为了监测前列腺癌患者中的肿瘤进化进行循环肿瘤细胞的基因型和表型分析的制作方法

为了监测前列腺癌患者中的肿瘤进化进行循环肿瘤细胞的基因型和表型分析的制作方法
【专利摘要】本发明提供了用于预测前列腺癌(PCa)患者对激素介导疗法或化疗的响应的方法，包括(a)进行直接分析，包括在从患者获得的血液样品中进行有核细胞的免疫荧光染色和形态表征以识别并计数循环肿瘤细胞(CTC)；(b)分别表征基因型、形态学和蛋白表达参数以生成每种CTC的谱系，和(c)基于所述谱系预测前列腺癌PCa患者对激素介导疗法的响应。在一些实施方式中，所述方法包括在前列腺癌早期诊断之后在一个或更多个时间点重复步骤(a)至(c)以连续监测所述基因型、形态学和蛋白表达参数。
【专利说明】
为了监测前列腺癌患者中的肿瘤进化进行循环肿瘤细胞的基 因型和表型分析
技术领域
[0001] 本发明一般涉及癌症诊断领域，并且更具体而言，涉及用于预测前列腺癌(PCa)患 者对激素介导疗法的响应的方法。
【背景技术】
[0002] 在美国，前列腺癌(PCa)仍然是最常见的非上皮性癌症。仅在2014年，前列腺癌的 发病率预计是233000例，其中男性死亡29480人，使转移性前列腺癌治疗成为真正的尚未被 满足的医疗需求，Siegel et al，2014.CA Cancer J Clin.2014;64(l):9-29。来自欧洲的 流行病学研究显示类似的数据，在2012年估计新的发病率为416700例，占男性中癌症诊断 的22.8%。预计92200例PCa特异性死亡，使得它成为使男性最可能死亡的三种癌症中的一 种，死亡率为9.5%。
[0003] 雄激素-雄激素受体(AR)信号通路对前列腺癌的发生和发展是至关重要的，并且 是许多治疗药剂的关键靶标。在转移性前列腺癌(PCa)中，雄激素剥夺疗法(ADT)构成了通 过抑制AR激活而诱导肿瘤消退的黄金标准治疗。尽管起初响应于ADT，但是患者常常产生抵 抗性并进展为去势抵抗性前列腺癌(CRPC)，一种无法治愈的预后不良的疾病。这些患者往 往利用包括例如非留体抗雄激素和雄激素合成抑制剂之类的药剂的冲击激素介导疗法进 行治疗。在管控这些治疗时，预测治疗响应并识别治疗抵抗性的早期指标是主要的挑战。测 量的血清中雄激素调节蛋白即前列腺特异性抗原(PSA)的水平用于监测CRPC患者的治疗响 应，然而，对于该患者群而言其预测能力是有限的。此外，虽然许多研究已经识别了可导致 对雄激素靶向剂产生治疗抵抗的分子事件，但是难以应用这些发现，因为相继获得的组织 的供应有限并且预期的异质性跨越存在于任何个别患者中的多个转移灶。因此，将允许非 侵入性连续监测整个临床治疗过程的方法将对临床医生而言具有巨大的价值。
[0004] 循环肿瘤细胞(CTC)具有提供在治疗期间实时评估进展性癌症的非侵入性方法的 潜力，并且通过监测发生在治疗响应中的表型生理和遗传变化进一步帮助直接治疗。在大 多数CRPC患者中，原发肿瘤被切除，并且预计CTC由从转移脱落的细胞组成，提供"液体活 检"。目前，批准用于CTC计数(CellSearch Veridex)的唯一方法基于预先选择表达上皮细 胞粘附分子(EpCAM)即上皮细胞表面标记的细胞的免疫富集方法。虽然使用CellSearch的 CTC的数字量化在某些癌症患者中获得了一些预后信息，但是此方法具有局限性例如低灵 敏度(EpCAM表达低或不表达的细胞将不被捕获)和阻碍进一步的分子表征和数据解释的样 品制备中基因正常白细胞的规律出现/污染。最近，已在利用CellSearch系统分离的CTC上 报告了基于阵列CGH和有限的测序的基因组变异。成对肿瘤和转移(n = 2)和CTC(n = 8)中的 详细分析表明在CTC中检测的大多数突变以低水平存在于原发肿瘤中。然而，因为在疾病的 临床过程中研究了单时间点，所以此研究没有解决肿瘤如何可响应并发展成治疗压力。
[0005] 存在对诊断方法的需求，所述诊断方法提供对以单细胞水平发生的分子变化的更 全面的描述，在CRPC患者中在ADT和化疗情形中的治疗压力下允许不同的CTC亚种群的出现 与疾病的临床过程相结合。本发明通过使形态学和蛋白质表达数据与在临床上重要的时间 点分离的个体CTC的全基因组CNV改变相关联通过能随时间追踪患者CTC群体的分子变化而 解决了此需求。同时提供了相关的优点。

【发明内容】

[0006] 本发明提供了用于预测前列腺癌(PCa)患者对激素介导疗法的响应的方法，包括 (a)进行直接分析，包括在从患者获得的血液样品中进行有核细胞的免疫荧光染色和形态 表征以识别并计数循环肿瘤细胞(CTC) ;(b)分别表征基因型、形态学和蛋白表达参数以生 成每种CTC的谱系(profile)，和(c)基于所述谱系预测前列腺癌PCa患者对激素介导疗法的 响应。
[0007] 本发明提供了用于预测前列腺癌(PCa)患者对化疗的响应的方法，包括(a)进行直 接分析，包括在从患者获得的血液样品中进行有核细胞的免疫荧光染色和形态表征以识别 并计数循环肿瘤细胞(CTC) ;(b)分别表征基因型、形态学和蛋白表达参数以生成每种CTC的 谱系，和(C)基于所述谱系预测前列腺癌PCa患者对化疗的响应。
[0008] 在具体的实施方式中，所述方法进一步包括在形态学和蛋白表达参数表征之后和 基因型参数表征之前分离CTC。
[0009] 在一些实施方式中，所述方法包括在前列腺癌早期诊断之后在一个或更多个时间 点重复步骤(a)至(c)以连续监测所述基因型、形态学和蛋白表达参数。在一些实施方式中， 所述时间点是间隔的，与CRPC标准护理中预期的决策点一致。在一些实施方式中，所述时间 点与PCa的临床进展一致。
[0010] 在一些实施方式中，所述方法进一步包括通过基因组分析识别每种CTC的克隆谱 系。在另外的实施方式中，所述癌症是转移性去势抵抗性PCa(mCRPC)。在一些实施方式中， 所述激素介导疗法包括雄激素剥夺疗法(ADT)，其可以是一线或二线激素疗法。在一些实施 方式中，所述二线激素疗法阻碍雄激素的合成并选自醋酸阿比特龙、酮康唑和氨鲁米特所 组成的组。
[0011] 在用于预测前列腺癌（PCa)患者对激素介导疗法的响应的方法的一些实施方式 中，有核细胞的免疫荧光染色包括广谱系细胞角蛋白、分化聚类(CD)45、二脒基-2-苯基吲 哚(DAP I)和雄激素受体(AR)。
[0012] 在公开的用于预测前列腺癌(PCa)患者对激素介导疗法或化疗的响应的方法的一 些实施方式中，所述基因型参数包括基因组变异，包括例如结构性变异(SV)和拷贝数变异 (CNV)，简单的核苷酸变异(SNV)，包括单核苷酸多态性(SNP)和小的插入和缺失（INDEL)。在 用于预测前列腺癌(PCa)患者对激素介导疗法或化疗的响应的方法的【具体实施方式】中，所 述基因型的参数包括拷贝数变异(CNV)标记。在一些实施方式中，CNV是基因扩增或缺失。在 进一步的实施方式中，基因扩增包括与雄激素非依赖性细胞生长相关的基因，例如，ARSv-myc禽骨髓细胞瘤病毒致癌基因同源物(MYC)。在一些实施方式中，所述基因型参数由下一 代测序(NGS)检测。
[0013] 在用于预测前列腺癌(PCa)患者对激素介导疗法或化疗的响应的方法的一些实施 方式中，所述蛋白表达参数包括量化蛋白表达水平或蛋白表达的亚细胞定位。在进一步的 实施方式中，通过使用高分辨率免疫荧光成像测量免疫荧光信号强度量化蛋白表达水平。 在具体的实施方式中，蛋白表达是AR表达。在用于预测前列腺癌(PCa)患者对激素介导疗法 的响应的方法的一些实施方式中，所述形态学参数包括细胞的形状。
[0014] 在公开的用于预测前列腺癌(PCa)患者对激素介导疗法或化疗的响应的方法的一 些实施方式中，基于时间点之间的谱系的比较预测所述响应。在公开的用于预测前列腺癌 (PCa)患者对激素介导疗法或化疗的响应的方法的一些实施方式中，所述预测的响应是指 抵抗性疾病的出现。在具体的实施方式中，抵抗性CTC的识别与抵抗性疾病的出现相关并且 抵抗性CTC代表主导抵抗疾病的克隆谱系。在一些些实施方式中，AR阳性CTC的重新出现预 测抵抗疾病的出现。在进一步的实施方式中，AR阳性CTC的重新出现伴随着基因组变异例如 AR或MYC扩增。在一些实施方式中，AR阳性CTC的重新出现伴随着形态学变化例如细胞圆度 降低。在具体的实施方式中，所述方法包括识别抵抗性CTC是否是AR非依赖性的、AR配体非 依赖性的或二者兼而有之。在一些实施方式中，识别抵抗性CTC是否是AR非依赖性的、AR配 体非依赖性的或二者兼而有之预知后续的治疗选择或治疗变化，例如，如果抵抗性细胞是 AR阳性的，那么患者是AR靶向治疗的候选者，尽管是AR配体非依赖性的。
[0015] 在公开的用于预测前列腺癌(PCa)患者对激素介导疗法或化疗的响应的方法的一 些实施方式中，分离CTC涉及从最初的图像采集再定位，使CTC重新成像并物理提取CTC。
[0016] 通过详细描述以及权利要求书，本发明的其他特征和优点将变得显而易见。
【附图说明】
[0017] 专利或申请文件包括至少一个彩色图片。根据专利局请求并支付必要的费用将提 供带有彩色图的该专利或专利申请出版物的副本。
[0018] 图1。醋酸阿比特龙导致CTC群体的表型改变。平面图(A)测定治疗干预过程中采集 的每次采血的总HD-CTC计数，包括表型不同的AR+和AR2细胞的数量。如果AR信号强度高于 周围白细胞(情形）的平均值(SDOM)的标准偏差的6倍的话，那么CTC被定义为AR阳性。条状 图显示AR+和AR2CTC亚群随疗程的分布变化，分别以红色和蓝色表示，并且每种条上呈现数 量。平面图⑶在每种治疗时间点测量的PSA浓度。平面图（C)在不同治疗时间点识别的每种 单独的CTC的细胞圆度的箱线图。平面图（D)代表在每种治疗时间点识别的亚群的AR+和 AR2HD-CTC的40 X免疫荧光图像。免疫荧光通道颜色如下:细胞核:蓝色，细胞角蛋白：红色； AR:白色；和⑶45:绿色。AR表型在每张图的左下角表示。使用R中的ggplot2和rgl包构建所 有图。
[0019] 图2。单个前列腺肿瘤细胞的同时表型和基因型分析。显示了四个治疗时间点中的 每一个的患者骨转移的拷贝数变异特征;对照单个WBC;和单个CTC。用于生成CNV特征的细 胞的相应的荧光图像显示在右侧。每个特定抽血中发生的相关的基因变异及其染色体本地 化以淡蓝色条表示。
