
[0010] 1、以公知的胶体金的制备工艺制备胶体金溶液，制得的胶体金的颗粒大小为18-20nm;
[0011] 2、将单克隆抗体C(3g/L抗体蛋白），按200yl-3ml加入到上述的100ml胶体金溶液 中，慢搅混匀；
[0012] 3、向混合溶液中加入PEG20000,使其终浓度为1-5%，静置过夜；
[0013] 4、离心8000-10000转/分，1-1 ? 5小时，弃上清；
[0014] 5、取离心沉淀，用含有1-5 %PEG20000、0 ? 05-0 ? 25 %吐温-20、0 ? 02 %叠氮钠的 0.01mol/L磷酸盐缓冲液悬起，制成金标单抗C;
[0015]所述磷酸盐缓冲液的1^值为7.4，其中含有1((：10.28、他(：18.(^、1(1^〇4〇.2 8、 Na2HP〇4l2H20 2.9g、蒸馏水 1000ml;
[0016]所述步骤1中胶体金溶液的制备方法为按一定的配比将氯金酸与柠檬酸三钠混合 并加热制备成胶体金溶液；
[0017]所述步骤2中单克隆抗体C与胶体金溶液慢搅混勾30-60min。
[0018] 强力霉素快速检测试纸条的使用方法，其特殊之处在于包括以下步骤：
[0019] 将该试纸的加样端吸水层1插入或在其上滴加被检测样品，5-10min在位于检测层 6下端的检测线4处不显色，检测层上端的质控线5显示红色，表示样品中残有强力霉素;检 测线4处显示红色，质控线5显色，表示样品中没有强力霉素残留或是强力霉素浓度低于 0.2ug/ml〇
[0020] 本发明的优点在于:本发明以现有技术的实际特点，研制了一种强力霉素残留快 速现场检测试纸及其制备、使用方法，采用动物血液或是内脏如肝脏加适量的生理盐水碾 碎制备成检测样品液，对其进行检测，原理是采用竞争ELISA原理，即由金标单抗C同检测样 品液中的抗原反应，形成金标单抗C-强力霉素的复合物，此时，金标单抗C已经与强力霉素 结合，就不能够与检测线4处的DC-0VA结合，因此，金标单抗C与DC-0VA竞争结合强力霉素， 金标单抗C-强力霉素通过层析作用至质控线5处，羊抗鼠IgG能够与金标单抗C结合，胶体金 颗粒在此固定并累积出现肉眼可见的红色;若待测液中不含强力霉素，金标单抗C会与检测 线4处的DC-0VA结合出现红色，质控线显色代表该试纸条有效。
[0021] 本发明的特点是：1、本发明的强力霉素现场检测试纸，从实际的养殖需要出发，将 药物残留的检测搬到的养殖现场，使用时无需专门设施和操作技术，适合普通养殖户养殖 现场检测，应用简单。2、具有检测快速、简便、准确、灵敏等特点，并具有较高的稳定性，在5-10min之内便可显示检测结果，一旦检出超标可以将养殖动物多养一段时间，让药物代谢直 至残留低于国家标准，可以安全上市，是最方便的一种解决药残问题的方法，减少了因药物 残留对人体的伤害和养殖户因药残超标被退货造成巨大的损失。改善了因药残留送检麻 烦，周期长，收费高等原因造成99%以上养殖户在养殖动物上市前是不送检药残留的情况。
【附图说明】
[0022]图1:本发明强力霉素快速检测试纸条的结构示意图；
[0023]图2:本发明强力霉素快速检测试纸条的检测结果示意图。
[0024]杂交瘤细胞株DC-C，其保藏编号为:CCTCC N0:C201680;保藏单位全称及简称：中 国典型培养物保藏中心(CCTCC);保藏单位地址:湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中 心;保藏日期：2016年5月20日。
【具体实施方式】 [0025] 实施例1
[0026] 强力霉素完全抗原的制备:称取100mg BSA加入到10mL PBS(pH 7.4)中，称取3〇11^ DC溶于10ml PBS中，在DC溶液缓慢搅拌下逐滴加入BSA溶液，随后缓慢滴加200yL的GA(浓度 25% )，加入的同时要不断搅拌，在避光及4°C条件下反应24小时，以4000rpm转速离心5min， 取上清液装入提前处理好的透析袋中，PBS为透析液透析3d，每8h更换一次透析液，透析完 全后，偶联产物分装，-20 °C保存。相同的方法制备包被原DC-0VA。合成原理如下所示：
[0028] 实施例2
[0029]抗强力霉素的单克隆抗体的制备:本发明的分泌抗强力霉素的单克隆抗体的杂交 瘤细胞，其制备与选择的方法如下：
[0030] (1)用戊二醛法合成强力霉素完全抗原，包括免疫原DC-BSA，包被原DC-0VA;