[0020] 图3XTC群体中的克隆和基因组畸变。平面图（A)基于无监管的层次聚类中的41个 单细胞CNV谱系的对比识别表示为聚类A、B和C的三种不同的克隆谱系。从所抽得血液中分 离每种细胞，表示为抽血1:黄色；抽血2:橙色；抽血3:紫色；以及抽血4:黑色。供参考，骨转 移FFPE组织包括在树状图中，颜色为绿色。树状图下，热点图表示每种单个细胞的整个基因 组的扩增(红色)和缺失（蓝色）。平面图（B)所识别的三个聚类中的基因组频率扩增和缺失 的频率。重点突出聚类A和C中唯一扩增(红色)或缺失(蓝色）的区域。平面图（C)示出了每种 单独的聚类的每种抽血的AR扩增事件颜色的详细情节。
[0021 ]图4。疾病进展时AR亚细胞定位变化。平面图（A)在阿比特龙治疗之前和之后9周在 血液中识别的CTC的AR亚细胞定位的对比。细胞内的AR和DAP I信号之间的相关性指示AR是 利用DAPI定位的，即定位在细胞核内。阿比特龙治疗之前通常为高相关性，但是治疗9周后 观察到转变为较少细胞核染色(p = 〇 .00017，Wilcoxon sum-rank检验）。平面图（B)和平面 图（D)由代表性CTC中的CK(红色）、AR(绿色)和DAPI(蓝色）的像素强度构建的高度图以使AR 亚细胞定位可视化。在阿比特龙启动之前分离平面图（B)中的细胞并且显示AR染色局限于 细胞核，而在治疗复发平面图(D)时识别的CTC中观察到细胞质AR染色。平面图（C)和平面图 (E)分别为平面图（B)和平面图（D)中CTC的406个图像中细胞内每个像素的AR对比DAPI信号 强度的曲线图。每一个曲线点由相应的CK信号强度染色。观察到两个强度平面图（C)之间的 细胞核本地化为正相关并且细胞核排除为负相关平面图（E)。使用R中的ggplot2和rgl包完 成所有图。
[0022]图5。所识别的两种表型不同的CTC亚群的40X高分辨率免疫荧光图像的代表图。A 和B，从多西他赛前(A)和阿比特龙前(B)治疗时间点分离的AR+和AR-HD-CTC的组合和未组 合的图像。C和D，即两种不同的AR-和AR+HD-CTC，是阿比特龙之后3周(C)和9周(D)存在的主 要肿瘤细胞表型。平面图D，具有不同模式的AR亚细胞定位的CTC。细胞核和细胞质AR显示在 顶部平面中并且细胞核AR显示在底部平面中。个体免疫荧光通道的组合和非组合图像的颜 色为:DAPI (蓝色）；细胞角蛋白-CK(红色）、雄激素受体-AR(白色)和⑶45(绿色）。
[0023] 图6。单个CTC CNV谱系的完整集合。在每个不同的治疗时间点所有成功谱系的细 胞的全基因组拷贝数指纹。
[0024] 图7。细胞圆度评估的实例。通过追踪每种CTC的组合图像中的细胞细胞质谱系来 分析细胞形状。将所追踪的细胞图像导入R，并且使用Halir和Flusser描述的最小二乘拟合 算法拟合椭圆形状，Proceeding of International Conference in Central Europe on Computer Graphics,Visualization and Interactive Digital Media:125-132(1998)〇 黑线代表手工绘制的细胞谱系，红色线为拟合的椭圆。将细胞圆度评估为实际细胞面积和 半径设置为细胞长轴的圆面积的积分。椭圆形细胞(左）的细胞圆度计算为0.62,并且更圆 的细胞(右)计算为0.96。使用Wilcoxon rank-sum检验计算不同图之间分离的CTC之间的圆 度对比中所用的P值。
[0025]图8。在41个单个细胞谱系中分析了不同表型和基因型特征的拷贝数变化总结。通 过利用每种个体细胞的AR染色表型（阴性或阳性)对比AR扩增状态来测定AR表型-基因型之 间的一致性。红色是表现出不一致的AR表型-基因型的细胞。
[0026]图9。显示来自患者JH33164的原发肿瘤的两个块中和循环细胞中的雄激素受体 (AR)基因的外显子和内含子中单核苷酸变异（SNV)的表。聚类A、B、C代表通过NextGen测序 基于拷贝数(CNV)谱系的不同谱系的循环细胞。使用靶向PCR引物扩增AR基因的每个外显子 进行每种单个细胞的扩增DNA直接测序，然后使用条形码Illumina测序适配器进行多重测 序。
【具体实施方式】
[0027]本发明公开内容部分地基于实现了使基因组事件与癌症患者的CTC中利用时间分 辨率的单细胞水平的复杂表型变异的相关性。重要地，本文所公开的方法能够检测在疾病 的临床过程中具有特定分子变异的不同CTC亚群的出现。基于特征在于基因型、形态和蛋白 表达变异的这些不同的CTC亚群的检测，本文所公开的方法能预测接受靶向激素治疗的前 列腺癌患者的抵抗性和临床逃逸并允许临床干预。
[0028] 本发明公开内容基于通过使在临床上显著的时间点分离的个体CTC的形态和蛋白 表达数据与全基因组CNV变异相关联而捕获CTC群体的分子变化的能力。
[0029] 如本文所公开的，本发明提供了实现在ADT和化疗情形两者中的治疗压力下在 CRPC患者中以单细胞水平出现的分子变化的全面图像的新方法。高清晰度-CTC(HD-CTC)法 用于CTC的纵向鉴别和计数(Marrinucci et al,Phys Biol 9:016003(2012))以及AR表达 的评估。Lazar et al，Phys Biol 9:016002(2012)。该方法采用不带偏见的方案通过使用 高分辨率免疫荧光成像基于它们的细胞角蛋白阳性(CK+)表型检查并区分周围白细胞中的 CTC。此外，HD-CTC技术保留细胞形态使得对血液样品中识别的所有CTC的AR和CK蛋白表达 水平进行形态测定和间接定量。为了进一步表征每个CTC，制定方案用于在适于随后的基因 组分析的条件下通过修改Navin et al,Nature 472:90-94(2011)和Baslan et al,Nat Protoc 7:1024-1041 (2012)描述的单核测序方法提取单个细胞。
[0030] 本发明公开内容的基本和有利的方面是相对于CTC检测而言所公开方法具有无与 伦比的稳健性。关于CTC的本文公开的稀有事件检测基于直接分析，即在周围非罕见事件的 情形下涵盖罕见事件识别的非富聚类体。根据所公开的方法的罕见事件的识别固有地识别 周围事件为非罕见事件。考虑到周围非罕见事件并测定非罕见事件的平均值例如非罕见的 事件的平均细胞尺寸，允许通过去除噪声校准检测方法。结果是可不利用不基于直接分析 的方法实现的公开方法的稳健性，而是利用固有扭曲上下文对比罕见事件对比富集群体。 本文所公开的的直接分析方法的稳健性能对包括本文所描述的CTC亚型的HD-CTC进行识 另IJ、计数和表征，其使得能对不能利用其他CTC检测方法来实现并且能在所要求保护的方法 的情形下分析基因型和表型变化的相关性的血液样品中所识别的所有CTC的AR和CK蛋白表 达水平进行形态测定和间接定量。
[0031] 通过多西他赛的使用极大改善了前列腺癌中的药物治疗的快速发展，因为其关键 性在2004年被美国食品和药物管理局(FDA)批准，并且开辟了新纪元，其中取得的进展不止 于雄激素剥夺治疗(ADT)的使用，以及新的激素药物、免疫治疗剂、二线化疗剂和放射性药 物的增加。测序的选择目前依赖于患者谱系，无论存在或不存在转移性疾病症状。虽然使用 这些疗法使生存结果无可否认地得到改善，但是疾病将最终在每个疗程均进展。
[0032]睾酮或更有效的二氢睾酮(DHT)形式的雄激素已经是前列腺癌进展和前列腺分化 的定义明确的驱动者。因此，当睾丸切除术形式的去势手术取得了显著的前列腺肿瘤消退 时，十年前建立了晚期前列腺癌治疗的骨干。从那时起，由于患者的偏好已经主要采用取代 化学去势。因此ADT已成为局部晚期或转移性前列腺癌的标准全身治疗。虽然ADT在大多数 患者中几乎总是有效的，但是病情进展至去势抵抗性不可避免地发生。现在越来越多地认 识到，雄激素受体(AR)仍然过表达，虽然看似丧失睾酮水平，因为替代受体可激活AR或可能 有助于延续去势抵抗性表型的其他目标基因，因此术语"去势抵抗性"已经成为广泛采用的 文学。对这些雄激素在刺激前列腺癌生长中的作用的理解增多导致开发和批准阿比特龙和 恩杂鲁胺。
[0033] 使用药物直接或间接攻击癌细胞的化疗治疗，目的是破坏癌细胞或减缓它们的生 长。如果患者对激素疗法无响应并且癌症已经扩散到前列腺外面的话，那么可推荐对前列 腺癌进行化疗。化疗是使用药物破坏癌细胞，通常通过停止其生长和分裂的能力。全身化疗 是通过血流输送到整个身体而到达癌细胞。对前列腺癌进行化疗可有助于晚期或去势抵抗 性前列腺癌患者。
[0034] 必须注意的是，如在本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式"一个"、 "一种"和"所述"包括复数对象，除非上下文另有明确规定。因此，例如，提及"一种CTC"包括 两种或更多种CTC的混合物等等。
[0035]术语"约"尤其是涉及给定的量时，意指包括正负百分之五的偏差。
[0036] 如在本申请包括所附权利要求书中所用的，单数形式"一个"，"一种"和"所述"包 括复数参考，除非上下文另有明确规定，并且可与"至少一个"和"一个或更多个"互换使用。
[0037] 如本文所用的，术语"包含"、"包括"、"含有"及其任何变型，旨在覆盖非排他性包 括，使得包含、包括或含有要素或要素列表的工艺、方法、副产物工艺或物质组合物不仅包 括那些要素，而是可包括未明确列出或这些工艺、方法、副产物工艺或物质组合物固有的其 他要素。
[0038] 本文所用的术语"患者"优选指人，但也包括其他哺乳动物。应当注意的是，如本文 所用的术语"有机体"、"个体"、"受试者"或"患者"被用作同义词并且可互换。
[0039]如本文所用的术语"循环肿瘤细胞"或"CTC"意指包括生物样品中所存在的任何稀 有细胞，并且与前列腺癌相关。CTC，其可以作为单细胞或CTC聚类存在，通常是患者循环中 以非常低浓度存在的从实体肿瘤脱落的上皮细胞。
[0040]如本文所用的，"HD-CTC"是指细胞角蛋白阳性、⑶45阴性的单个CTC，含有DAPI细 胞核，并且在形态上与周围的白血细胞不同。
[0041 ]如本文所用的，"HD-CTC分析"或"HD-SCA"（高清晰度单细胞分析）是指基于基因 型、形态学和蛋白表达参数生成每个CTC的谱系的任何CTC分析。在CTC和SC分析的情形下高 清晰度因此是指样品中存在的所有CTC或罕见细胞的高内容物分析并且不限于HD-CTC分 析。
[0042] 在一个实施方式中，本公开内容提供了用于预测前列腺癌(PCa)患者对激素介导 疗法的响应的方法，包括(a)进行直接分析，包括在从患者获得的血液样品中进行有核细胞 的免疫荧光染色和形态表征以识别并计数循环肿瘤细胞(CTC) ;(b)分别表征基因型、形态 学和蛋白表达参数以生成每种CTC的谱系，和(c)基于所述谱系预测前列腺癌PCa患者对激 素介导疗法的响应。
[0043] 在一个实施方式中，本公开内容提供了用于预测前列腺癌(PCa)患者对化疗的响 应的方法，包括(a)进行直接分析，包括在从患者获得的血液样品中进行有核细胞的免疫荧 光染色和形态表征以识别并计数循环肿瘤细胞(CTC) ;(b)分别表征基因型、形态学和蛋白 表达参数以生成每种CTC的谱系，和(c)基于所述谱系预测前列腺癌PCa患者对化疗的响应。
[0044] 在进一步的实施方式中，本公开内容提供了用于预测前列腺癌(PCa)患者对激素 介导疗法的响应的方法，包括(a)进行直接分析，包括在从患者获得的血液样品中进行有核 细胞的免疫荧光染色和形态表征以识别并计数循环肿瘤细胞(CTC) ;(b)分别表征基因型、 形态学和蛋白表达参数以生成每种CTC的谱系，（c)基于基因组分析识别每种CTC的克隆谱 系，（d)将每种CTC分配给克隆谱系，和(e)基于所述谱系和所述克隆谱系预测前列腺癌PCa 患者对激素介导疗法的响应。
[0045] 在进一步的实施方式中，本公开内容提供了用于预测前列腺癌(PCa)患者对化疗 的响应的方法，包括(a)进行直接分析，包括在从患者获得的血液样品中进行有核细胞的免 疫荧光染色和形态表征以识别并计数循环肿瘤细胞(CTC) ;(b)分别表征基因型、形态学和 蛋白表达参数以生成每种CTC的谱系，（c)基于基因组分析识别每种CTC的克隆谱系，（d)将 每种CTC分配给克隆谱系，和(e)基于所述谱系和所述克隆谱系预测前列腺癌PCa患者对化 疗的响应。
[0046] 在一些实施方式中，所述方法进一步包括在形态学和蛋白表达参数表征之后和所 述基因型参数表征之前分离CTC。在一些实施方式中，本发明的方法包括从患者提供或获取 血液样品的初始步骤。
[0047]在转移性前列腺癌(PCa)中，雄激素剥夺疗法(ADT)通过抑制AR激活诱导肿瘤消退 构成了黄金标准治疗。ADT可包括被批准治疗前列腺癌的促黄体激素释放激素(LHRH)激动 剂，包括例如亮丙瑞林（16卯1"〇11(16)、戈舍瑞林(〖086代1；[11)、和布舍瑞林(131186代1；[11)。尽 管起初响应于ADT，但是患者常常产生抵抗性并发展成去势抵抗性前列腺癌(CRPC)，一种无 法治愈的预后不良的疾病。这些患者往往利用冲击激素介导疗法(包括例如非留体抗雄激 素和雄激素合成抑制剂之类的药物)进行治疗。在一些实施方式中，所述癌症是转移性去势 抵抗性PCa(mCRPC)。在另外的实施方式中，所述激素介导疗法包括雄激素剥夺疗法(ADT)。 在进一步的实施方式中，ADT是二线激素疗法。在进一步的实施方式中，所述二线激素疗法 阻碍雄激素的合成并选自醋酸阿比特龙、酮康唑和氨鲁米特所组成的组。醋酸阿比特龙 ((Zytiga; Janssen Biotech, Inc .Horsham,PA,USA)是FDA批准的雄激素生物合成抑制剂， 其阻断细胞色素 P450-cl7(CYP17)，导致抑制来源于肾上腺、前列腺肿瘤和肿瘤微环境的雄 激素。
[0048] 预测前列腺癌(PCa)患者对激素介导疗法的响应的方法包括进行直接分析，包括 对从患者获得的血液样品中的有核细胞进行免疫荧光染色和形态表征以识别和计数循环 肿瘤细胞(CTC)。如本文所用的，在生成CTC数据的情形中，术语"直接分析"意指与在检测之 前富集CTC样品之后相反在样品中存在的所有周围有核细胞的情形下检测CTC。在一些实施 方式中，所述方法包括提供包括CTC和至少200个周围白细胞(WBC)的视野的显微镜法。所公 开的方法缺乏富集能基于它们的细胞角蛋白阳性(CK+)表型通过使用高分辨率免疫荧光成 像使用无偏性方法检查和区分周围白细胞中的CTC。此外，本文所述的HD-CTC技术保留细胞 形态使得对血液样品中识别的所有CTC的AR和CK蛋白表达水平进行形态测定和间接定量。 本发明的方法的进一步的能力是在适于本文所公开的随后基因组分析的条件下提取单个 细胞的能力。如下文进一步描述的，有核细胞的免疫荧光染色包括广谱系细胞角蛋白、分化 聚类(⑶)45、二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)和雄激素受体(AR)。
[0049] 在一些实施方式中，基于基因型、形态学和蛋白表达参数分别表征CTC以生成每个 CTC的谱系。在公开的用于预测前列腺癌(PCa)患者对激素介导疗法或化疗的响应的方法的 一些实施方式中，所述基因型参数包括基因组变异，包括例如结构性变异(SV)和拷贝数变 异(CNV)，简单的核苷酸变异(SNV)，包括单核苷酸多态性(SNP)和小的插入和缺失（INDEL)。 在具体的实施方式中，所用的基因型参数包括拷贝数变异(CNV)标记的检测，包括基因组扩 增和缺失。在进一步的实施方式中，所测量的基因组包括所检测的基因组变异的数量和/或 新基因组变异出现的速度。在一些实施方式中，所述基因组扩增和缺失影响包含致癌基因 或AR信号轴中所含的基因的区域。在进一步的实施方式中，基因扩增包括与雄激素非依赖 性细胞生长相关的基因，例如，AR或v-myc禽骨髓细胞瘤病毒致癌基因同源物(MYC)。在一些 实施方式中，所述基因型参数由下一代测序(NGS)检测。本领域技术人员应当理解的是，本 发明的方法中使用的序列分析可以使用任何有用的测序技术，包括但不限于扩增、聚合酶 链反应（PCR)、实时PCR(qPCR;RT-PCR)、Sanger测序、下一代测序、限制片段长度多态性 (RFLP )、焦磷酸测序、DNA甲基化分析或其组合。
[0050] 在一些实施方式中，用在实施本文所公开的方法中的蛋白表达参数包括量化蛋白 表达水平和蛋白表达的亚细胞定位。在一些实施方式中，通过使用高分辨率免疫荧光成像 测量免疫荧光信号的强度间接量化蛋白表达水平。
[0051] 在一些实施方式中，用在实施本文所公开的方法中的形态学参数包括细胞形状， 特别是细胞圆度。通过追踪每种CTC的合成图像中的细胞细胞质谱系可分析细胞形状(细胞 圆度）。所追踪的细胞图像可以被导入到R中，并且使用Halir and Flusser,Proceeding of International Conference in Central Europe on Computer Graphics,Visualization and Interactive Digital Media: 125-132(1998)描述的最小二乘拟合算法将椭圆形拟合 成形状。算法输出细胞的长轴，是下述示例中所述的拟合椭圆形的最大半径。
[0052] 在某些实施方式中，公开内容提供了用于预测前列腺癌(PCa)患者对激素介导疗 法或化疗的响应的方法，包括(a)进行直接分析，包括在从患者获得的血液样品中进行有核 细胞的免疫荧光染色和形态表征以识别并计数循环肿瘤细胞(CTC) ;(b)分别表征基因型、 形态学和蛋白表达参数以生成每种CTC的谱系，和(c)在前列腺癌初始诊断之后在一个或更 多个时间点重复步骤(a)至(b)，和(d)在前列腺癌初始诊断之后基于在不同时间点连续监 测的谱系预测前列腺癌患者对激素介导疗法的响应。在具体的实施方式中，相对于临床进 展或治疗(包括例如全身化疗、激素介导疗法或辐射)选择时间点。在一些实施方式中，以代 表在CRPC标准治疗中的决策点的间隔在时间点抽取血液样品（图）。例如，除了在初始诊断 的时候抽取样品之外，时间点可以在开始基于多西他赛的化疗之前、在二线激素治疗(例如 醋酸阿比特龙或另一种高选择性雄激素合成抑制剂)开始之前以及二线治疗开始之后的间 隔，例如，在连续阿比特龙治疗2、3、4、5、5、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、26或更多个周之后。在一些实施方式中，如果检测到临床症状的变化，那 么在持续/连续治疗过程中抽血。
[0053] 在某些实施方式中，预测前列腺癌(PCa)患者对激素介导疗法或化疗的响应的方 法包括时间点之间的CTC谱系对比。在一些实施方式中，所预测的响应是抵抗性疾病的出 现。在某些实施方式中，出现抵抗性疾病的预测反应是基于在任何时间点抽取的血液中抵 抗性CTC的识别。在进一步的实施方式中，抵抗性CTC被分配给主导抵抗性疾病的克隆谱系。 [0054]在一些实施方式中，在疾病过程中在之前的时间点已耗尽的AR阳性CTC的重新出 现预测抵抗性疾病的出现。在一些实施方式中，AR阳性CTC的重新出现伴随着在之前的时间 点提取的CTC中不占主导地位的基因组变异。在进一步的实施方式中，基因组变异包括AR或 MYC扩增。在另外的实施方式中，AR阳性细胞的重新出现进一步伴随形态学改变，特别是细 胞圆度降低。
[0055] 在临床逃逸和抵抗性疾病出现之前识别代表抵抗性克隆群体的CTC的存在、出现 或重新出现的能力构成关于前列腺癌(PCa)患者对激素介导疗法或化疗的响应的要求保护 的方法的预测力。预测前列腺癌(PCa)患者对激素介导疗法的响应的能力可以在关键时期 临床逃逸过程中告知治疗决策，并为临床医生提供可操作的信息以随后进行治疗疗程。在 一些实施方式中，测定抵抗性CTC是否是AR非依赖性的、AR配体非依赖性的或者两者可以告 知后续的治疗决策，例如，如果抵抗性细胞是AR阳性的，那么该患者是AR靶向治疗的候选 者，尽管是AR配体是非依赖性的。
[0056] 广义上来说，生物样品可以是包含CTC的任何样品。样品可包括体液，例如血液;细 胞制备物的可溶性部分，或其中细胞生长的整份介质;染色体、细胞器或从细胞分离或提取 的膜;溶液中的或结合至衬底上的基因组DNA、RNA或cDNA;细胞;组织；组织印迹;指纹图谱 系;细胞;皮肤等。从受试者获得的生物样品可以是包含细胞和包含其中CTC可被探测到的 任何材料的任何样品。样品可以是例如全血、血浆、唾液或包含细胞的其他体液或组织。 [0057]在具体的实施方式中，生物样品是血液样品。如本文所述，样品可以是全血液样 品，更优选外周血或外周血细胞分数。本领域技术人员应当理解的是，血液样品可包括血液 的任何部分或组分，但不限于T细胞、单核细胞、中性粒细胞、红细胞、血小板和微囊泡(例如 外泌体或外泌体样囊泡）。在此公开内容的情形下，血液样品中包含的血细胞包含任何有核 细胞并且不限于全血组分。因此，血液细胞包括例如白细胞(WBC)以及包括CTC的罕见的细 胞。