[0031] (2)用免疫原DC-BSA免疫Balb/c小白鼠；
[0032] (3)将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞的融合，培养得166株杂交瘤细胞；
[0033] (4)用包被原DC-0VA包板间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞株；
[0034] (5)采用有限稀释法对其中1株阳性最强的杂交瘤细胞进行了克隆；
[0035] (6)通过间接ELISA法筛选出效价最高的抗强力霉素的单抗1B7-1F9二次克隆的细 胞株制备的抗体，制备金标单抗。见表1 [0036] 表1:单克隆抗体筛选结果
[0037]
[0038] 实施例3
[0039] 本发明的强力霉素单抗C的特异性鉴定:为了确定单克隆抗体是否能够特异性结 合强力霉素，就要对所得抗体做特异性检测及交叉实验，确定单抗与其他抗生素是否存在 交叉现象。分别配置〇.lμg/ml的强力霉素、土霉素、新诺明、盐酸诺氟沙星及氟苯尼考，采用 竞争ELISA的检测方法，对各种药物进行交叉实验。以DC-0VA为包被原，纯化后的单抗为第 一抗体，加入一抗后立即加入上述几种药物，每孔加lOOyl，以PBS作为对照，加入二抗及底 物缓冲液后，测定各个孔的0D值.结果显示强力霉素单抗C与这四种药物均不存在交叉现 象，强力霉素与阳性对照比较，存在差异，说明本实验制备的单抗与强力霉素发生特异性结 合，与其他抗生素不能够特异结合。实验结果参见表2。
[0040] 表2:抗强力霉素单克隆抗体特异性实验(&士 s，n = 6)
[0041]
[0042] 注强力霉素组与阳性相比较，其P值为0.0232<0.05,说明存在显著差异。
[0043] 实施例4
[0044]强力霉素快速检测试纸条，参见附图1，其包括:保藏号为CCTCC 一 C201680杂交瘤 细胞DC-C所分泌的抗强力霉素、胶体金标记的单克隆抗体C(简称:金标单抗C)，包被原(DC-0VA)和羊抗小鼠IgG(简称:羊抗鼠IgG)，带有不干胶的载体板3,在载体板3的两端部，分别 设有加样端吸水层1和手持端吸水层7,在该载体板3中部段设有由硝酸纤维膜制成的检测 层6,在该检测层6与加样端吸水层1交界处设有载有金标单抗C的玻璃纤维层块2,玻璃纤维 层块2的一端设置在加样端吸水层1之下，另一端设置在检测层6之上，在与玻璃纤维层块2 延续的检测层6上设有检测线4和质控线5,检测线4和质控线5处分别包被有DC-0VA(360ug/ ml)和羊抗鼠 IgG(lμg/ml)。
[0045] 实施例5
[0046] 胶体金标记的单克隆抗体C的制备步骤如下：
[0047] (1)胶体金的制备：18-20nm胶体金颗粒制备，将浓度为0.01 %氯金酸溶液250ml与 1 %柠檬酸钠6.65mr混合，加热至100摄氏度，制成胶体金溶液，该溶液的pH值：用0.2M碳酸 钟调至8.2，备用；
[0048] (2)金标单抗C的制备：
[0049]抗强力霉素单抗浓度为3g/L时，100ml胶体金标记的最适单抗量为1.5ml，按此比 例将抗强力霉素单抗加入到胶体金溶液中，慢搅50min，加入5%PEG20000，4°C过夜;然后将 其在4°C下，8000r离心60min;取离心沉淀，用含有含5%?￡620000、0.25%吐温20的 0.01mol/L磷酸盐缓冲液(KCL 0.2g，NaCL 8.0g，KH2P04 0.2g，Na2HP0412H20 2.9g，蒸馏水 1000ml，pH 7.4)悬起，再加叠氮钠将浓度调至0.02%，即制成金标单抗C。
[0050] 实施例6
[0051]本发明的强力霉素现场检测试纸检测层制备方法为:将DC-0VA360ug/ml用喷膜机 将其喷于硝酸纤维膜上，形成检测线4;同样，将羊抗小鼠IgG配成200iig/ml，用喷膜机将其 喷于硝酸纤维膜上，形成质控线5。两线相距5mm，质控线5近手持端吸水层，检测线4近加样 端吸水层。室温下晾干，再用pH 7.4,含5%PEG20000的O.Olmol/LPBS 37°C封闭30min，PBS 漂洗晾干。
[0052] 实施例7