[0058]本公开内容的样品可各自包含通过本领域中公知的方法(例如，FACS、免疫组织化 学)可区分的多个细胞群和细胞亚群。例如，血液样品可包含非有核细胞群例如红细胞(例 如4-5百万AU)或血小板（150000-400000个细胞AU)和有核细胞群例如WBC(例如4500-10000个细胞AU)、CEC或CTC(循环肿瘤细胞;例如，2-800个细胞AU) JBC可含有例如中性 粒细胞(2500-8000个细胞/μL)、淋巴细胞（1000-4000个细胞/μL)、单核细胞（100-700个细 胞AU)、嗜酸性粒细胞(50-500个细胞/μL)、嗜碱性粒细胞(25-100个细胞/μL)的细胞亚群 等。本公开内容的样品是非富集的样品，即它们未富集任何特定的有核细胞群或亚群。例 如，非富集血液样品未富集CTC、WBC、B细胞、T细胞、NK细胞、单核细胞等。
[0059]在一些实施方式中，样品是来自健康受试者或基于本领域已知的临床上建立的标 准包括例如年龄、种族、谱系和病史被认为具有前列腺癌高风险或现有前列腺癌的转移高 风险的受试者的血液样品。在一些实施方式中，血液样品来自基于组织或液体活组织检查 和/或手术或临床理由已被诊断患有前列腺癌和/或mCRPC的受试者。在一些实施方式中，血 液样品来自表现出本领域公知的前列腺癌和/或mCRPC的临床表现或表现出前列腺癌和/或 mCRPC的任何已知风险因素的受试者。
[0060]在一些实施方式中，预测前列腺癌(PCa)患者对激素介导疗法或化疗的响应的方 法可进一步包括个体患者风险因素和成像数据，其包括本领域中公知并使用的任何形式的 成像模式，例如并不限于通过X射线计算机断层扫描（CT)、超声、正电子发射断层扫描 (PET)、电阻抗成像和磁共振(MRI)。本领域技术人员应当理解的是可基于多种本领域中已 知的标准选择成像模式。如本文所述，本发明的方法可包括成像数据的一个或更多个片段。 在本文公开的方法中，一个或更多个单个危险因素可选自年龄、种族、谱系史所组成的组。 本领域技术人员应当理解的是可基于多种本领域中已知的标准选择其他单个风险因素。如 本文所述，本发明的方法可包括一个或更多个单个风险因素。因此，参数可包括成像数据， 单个风险因素和CTC数据。如本文所述，参数还可包括但不限于包含核苷酸、核酸、核苷、氨 基酸、糖、脂肪酸、类固醇、代谢物、肽、多肽、蛋白质、碳水化合物、脂质、激素、抗体的生物分 子，用作生物大分子的替代物的目的区域及其组合(例如，糖蛋白、核糖、脂蛋白）以及生物 分子的部分或片段。
[0061] CTC数据可包括形态学特征和免疫荧光谱系二者。如本领域技术人员应当理解的 是，其他参数可以是生物标记物，生物标记物可包括生物分子或生物分子的片段，其变化 和/或检测可以与其他可测量的特征、与前列腺癌和/或mCRPC单独地或结合地相关联。CTC 可存在于单细胞或CTC聚类中，通常是从实体肿瘤脱落的上皮细胞并以非常低的浓度存在 于受试者的循环中。因此，血液样品中的CTC检测可被称为稀有事件检测。血细胞群中CTC的 丰度小于 1:1〇〇〇,例如丰度小于 1:5000、1:10000、1:30000、1:50000、1:100000、1:300000、 1:500000或1: 1000000。在一些实施方式中，所述细胞群中CTC的丰度为1:50000至1: 100000ο
[0062] 本公开内容的样品可以通过任何方法获得，包括例如通过固体组织活检或流体活 检（参见例如Marrinucci D.et al,2012，Phys.Biol.9016003)。简要地说，在具体的实施方 式中，所述方法可包括在7.5mL血液样品中裂解并除去红细胞，将剩余的有核细胞铺在专业 显微镜载玻片上，其中每一个载玻片容纳约〇. 5mL全血的当量。血液样品可以从包括血细胞 或其组分，例如静脉、动脉、外周、组织、脐带等任何已知来源中提取。可以使用用于公知和 常规的临床方法H列如，抽取和处理全血的步骤)处理样品。在一些实施方式中，血液样品被 抽到抗凝血液收集管(BCT)中，BCT可包含EDTA或Streck Cell-Free DNA?。在其他的实施方 式中，血液样品被抽到.CeHSave"管(^1^(^)中。在进一步处理之前血液样品可进一步储 存长达12小时、24小时、36小时、48小时或60小时。
[0063] 在一些实施方式中，本公开内容的方法包括获得血液样品的白细胞(WBC)计数的 初始步骤。在某些实施方式中，WBC计数可通过使用HemoCue fjIBC装置（Hemocue， Angelholm，瑞典）获得。在一些实施方式中，WBC计数被用于测定每一个载玻片上铺恒定载 体积的有核细胞所需的血液量并计算每血液体积的CTC当量。
[0064] 在一些实施方式中，本公开内容的方法包括裂解血液样品中的红细胞的初始步 骤。在一些实施方式中，例如通过向血液样品中加入氯化铵溶液裂解红细胞。在某些实施方 式中，红细胞裂解之后将血液样品进行离心并将有核细胞再次混悬在例如PBS溶液中。
[0065] 在一些实施方式中，将来自样品例如血液样品的有核细胞以单层铺在平面支撑物 上。平面支撑物可以是任何材料的，例如，荧光透明的任何材料、有利于细胞附着的任何材 料、有利于容易去除细胞碎片的任何材料、厚度<1〇〇μπι的任何材料。在一些实施方式中，所 述材料是膜。在一些实施方式中，所述材料是玻璃载玻片。在某些实施方式中，所述方法包 括将来自血液样品的有核细胞作为单层铺在玻璃载玻片上的初始步骤。载玻片可被涂覆以 允许活细胞的最大保留{参见例如Marrinucci D.et al,2012，Phys.Biol.9:016003)。在一 些实施方式中，将约0.5百万、1百万、1.5百万、2百万、2.5百万、3百万、3.5百万、4百万、4.5 百万或5百万个有核细胞铺在玻璃载玻片上。在一些实施方式中，本公开内容的方法包括将 约3百万个细胞铺在载玻片上。在另外的实施方式中，本公开内容的方法包括将约2百万至 约3百万个细胞铺在玻璃载玻片上。在一些实施方式中，在本公开内容的方法已经完成之后 玻璃载玻片和固定化细胞样品可用于进一步处理或实验。
[0066] 在一些实施方式中，本公开内容的方法包括识别所述非富集血液样品中的有核细 胞的初始步骤。在一些实施方式中，通过荧光染色识别有核细胞。在某些实施方式中，荧光 染料包括核酸特异性染料。在某些实施方式中，荧光染料是二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)。在 一些实施方式中，有核细胞的免疫荧光染色包括广谱系细胞角蛋白（CK)、分化聚类(CD)45 和DAPI。在一些实施方式中，有核细胞的免疫荧光染色包括广谱系细胞角蛋白、分化聚类 (⑶)45、二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)和雄激素受体(AR)。在本文进一步描述的一些实施方式 中，CTC包括与周围有核细胞不同的免疫荧光染色。在一些实施方式中，CTC的不同的免疫荧 光染色包括DAPI( + )、CK( + )和⑶45(-)。在一些实施方式中，CTC的识别进一步包括将广谱 系细胞角蛋白荧光染色的强度与周围有核细胞的强度进行对比。在一些实施方式中，通过 荧光扫描显微镜生成CTC数据以检测血液样品中有核细胞的免疫荧光染色(Marrinucci D.et al，2012，Phys.Biol.9 016003)。
[0067] 在具体的实施方式中，所有有核细胞被保留并使用单克隆抗体靶向细胞角蛋白 (CK)、广泛存在于上皮细胞中的中间纤维、靶向共同白细胞抗原CD45的广谱系白细胞特异 性抗体、和核染色、DAPI进行免疫荧光染色。有核血细胞可以在多个荧光通道成像以产生保 留良好的核谱系和细胞质分布的细胞学细节的高质量和高分辨率的数字图像。虽然周围 WBC可使用靶向CD45的广谱系白细胞特异性抗体进行识别，但是CTC可被识别为DAPI( + )、CK (+ )和CD 45(-)。在本文所描述的方法中，CTC包括与周围有核细胞的不同的免疫荧光染色。 [0068] 在进一步的实施方式中，CTC是高清晰度的CTC(HD-CTC) AD-CTC是CK阳性、CD45阴 性的，包含未经识别的凋亡改变或外观破坏的完整的DAPI阳性细胞核，并且与周围白细胞 (WBC)的形态不同。DAP I ( + )、CK ( + )和CD 45 (-)的强度在如前所述（图1)的HD-CTC计数过程 中可被归类为可测量的特征。Nieva et al，Phys Biol 9:016004(2012)。使用本文所公开 的方法进行的无富集直接分析导致高灵敏度和高特异性，同时加入高清晰度的细胞形态 学，使得能进行已知为异源的CTC群体的详细形态学表征。
[0069] 尽管CTC可识别为包括DAP I ( + )、CK ( + )和⑶45 (-)细胞，但是本发明的方法可使用 本领域技术人员所选用于生成CTC数据和/或识别CTC和CTC聚类的任何其他参数来实施。本 领域技术人员知道如何选择其改变和/或检测可与CTC相关联的形态学特征、生物分子或生 物分子片段。分子参数包括但不限于包含核苷酸、核酸、核苷、氨基酸、糖、脂肪酸、类固醇、 代谢物、肽、多肽、蛋白质、碳水化合物、脂质、激素、抗体的生物分子，用作生物大分子的替 代物的目的区域及其组合(例如，糖蛋白、核糖、脂蛋白）。所述术语还包括生物分子的一部 分或片段，例如蛋白质或多肽的肽片段。
[0070] 在一些实施方式中，所公开的用于预测前列腺癌(PCa)患者对激素介导疗法的响 应的方法包括从样品分离CTC的步骤，进一步包括从最初的荧光图像采集再定位，并随后使 CTC再成像，然后物理提取CTC。在所要求保护的方法的一些实施方式中包括用于HD-CTC流 体相捕获的方法，其可分成三个独立的顺序步骤：（I)CTC再定位，（2)细胞提取和（3)单一 CTC的物理分离和操纵用于下游分子分析，如在本文提供的示例中所描述的。
[0071] 本领域技术人员应当理解的是，许多方法可用于生成CTC数据，包括基于显微镜的 方法，包括荧光扫描显微镜（参见例如Marrinucci D.et al，2012，Phys.Biol.9:016003)， 质谱系方法，例如MS/MS、LC-MS/MS、多反应监测(MRM)或SRM和产物离子监测(P頂)并且还包 括基于抗体的方法，例如免疫荧光、免疫组织化学、免疫测定例如Western印迹、酶联免疫吸 附测定(ELISA)、免疫沉淀、放射免疫测定、斑点印迹和FACS。免疫检测技术和方案通常是本 令页域技术人员已知的（Price and Newman ,Principles and Practice of Immunoassay, 2nd Edition,Grove's Dictionaries，1997;和Gosling，Immunoassays :A Practical Approach ,Oxford University Press ,2000.)。多种免疫测定技术包括竞争性和非竞争性 免疫测定均可使用（Self et al，Curr · Opin ·Biotechnol ·，7: 60-65( 1996)，还参见John R.Crowther，The ELISA Guidebook，lst ed.,Humana Press 2000，ISBN 0896037282和An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques , by Chard T,ed., Elsevier Science 1995,ISBN 0444821198)。
[0072] 本领域技术人员将进一步理解的是，可以使用本领域中公知的任何种类的标记特 异性结合试剂检测参数是否存在，标记特异性结合试剂包括例如抗体、适体、融合蛋白例如 包括蛋白受体或蛋白配体组分的融合蛋白或参数特异性小分子粘合剂。在一些实施方式 中，CK或CD45的存在或不存在通过抗体来测定。
[0073] 本公开内容的抗体特异性结合参数。可以使用本领域中已知的任何合适方法制备 抗体。参见例如Coligan ,Current Protocols in Immunology (1991) ；Harlow&Lane , Antibodies:A Laboratory Manual(1988)；Coding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice(2d ed.1986)。所述抗体可以是任何免疫球蛋白或其衍生物，天然的或全部 或部分合成产生的。保留特异性结合能力的其所有衍生物也包括在术语内。所述抗体具有 与免疫球蛋白结合结构域同源或很大程度上同源的结构域，并且可以来源于天然来源，或 部分或全部合成产生。所述抗体可以是单克隆或多克隆抗体。在一些实施方式中，抗体是单 链抗体。本领域普通技术人员应当理解的是，抗体可以以任何各种形式提供，包括例如人源 化的、部分人源化的、嵌合的、嵌合人源化的等。抗体可以是抗体片段，包括但不限于Fab、 Fab'、F(ab'）2、scFv、Fv、dsFv双抗体和Fd片段。所述抗体可通过任何手段产生。例如，所述 抗体可通过完整的抗体片段酶促或化学产生和/或可从编码部分抗体序列的基因重组产 生。所述抗体可包括含单链抗体片段。替代地或额外地，所述抗体可包括例如通过二硫键链 接连接在一起的多个链，以及由这样的分子获得的任何功能片段，其中这样的片段保留母 体抗体分子的特异性结合性质。因为其作为整个分子的功能组分而言尺寸较小，所以抗体 片段用在某些免疫化学技术和实验应用中可提供优于完整抗体的优点。
[0074] 可检测的标签可用在本文所述的方法中用于当生成本发明方法中的CTC数据时直 接或间接检测参数。可使用多个可检测标签，标签的选择取决于所需的灵敏度，与抗体缀合 的容易程度，稳定性要求和可得到的仪器和处理规定。本领域技术人员熟悉基于本发明方 法中的参数分析检测选择合适的可检测标签。合适的可检测标签包括但不限于荧光染料 {例如，荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、0reg 〇n Green?、若丹明、德克萨斯红、四甲基异硫 氰酸罗丹明（TRITC)'CyS'CyS'AlexaFluor'^y^jlexaFluor^M WexaF丨UOlji488 )、荧 光标记物H列如，绿色荧光蛋白（GFP)、藻红蛋白等）、酶{例如，萤光素酶、辣根过氧化物酶、 碱性磷酸酶等）、纳米颗粒、生物素、洋地黄毒苷、金属等。
[0075] 对于基于质谱系的分析，利用同位素试剂例如同位素编码的亲和标签(ICAT)或使 用同量异序标记试剂iTRAQ(Applied Biosystems，加州福斯特城）的更近变化进行差分标 记，随后进行多维液相色谱系(LC)和串联质谱系(MS/MS)分析，其可在实施本公开内容的方 法中提供进一步的方法学。
[0076]使用化学发光抗体的化学发光检测可用于蛋白质的敏感的、非放射性检测。标记 有荧光染料的抗体也可以是合适的。荧光染料的示例包括但不限于DAPI、荧光素、Hoechst 33258、R-藻蓝蛋白、B-藻红蛋白、R-藻红蛋白、若丹明、德克萨斯红和丽丝胺。间接标签包括 本领域中公知的多种酶，例如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶、脲酶 等。使用适合的辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、内半乳糖苷酶底物的检测系统是本领域中 公知的。
[0077]直接或间接标签的信号可例如使用显微镜比如荧光显微镜或荧光扫描显微镜进 行分析。可替代地，分光光度计可用于检测显色底物的颜色;检测辐射的辐射计数器，例如 用于检测125I的γ计数器;或在某些波长的光的存在下检测荧光的荧光计。如果需要的话， 用于实施本公开内容的方法的测定可以自动化或通过机器人进行，并且可同时检测来自多 个样品的信号。
[0078]在一些实施方式中，参数是免疫荧光标记物。在一些实施方式中，所述免疫荧光标 记物包括对上皮细胞具有特异性的标记物。在一些实施方式中，免疫荧光标记物包括对白 细胞(WBC)具有特异性的标记物。在一些实施方式中，一种或更多种免疫荧光标记物包括 CD45和CK。
[0079]在一些实施方式中，有核细胞例如CTC或WBC中免疫荧光标记物的存在与否导致不 同的免疫荧光染色模式。基于在各自细胞中检测上皮或WBC标记物，CTC和WBC的免疫荧光染 色模式可有所不同。在一些实施方式中，测定一种或更多种免疫荧光标记物是否存在包括 使用例如明显识别WBC的CD45免疫荧光染色将不同的CTC免疫荧光染色与不同的WBC免疫荧 光染色进行对比。还有其他可检测的标记物或结合WBC的各个亚群的可检测标记物的组合。 这些可以以各种组合使用，包括组合⑶45免疫荧光染色或作为其替代。
[0080] 在一些实施方式中，CTC包括与周围有核细胞相比较而言不同的形态学特征。在一 些实施方式中，形态学特征包括细胞核大小、细胞核形状、细胞大小、细胞形状和/或细胞核 与细胞质的比例。在一些实施方式中，所述方法进一步包括通过细胞核细节、细胞核谱系、 核仁的存在与否、细胞质的质量、细胞质的量、免疫荧光染色模式的强度分析有核细胞。本 领域普通技术人员应当理解的是，本公开内容的形态学特征可包括可被CTC检测识别并与 其相关联的细胞的任何特征、谱系、特征或方面。
[0081] CTC数据可以利用本领域中已知的任何显微镜法生成。在一些实施方式中，所述方 法是通过荧光扫描显微镜进行的。在某些实施方式中，显微镜方法提供CTC和其周围WBC的 高分辨率图像(参见例如Marrinucci D.et al，2012,Phys.Biol .9:016003)。在一些实施方 式中，利用来自样品例如非富集血液样品的单层有核细胞涂覆载玻片，通过荧光扫描显微 镜扫描并记录免疫荧光标记物和细胞核染色的荧光强度，以允许测定每种免疫荧光标记物 存在与否并评估有核细胞的形态。在一些实施方式中，以自动方式进行显微镜数据收集和 分析。
[0082] 在一些实施方式中，CTC数据包括检测一个或更多个参数，例如CK和⑶45。如果可 检测到高于所用的各检测方法的背景噪音(例如，高于背景2倍、3倍、5倍或10倍;例如，高于 背景2〇或3 〇)，那么参数被认为在细胞中"存在"。在一些实施方式中，如果不可检测到高于 所用的各检测方法的背景噪音(例如，比背景信号高〈1.5倍或〈2.0倍;例如，高于背景<1.5σ 或〈2.Οσ)，那么参数被认为细胞中"不存在"。
[0083]在一些实施方式中，通过选择焚光扫描过程中的曝光时间使所有免疫焚光标记物 实现视野中WBC上的预先设定水平的荧光测定有核细胞中免疫荧光标记物的存在与否。在 这些条件下，CTC特异性免疫荧光标记物，即使WBC上不存在却随固定高度的背景信号在WBC 中可见。此外，CTC上不存在的WBC特异性免疫荧光标记物随固定高度的背景信号在CTC中可 见。如果相应的标记物的其荧光信号比固定的背景信号显著更高的话(例如高于背景2倍、3 倍、5倍或10倍;例如高于背景2 〇或3〇)，则细胞被认为对于免疫荧光标记物是阳性的（即标 记物被认为存在）。例如，如果CD 45的荧光信号比背景信号显著更高的话，有核细胞被认为 是CD 45阳性的（CD 45+)。如果相应的标记物的细胞荧光信号不显著高于背景信号（例如， 比背景信号高〈1.5倍或〈2.0倍;例如，比背景高〈1.5 〇或〈2.0〇)的话，则细胞被认为是对于 免疫荧光标记物而言是阴性的（即标记物被认为不存在）。
[0084] 通常，每个显微镜视野包括CTC和WBC二者。在某些实施方式中，显微镜视野显示至 少1、5、10、20、50或100个CTC。在某些实施方式中，显微镜视野显示WBC比CTC多至少10、25、 50、100、250、500或1000倍。在某些实施方式中，显微镜视野包括一个或更多个CTC或CTC聚 类，围绕有至少1 〇、50、100、150、200、250、500、1000个或更多白细胞。