[0053]本发明的强力霉素快速检测条检测的最低残留量为0.2ug/ml，低于农业部2002年 12月发布的《动物性食品中兽药最尚残留限量》规定的皮脂中最大残留量为300iig/kg，肝脏 中最大残留量为300lig/kg，肾脏中最大残留量为600iig/kg;尚于动物性食品肌肉中残留量 为100yg/kg，达到池边快速检测的目标。见表3 [0054]表3:强力霉素现场检测试纸灵敏的测定 「00551
[0056]注:+表示检测线颜色为红色，检测结果为阳性;-表示检测线为无色，检测结果为 阴性。
[0057] 实施例8
[0058] 本发明的强力霉素快速检测试纸条的使用方法，检测步骤如下:首先，从养殖的池 中取活鱼一条，取肝脏，按重量/体积(w/v)比1:2加入生理盐水或pH 6.0-8.0的磷酸盐缓冲 液，将肝脏碾碎，制备成检测样品；然后，将试纸的加样端1吸水层浸入试管的检测样品中 (液面不得超过吸水纸1的2/3)，5min读结果。
[0059]阳性结果:检验层6下部检测线4不显色，检验层6上部质控线5显示红色线，表示样 品有中残有强力霉素；
[0060]阴性结果:检验层6下部检测线4显示红色线，检验层6上部质控线5显色，表示样品 表示检测不到强力霉素或是强力霉素浓度低于〇.2ug/ml。详见附图2。
【主权项】
1. 强力霉素现场快速检测试纸，其特征在于包括:保藏号为CCTCC 一 C201680杂交瘤细 胞DC-C所分泌的抗强力霉素、胶体金标记的单克隆抗体C(简称金标单抗C)，包被原DC-OVA 和羊抗鼠 IgG，带有不干胶的载体板(3)，在载体板(3)的两端部，分别设有加样端吸水层（1) 和手持端吸水层(7)，在该载体板(3)中部设有由硝酸纤维膜制成的检测层(6)，在该检测层 (6)与加样端吸水层（1)交界处设有载有金标单抗C的玻璃纤维层块(2)，玻璃纤维层块(2) 的一端设置在加样端吸水层（1)之下，另一端设置在检测层(6)之上，在与玻璃纤维层块(2) 延续的检测层(6)上设有检测线(4)和质控线(5)，检测线(4)和质控线(5)处分别包被有DC-OVA和羊抗鼠 IgG。2. 根据权利要求1所述的强力霉素现场快速检测试纸，其特征在于所述金标单抗C是由 小分子半抗原强力霉素(DC)与牛血清白蛋白（BSA)通过戊二醛法偶联合成完全抗原DC-BSA 作为免疫原而制备的抗强力霉素单克隆抗体，经胶体金标记后而制备。3. 根据权利要求1所述的强力霉素现场快速检测试纸，其特征在于所述金标单抗C的制 备方法如下： (1) 以公知的胶体金的制备工艺制备胶体金溶液，制得的胶体金的颗粒大小为18-20nm; (2) 将单克隆抗体C(3g/L抗体蛋白），按200yl-3ml加入到上述的100ml胶体金溶液中， 慢搅混匀； (3) 向混合溶液中加入PEG20000，使其终浓度为1-5 %，静置过夜； (4) 离心8000-10000转/分，1-1.5小时，弃上清； (5) 取离心沉淀，用含有0.05-0.25%吐温-20、0.02%叠氮化钠的0.01mol/L磷酸盐缓 冲液悬起，制成金标单抗C。4. 按照权利要求3所述的氟苯尼考现场快速检测试纸，其特征在于步骤(1)中所述胶体 金溶液的制备方法为按一定的配比将氯金酸与柠檬酸三钠混合并加热制备成胶体金溶 液。5. 按照权利要求3所述的强力霉素现场快速检测试纸，其特征在于步骤(2)中单克隆抗 体C与胶体金溶液慢搅混匀30-60min。6. 强力霉素快速检测试纸条的使用方法，其特征在于包括以下步骤： 将该试纸的加样端吸水层（1)插入或在其上滴加被检测样品，5-10min在位于检测层 (6)下端检测线(4)不显色，检验层(6)上部质控线（5)显示红色线，表示样品有中残有强力 霉素;检验层(6)下部检测线(4)显示红色线，检验层(6)上部质控线(5)显色，表示样品表示 检测不到强力霉素或是强力霉素浓度低于0.2ug/ml，质控线处不显示红色，表示该试纸无 效。
【文档编号】G01N33/558GK106053798SQ201610596849
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年7月26日 公开号201610596849.9, CN 106053798 A, CN 106053798A, CN 201610596849, CN-A-106053798, CN106053798 A, CN106053798A, CN201610596849, CN201610596849.9
【发明人】王晓洁, 李楠
【申请人】鲁东大学