[0085]在本文所述的方法的一些实施方式中，生成CTC数据包括对存在于血液样品中的 CTC计数。在一些实施方式中，本文所述的方法包括检测至少1.0 CTC/mL血液、1.5CTC/mL血 液、2 · OCTC/mL血液、2 · 5CTC/mL血液，3 · OCTC/mL血液、3 · 5CTC/mL血液、4 · OCTC/mL血液、 4 · 5CTC/mL 血液、5 · OCTC/mL 血液、5 · 5CTC/mL 血液、6 · OCTC/mL 血液、6 · 5CTC/mL 血液、7 · OCTC/ mL 血液、7 · 5CTC/mL 血液、8 · OCTC/mL 血液、8 · 5CTC/mL 血液、9 · OCTC/mL 血液、9 · 5CTC/mL 血液、 10CTC/mL血液或更多。
[0086]在本文所述的方法的一些实施方式中，生成CTC数据包括检测不同亚型的CTC，包 括非传统的CTC。在一些实施方式中，本文所述的方法包括检测至少0.1 CTC聚类/mL血液、 0.2CTC聚类/mL血液、0.3CTC聚类/mL血液、0.4CTC聚类/mL血液、0.5CTC聚类的检测/mL血 液、0.6CTC聚类/mL血液、0.7CTC聚类/mL血液、0.8CTC聚类/mL血液、0.9CTC聚类/mL血液、 ICTC聚类/mL血液、2CTC聚类/mL血液、3CTC聚类/mL血液、4CTC聚类/mL血液、5CTC聚类/mL血 液、6CTC聚类/mL血液、7CTC聚类/mL血液、8CTC聚类/mL血液、9CTC聚类/mL血液、IOCTC聚类/ mL血液或更多。在具体的实施方式中，本文所述的方法包括检测至少ICTC聚类/mL血液。
[0087] 在一些实施方式中，预测前列腺癌(PCa)患者对激素介导疗法或化疗的响应的方 法可进一步包括使用预测模型。在进一步的实施方式中，预测前列腺癌(PCa)患者对激素介 导疗法的响应的方法可进一步包括对比可测量的特征与参考特征。本领域技术人员可以理 解的是，这样的对比可以是与参考特征的直接对比或者是其中参考特征已被引入到预测模 型中的间接对比。在进一步的实施方式中，分析可测量的特征以前瞻性识别前列腺癌患者 对激素介导疗法的抵抗性包括一种或更多种线性判别分析模型、支持向量机分类算法、递 归特征消除模型、微阵列模型的预测分析、逻辑回归模型、CART算法、柔性树算法、LART算 法、随机森林算法、MART算法、机器学习算法、惩罚回归法或其组合。在具体的实施方式中， 分析包括逻辑回归。在另外的实施方式中，PCa患者对激素介导疗法的抵抗性的预测被表达 为风险评分。
[0088] 分析分类过程可使用多种统计分析方法中任何一种来操作量化数据并提供对样 品的分类。有用的方法的示例包括线性判别分析、递归特征消除、微阵列的预测分析、逻辑 回归、CART算法、FlexTree算法、LART算法、随机森林算法、MART算法、机器学习算法和本领 域技术人员已知的其他方法。
[0089] 可根据设定用于测定样品所属给定分类的概率的阈值的预测建模方法进行分类。 概率优选为至少50 %，或至少60%，或至少70%，或至少80%，或至少90 %或更高。还可以通 过测定所获得的数据集和参考数据集之间的对比是否产生了统计学显著差异进行分类。如 果是，那么将从中获得数据集的样品分类为不属于参考数据集。相反，如果这样的对比与参 考数据集无统计学显著性差异，那么将从中获得数据集的样品分类为属于参考数据集。
[0090] 模型的预测能力可根据其提供质量度量的能力例如AUR0C(R0C曲线下面积)或特 定值或值范围的准确性进行评估。曲线下面积测量用于对比整个完整数据范围的分类器的 精确度。AUC越大的分类器具有进行两个目的组之间未知正确分类的能力越强。ROC分析可 用于在各种临床情况下选择最佳阈值，平衡了特异性和敏感性之间存在的固有折衷。在一 些实施方式中，所期望的质量阈值是样品分类准确度为至少约0.7,至少约0.75,至少约 0.8,至少约0.85,至少约0.9,至少约0.95或更高的预测模型。作为替代的测量，所期望的质 量阈值可以是指具有AUC的样本分类准确度为至少约0.7，至少约0.75，至少约0.8，至少约 0.85，至少约0.9或更高的预测模型。
[0091] 如本领域中已知的，可调整预测模型的相对灵敏度和特异性以有利于特异性度量 或灵敏度度量，其中这两个度量具有反比关系。可根据进行的测试的具体要求调节如上所 述的模型中的限度以提供所选的灵敏度或特异性水平。敏感性和特异性之一或两者可以为 至少约0.7,至少约0.75,至少约0.8,至少约0.85,至少约0.9或更高。
[0092] 可通过测量每个可测量特征或参数的值开始分析原始数据，通常为一式三份或多 个一式三份。数据可被操作纵，例如，可使用标准曲线转换原始数据，并且一式三份测量的 平均值用于计算每名患者的平均和标准偏差。这些值可以在用在模型中之前变换，例如对 数变换，Box-Cox变换（Box and Cox，Royal Stat.Soc,Series B,26:211-246(1964))。然后 将数据输入到预测模型中，根据状态将样品进行分类。所得信息可被传递给患者或医疗保 健提供者。
[0093] 在一些实施方式中，预测前列腺癌(PCa)患者对激素介导疗法的响应的方法的特 异性可以为>60%、>70%、>80%、>90%或更高。在另外的实施方式中，预测前列腺癌(PCa) 患者对激素介导疗法的响应的方法的特异性为>90%，分类阈值为7.5CTC/mL血液。
[0094] 本领域技术人员应当理解的是，分析分类过程可使用多种统计分析方法中的任何 一种以操作量化数据并提供对样品的分类。有用的方法的示例包括但不限于线性判别分 析、递归特征消除、微阵列的预测分析、逻辑回归、CART算法、FlexTree算法、LART算法、随机 森林算法、MART算法和机器学习算法。
[0095] 通过举例说明而不是限制的方式提供下列示例。 示例 示例1.响应于通过单一 CTC的高含量分析检测的前列腺癌中治疗压力的快速表型和基 因组变化
[0096] 本示例示出了通过纵向CTC分子分析监测治疗响应并且证明了循环细胞群的表型 和基因型变化代表响应于利用醋酸阿比特龙治疗达到高峰的多步骤治疗方案的遗传进化 的顺序步骤。
[0097]在治疗过程中收集患者临床病史并抽血。该研究通过南加州大学综合癌症中心的 机构审查委员会（IRB)批准。患者提供书面知情同意书。在诊断原发性活检时表现出PCa转 移至腰椎的患者在该研究中代表第一样本。初始治疗包括雄激素剥夺治疗（醋酸亮丙瑞 林）。5个月后，临床进展至CRPC并且在多西他赛联合贝伐单抗和依维莫司（临床试验gov标 识符:NCT00574769)的临床试验中招募患者。启动化疗之前，根据样品采集方案抽取基线血 液(抽血1)。方案特异性化疗4个月后观察临床进展。在接下来的3个月，采用另外剂量的多 西他赛以及外照射放疗和来昔屈南钐（153Sm)(骨靶向放射药物），具有有限的治标不治本 的益处。在诊断后12个月，利用醋酸阿比特龙治疗，启动高选择性雄激素合成抑制剂。在开 始阿比特龙之前抽血(抽血2)，连续治疗3周与表现出疼痛和PSA水平降低的临床响应一致 (抽血3)，并且9周与表现出疼痛和PSA水平升高的临床进展一致(抽血4)。阿比特龙之后，治 疗改为卡巴他赛，无临床响应，随后迅速临床恶化。抽血4(确诊后17个月）之后4个月患者死 于广泛的转移性前列腺癌。
[0098]血液样品采集与CTC检测处理。根据IRB批准的方案采集患者的外周血液样品。将 样品运到我们的实验室并在抽血时间之后24小时内处理。在Marrinucci et al,Phys Biol 9:016003(2012)中先前描述了样品制备。简言之，它包括裂解红血细胞，随后将有核细胞以 单层铺在定制的细胞粘附载玻片上，随后储存在生物知识库中。每个样品制作至少14个单 独的载玻片，用于CTC识别和表征。
[0099] 免疫荧光染色和CTC计数。在这项研究中，我们采用基于公开的HD-CTC测定和细胞 角蛋白（CK)阳性的CTC群内雄激素受体(AR)评估状态的方案。Lazar et al，Phys Biol 9: 016002(2012)。简言之，将细胞用小鼠单克隆细胞角蛋白19(1:100;Dako)和panCK(l :100; Sigma)初级抗体标记以识别细胞角蛋白（CK)阳性细胞。使用兔抗AR单克隆抗体（I :250， Cell Signaling Technology)识别AR阳性HD-CTC。使用AlexaFluor二级抗体使CK和AR抗原 两者可见;使用Alexa Fluor 555 IgGl二级抗体（l:500，Invitrogen)识别CK初级抗体并使 用Alexa Fluor 488 IgG(H+L)二级抗体（1:1000, Invitrogen)识别兔AR抗体。缀合抗⑶45 的Alexa Fluor 647(1:125;AbD Serotec)初级抗体用于识别白细胞为排除标记物。为了确 认细胞是有核的并且能分析核形态，使用4'，6_二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)对所有细胞染 色。
[0100]将载玻片成像并使用?ο X放大的计算机化高通量荧光显微镜记录假定的CTC。使 用具有DAPI+细胞核加细胞角蛋白阳性和CD45阴性的先前公开的标准通过血液学技术人员 识别CTCt3Marrinucci et al,Phys Biol 9:016003(2012)。使用两个标准（I)AR染色的存在 (AR+)或不存在(AR-)和(2)AR亚细胞定位(细胞核AR对比细胞质染色或两者)评估雄激素受 体蛋白表达和定位。对于AR阳性的阈值定义为信号大于6个标准差在周围白细胞(背景）中 观察到的平均信号强度(SDOM)。使用细胞核和细胞质上AR染色的相对像素密度测定亚细胞 定位。
[0101] HD-CTC测定的重复性。利用细胞系激活试验在技术上验证HD-CTC测定以在之前报 道的线性测试达到R2 = O.9997。使用SK-BR-3细胞系和0至3X IO2个细胞/mL正常供体对照血 液进行这些试验。变异系数为16%，处理间的相关性为R2 = O.979。通过用于所有耗材和仪 器的条形码系统使样品制备过程符合患者样品的标准操作步骤。在委托过程中根据所建立 的技术验证方案校准所有现成的仪器。Nair et al，PLoS One 8:e67733(2013)。
[0102] 单细胞提取。作为标准步骤，旨在最大限度地减少DNA裂解细胞在初始染色步骤的 5天内选择。用于HD-CTC流体相捕获的试验方案被分为3个独立的连续步骤：（I) CTC再定位， (2)细胞提取和(3)分离和操纵单一 CTC用于下游分子分析。
[0103] 使用来自用于HD-CTC识别的初始数据采集的变换矩阵再定位HD-CTC(步骤1)。校 准和再定位后，以40 X分辨率对每种候选细胞重新成像用于详细的形态学分析。对于细胞 提取(步骤2)而言，通过施加流体抽吸将Eppendorf Transfer Man NK2微操纵仪用于捕获 25°锯齿状微量吸管内的目的细胞(Piezo Drill Tip ES，Eppend〇rf)。一旦目的细胞被捕 获在微量吸管内（步骤3)，就用PBS冲洗细胞并沉积在含有2μ1裂解缓冲液(200mM KOH; 50mM DTT)的0.2mL PCR管内。然后并立即将所述样品冷冻并储存在-80°C直至进一步处理。使用 DNA酶溶液对所有仪器和耗材进行消毒并在实验前30分钟暴露于UV光。
[0104] 单细胞下一代测序和生物信息学分析。在干冰中将含细胞的小瓶转移到测序实验 室中。简言之，将裂解细胞混合物解冻并如Baslan et al，Nat Protoc 7:1024-1041(2012) 之前所报道的那样进行WGA和测序文库构建。
[0105] 使用WGA4 Genomeplex单细胞全基因组扩增试剂盒（Sigma-Aldrich)以96孔板形 式手动进行WGA，然后使用QIAquick 96 PCR纯化试剂盒(Qiagen)进行纯化。使用Nanodrop 8000(Thermo Scientific)测量洗脱的DNA的浓度。对于每个孔，如果所得DNA的浓度为〉 70ngAU(50yl的洗脱体积），则扩增被认为是成功的，然后使用Agilent 2100生物分析仪 (高灵敏度DNA分析和试剂盒，安捷伦科技)进行进一步质量控制(QC)以确认适当的样本大 小分布。
[0106]此外，我们组最近在Baslan et al,Nat Protoc 7:1024-1041 (2012)中公布了用 于分析测序数据的详细方法。简言之，信息学方法包括三个步骤:首先，基于条形码使序列 读数去卷积;第二，映射读数至人基因组(hgl 9，基因组参考联盟GRCh37，UCSC基因组浏览器 数据库）（Meyer et al, Nucleic Acids Res 41:D64-69(2013))，并除去 PCR 重复；以及第 三，规范鸟嘌呤-胞嘧啶(GC)含量和使用CBS分割算法评估拷贝数。本报告中的拷贝数谱系 基于20000个可变长度的基因组箱，每个平均长度为约150千碱基对，并计算为与正常(hg 19)的比值。这里报告的数据的中位计数为178万唯一映射读数，范围为244190(最小切断 200000)至 533 万。
[0107] 聚类分析，使用gplots包中的heatmap.2功能在R中进行层次聚类(Team RC(2012) R: A Language and Environment for Statistical Computing) 〇具有欧氏距离度量的 Ward法用于聚类。根据上面描述的临界值(cutoff)使热图着色并且使用中位数中心数据进 行聚类。
[0108] 频率分析以限定基因组变异。使用中位数中心CNV谱系，0.8至1.25的与中位数的 临界值比值被用于分别限定缺失和扩增。这些临界值均被用于使热图着色，并做了频率分 析。
[0109] 统计学和细胞形态学分析。通过跟踪每个CTC合成图像中的细胞质谱系分析细胞 形状(细胞圆度）。所跟踪的细胞图像被导入到R中，并且使用Halir和Flusser ,Proceeding of International Conference in Central Europe on Computer Graphics, Visualization and Interactive Digital Media: 125-132(1998)所述的最小二乘法将椭 圆形拟合成形状。该算法输出细胞的长轴，这是所拟合的椭圆形的最大半径（参考支持信 息）。评估细胞圆度(C)为实际细胞面积(A)和具有设置为细胞长轴的半径(r)的圆面积的分 数。 C=AAr2
[0110] 使用Wi Icoxon总和秩检验计算抽血3和4中CTC之间的圆度对比中所用的P值。 为了评估患者对治疗的响应，高含量单细胞分析包括：（I)AR蛋白表达表型，（2)AR 亚细胞定位和(3)在CRPC标准护理中代表决策点的四个不同的时间间隔采集的血液样品中 识别的CTC中进行CNV基因组分析，包括：在基于多西他赛的化疗开始之前立即进行（抽血 1)，在醋酸阿比特龙(高选择性雄激素合成抑制剂)之前立即进行(抽血2)，在连续阿比特龙 治疗之后3周(抽血3)和9周(抽血4)。对于所有谱系细胞的具体数据示于支持信息中。此外， 在接受任何癌症特异性治疗之前，使用在诊断时抽取的骨活检使用基于类似的测序的方法 获得患者的一个转移部位的CNV谱系（抽血1之前5个月）。如图IA中所示，并且在抽血1和2之 间7个月期间，患者表现出基于多西他赛的化疗的初始响应，然后出现抵抗性。同时，患者的 流体活检显示出AR+和AR-亚群的恒定比例，同时CTC的总数量减少（图1A、1D、图5和图8)。
[0112] 抽血1和2的CK+细胞的基因组CNV谱系为两种类型（图2和6)。这些细胞中三种的AR 表达为阴性(CK+AR-)，而大多数（16/19)表现出高水平的AR蛋白（CK+AR+)。一种AR-和一种 AR+细胞具有接近正常的CNV谱系，与从单一 CK-CD45+白细胞获得的那些相当（图2)。所有其 他CK+AR+细胞表现出与在诊断时获得的从患者的骨转移(激素依赖性组织样品）追溯得到 的基因组谱系相似的基因组重排的复杂模式（图2和图3A)<XK+AR+细胞和骨转移样品共享 染色体臂的多个增加和丢失以及在磷酸酶调节亚基PPP4R2上中心的并含有癌症中涉及的 至少两个基因的3pl3上的特性焦点扩增，FoxPl(Taylor et al,Cancer Cell 18:11-22 (2010);Goatly et al，Mod Pathol 21:902-911(2008))和MITF(Garraway et al，Nature 436:117-122(2005))(图2)。为了达到分辨率水平，每个共享的事件显示出相同的基因组断 点，并且在层次聚类分析中来自抽血1和2的AR+细胞与骨转移聚集在一起（图3A中的聚类 A)。根据这一证据，我们推断这些细胞是来源于患者转移性谱系的真实的CTC。尽管明确的 血统关系，但是与AR基因座中转移不同的AR+循环细胞表现出在含有AR基因本身的Xql 2上 多个节段的多拷贝扩增。在CRPC中AR扩增是频繁的，并已被连接以从去势敏感的前列腺癌 进展至CRPCJoivisto et al,Cancer Res 57:314-319(1997)。值得注意的是，每种AR扩增 (图3C)是唯一的，来自AR基因的任一侧上多个不同的断点，这表明AR扩增产生多个独立的 时间(趋同进化），可能是雄激素剥夺治疗施加的选择压力的结果。
[0113] 在抽血3,醋酸阿比特龙治疗3周后，患者显示出PSA和疼痛减少所限定的明显的临 床响应(图1B)。这种响应与CTC表型和基因型中的突然变化一致。虽然抽血3中的CTC的绝对 数量与抽血2相当，但是AR +CTC群体几乎完全耗竭（图1A)。抽血3中识别的CK+细胞表达很少 或不表达AR蛋白并且形态也不同，看上去比来自抽血1和2的AR +细胞显著更细长（图5和图 8)。这种形态学变化反映了中位数细胞圆度（图7)从抽血1和2的0.87(sd = 0.14)降到抽血3 的0.62(8(1 = 0.15)4〈10-11町1(3(?〇11秩总和测试（图1〇〇
[0114] 在抽血3的基因组分析中治疗的表观效果也很明显，其中变异的表型状态与不同 的基因组谱系相关。抽血3的大部分（10/12)表型AIT细胞未扩增并表现出明显正常或接近 正常(假二倍体)谱系（图6)，将它们至于图3A中的聚类B中。这个时间点的两种AIT细胞之一 具有聚类A的典型CNV标志，包括AR扩增，而AR-细胞中的与第三聚类（图3A中的聚类C)相关 的其他一个，由随后的时间点的细胞主导（抽血4)。影响AR基因中AR蛋白稳定性和/或无义 突变的错义突变可说明最后两种细胞中AR表型-基因型差异。我们解释，对醋酸阿比特龙的 初始响应明显耗竭雄激素依赖性AR +群体，而由假二倍体细胞为主的另一种AIT群体存在于 循环中。基于总细胞计数，在抽血2和3之间保持恒定，我们推断抽血3的群体是癌症的结果， 但是来源于主肿瘤谱系外的来源（图3A)。
[0115] 当在阿比特龙9周后PSA水平升高时，在临床进展的时间点采集抽血4(图1B)。在此 时间点，CTC计数已经减少至之前时间点的47%，但是再一次发生显著的表型转变，因为大 多数CTC再次是AR+，具有来自开始两次抽血的细胞典型为0.81的细胞圆度值（图IC和图5)。 这一发现表明治疗响应和CTC表型而不是与总CTC计数之间相关联，与最近发表的研究一 致，其中监测到CTC上AR信号传导途径的两个标记物的表达响应于雄激素介导疗法。 Miyamoto et al,Cancer Discov 2:995-1003(2012)〇
[0116] 响应于治疗的变异再次表观在基因组水平，因为(6/10)细胞形成大多数新的、显 然克隆的亚群（图3A和S2中的聚类C)。聚类C中的CNV标记明显在原始谱系中，追溯到任何全 身治疗之前采集的骨转移样品，但现在其特征在于功能相关的事件，例如含MYC的窄谱系扩 增子，并且FQXP1/MITF扩增子的消失伴随图2、3A和3B中标注的其他差异。MYC扩增是在转移 性肿瘤中观察到的最常见的变异之一，并且已被建议是AR非依赖性抵抗性的旁路机制。Koh et al. ,Genes Cancer 1:617-628(2010)。有趣的是，基因组AR扩增（图3C中所列举的）的更 仔细得检查表明，与早期细胞(聚类A)中观察到的异源扩增界限对比，聚类C中的细胞表现 出具有几乎均匀的断点和显著更高水平的AR扩增的单一的谱系形状。基因组元件一起表明 聚类C细胞代表了新的谱系，明显抵抗醋酸阿比特龙，并且可能从单个抵抗性细胞产生。
[0117] 此外，AR亚细胞定位的形态学分析表明，AR通常定位在抽血图1和2的细胞的细胞 核中，但是被认定为显著更少定位于在进展中采集的抽血4中分离的CTC中的细胞核中（P = 0.00017 Wilcoxon秩和检验）（图4)。这一发现在最近的研究中特别有趣，研究表明配体非 依赖性AR剪接变体可在人CRPC异种移植模型中介导阿比特龙抵抗性(Mostaghel et al.， Clin Cancer Res 17:5913-5925(2011))，并且这些截短和组成型活性形式的AR被发现局 限在前列腺癌细胞系的细胞核以及细胞质中。Chan et al，J Biol Chem 287:19736-19749 (2012)。
[0118] 虽然我们的研究基于单个患者的纵向研究，但是我们的研究结果与涉及从转移性 前列腺癌患者中分离的CTC或循环无细胞DNA的基因组分析的以前的研究相一致。Magbanua et al,BMC Cancer 12:78(2012)，Heitzer et al,Genome Med 5:30(2013)。然而，这些现 有研究通常限于单一时间点的合并样品的表征，并且因此，在治疗选择压力下不落入癌症 的临时和动态演化。无论如何，与这些现有的报道一致，我们观察到8号染色体中拷贝数变 化(特别是8q获得和8p损失），这是在前列腺癌中描述的最频繁的体细胞突变之一Jaylor et al，Cancer Cell 18:11-22(2010)。此外，我们发现，AR扩增不存在于在初始雄激素剥夺 治疗之前获得的样品中，但以高频率存在于代表CRPC的后期样品中，该发现与连接AR扩增 与雄激素非依赖性前列腺癌生长的多个先前的研究一致。
[0119] 癌症的克隆演变是已经在多个发表的研究中证实的公认的原理(Navin et al， Genome Res 20:68-80(2010),Gerlinger et al,N Engl J Med 366:883-892(2012), Almendro et al,Cancer Res 74:1338-1348(2014))，并且，肿瘤中体细胞突变的外观响应 于治疗选择压力，Sequist et al，Sci Transl Med 3(201 I)，Shi et al .Cancer Discov 4:80-93(2014)。我们解释本文呈现的循环细胞群中表型和基因型变化为代表响应于在醋 酸阿比特龙治疗中最终发展为多步治疗方案的基因进化的顺序步骤。
[0120] 治疗开始之前所取的主体转移性活检提供了根源CNV谱系，从其随后的时间过程 CTC谱系已经进化。它显示出基于CNV断点定义谱系的CNV元件的骨架，在后期治疗过程中采 集的血液的循环细胞中向前进行。在雄激素剥夺治疗(ADT)(醋酸亮丙瑞林）的初始过程之 后采集这些抽血的前两次。抽血1和2(克隆A)中一个群体明显是表现出满足除了高拷贝AR 扩增和强大的AR蛋白表达的所有细胞之外的活检谱系的直系后裔。我们解释这些细胞是作 为初始轮ADT抵抗性的基因选择结果已经发展至扩增AR基因位点并过表达雄激素受体蛋白 质的转移性沉积物的产物。值得注意的是，除了 AR扩增的细胞，两个抽血均含有显著分数的 细胞角蛋白阳性、具有形成分离的CNV聚类的接近正常(假二倍体)基因组的AR阴性细胞（图 3)。还有趣的是，抽血1和2之间AR+细胞的克隆结构改变非常小，尽管化疗和放射治疗的干 扰周期历时7个月。
[0121] 与抽血1和2中的细胞表型和基因型的相似性相对比，抽血3和4中醋酸阿比特龙的 选择性作用非常明显。雄激素依赖性治疗三周后，抽血1和2中AR阳性细胞几乎不存在，并且 CK+群体几乎全部由AR阴性假二倍体细胞组成。在9周的时间点（抽血4)将成为主导的克隆 (克隆C)首次被视为抽血3中的单一事件。通过抽血4，AR+细胞已再次成为所述群体中的很 大一部分，尽管具有显著改变的CNV谱系（图3)。由此，我们推断克隆C被选择作为来自最初 耗竭的转移部位之一的抗药性亚克隆。从图3B中的频率曲线显而易见，该早期和晚期克隆 有明显的关联并且来源于同一谱系，这表明大多数事件被保持并具有相同的边界。然而，几 个其他的事件，或者是新的，在lq、8q和15q上的缺失以及3p、15p上的增加，并且8q的复杂重 组涉及到包含MYC的狭窄区域的单独扩增，或者在晚期细胞中更频繁。MYC扩增与AR蛋白表 达和AR扩增的重新出现一起共同出现可能具有重要的治疗意义，因为c-Myc表达赋予雄激 素非依赖性生长。Koh et al,Genes Cancer 1:617-628(2010)。虽然c-Myc已被证明是困难 的治疗靶标，但是靶向c-Myc活化下游的关键的代谢和其他变化的策略在许多临床试验中 进行了研究。Li和Simon,Clin Cancer Res · (2013)。我们的数据表明，共同革巴向c-Myc和AR 可提供延迟或防止对醋酸阿比特龙和其他雄激素靶向试剂的抵抗性的出现。
[0122] 通过这种选择性处理，AR阴性、假二倍体细胞群保持显著的细胞角蛋白阳性细胞 的分数。这些表型（图1A)和基因型（图3A)不同的角蛋白阳性细胞的存在提出了它们的起源 问题。以前的研究已一致确定了具有相似的未改变的或假二倍体CNV谱系的原发肿瘤组织 细胞。Navin et al，Nature 472:90-94(2011)。我们也不能排除它们代表通过抽血3中的癌 症细胞的耗竭暴露的正常上皮细胞的现有次要群体，然而，与抽血2和4中的数量相当的抽 血3中的这些细胞的数量将使得这可能性较小。可替代地，它们可代表肿瘤相关巨噬细胞谱 系细胞，具有从肿瘤部位脱落的吞噬胞浆细胞角蛋白，因为它们耗竭敏感性细胞或最近在 植入前列腺肿瘤中所述的并表型表征为CK +AIT细胞的去势抵抗性干细胞样肿瘤细胞群。 Toivanen et al,Sci Transl Med 5:187(2013)。然而，与蛋白表达分析相结合的单点突变 的进一步询问将需要深入了解这些细胞的性质及其在肿瘤进展中的作用，如果有的话。
[0123] 在逐渐朝向靶向癌症治疗发展的临床肿瘤学时代，允许非侵入式监控在表型和遗 传水平二者的治疗响应的方法是必不可少的。我们已选择通过非白细胞循环有核细胞的合 并的表型和基因分析实现该目标，没有可能偏向CTC群体的预选步骤。我们的方法使我们能 够将基因组事件与基于蛋白表达和细胞形态的复杂表型相关联。替代的方法，例如对来自 血浆(CtDNA)的游离DNA测序也是有力的工具并且可得到突变和拷贝数的信息，但是只适用 于各种细胞组分的混合物。IVIurtaza et al,Nature 497:108-112(2013)。在该案例研究中， 我们显示了基因组重构的显著程度和速度，因为推测性抵抗性克隆在治疗失败的时间出 现。虽然，我们不能基于单个患者建立CNV大变化和醋酸阿比特龙的最终抵抗性之间的机械 关系，但是靶向治疗9周后，原始CTC群体没有完全消除并且存在明显的耐药性克隆。最后， 跨多学科的数据整合将打开更深入了解抵抗性的机制和时机的大门，并允许基于治疗药物 的连续、组合或间歇性应用的合理设计、个性化治疗。
[0124] 在本文变量的任何定义中的元素列表的陈述包括该变量作为任何单一元素或所 列元素的组合(或子组合)的定义。本文的实施方式的陈述包括该实施方式作为任何单一实 施方式或与任何其他实施方式或其部分相组合。
[0125] 如果每个独立的专利和出版物被具体和单独地表明通过引用并入本文，那么本说 明书中提到的所有专利和出版物在此通过引用以相同程度并入本文。
[0126] 从前面的描述中，将显而易见的是可对本文所述的本发明进行变化和修改以将其 用在各种用途和条件下。这样的实施方式也在以下权利要求的范围之内。
【主权项】
1. 用于预测前列腺癌(PCa)患者对激素介导疗法的响应的方法，包括 (a) 进行直接分析，包括在从所述患者获得的血液样品中进行有核细胞的免疫荧光染 色和形态表征以识别并计数循环肿瘤细胞(CTC); (b) 分别表征基因型、形态学和蛋白表达参数以生成每种CTC的谱系，和 (c) 基于所述谱系预测前列腺癌PCa患者对激素介导疗法的响应。2. 根据权利要求1所述的方法，其进一步包括在所述基因型参数的所述表征之前分离 所述CTC。3. 根据权利要求2所述的方法，其中所述形态学和蛋白表达参数的表征先于所述CTC的 所述分呙。4. 根据权利要求1所述的方法，其进一步包括通过基因组分析识别每个CTC的克隆谱 系。5. 根据权利要求1所述的方法，其中所述癌症是转移性去势抵抗性前列腺癌(mCRPC)。6. 根据权利要求1所述的方法，其中所述激素介导疗法包括雄激素剥夺治疗(ADT)。7. 根据权利要求6所述的方法，其中所述ADT是二线激素治疗。8. 根据权利要求7所述的方法，其中所述二线激素治疗阻碍雄激素的合成。9. 根据权利要求8所述的方法，其中所述二线激素治疗选自醋酸阿比特龙、酮康唑和氨 鲁米特所组成的组。10. 根据权利要求1所述的方法，其中所述有核细胞的免疫荧光染色包括广谱细胞角蛋 白、分化簇(⑶)45、二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)和雄激素受体(AR)。11. 根据权利要求1所述的方法，其中所述基因型参数包括拷贝数变异(CNV)标记。12. 根据权利要求11所述的方法，其中所述拷贝数变异（CNV)标记包括基因扩增或缺 失。13. 根据权利要求12所述的方法，其中所述基因扩增包括与雄激素非依赖性细胞生长 相关的基因。14. 根据权利要求13所述的方法，其中所述基因包括AR或v-myc禽骨髓细胞瘤病毒致癌 基因同源物(MYC)。15. 根据权利要求1所述的方法，其中所述蛋白表达参数包括量化蛋白表达水平。16. 根据权利要求1所述的方法，其中所述蛋白表达参数包括蛋白表达的亚细胞定位。17. 根据权利要求16所述的方法，其中使用高分辨率免疫荧光成像通过测量免疫荧光 信号的强度对所述蛋白表达水平进行定量。18. 根据权利要求15所述的方法，其中所述蛋白表达为AR表达。19. 根据权利要求1所述的方法，其中所述形态学参数包括细胞形状。20. 根据权利要求1所述的方法，其进一步包括在前列腺癌早期诊断之后在一个或更多 个时间点重复步骤(a)至(c)以连续监测所述基因型、形态学和蛋白表达参数。21. 根据权利要求20所述的方法，其中所述响应是基于所述时间点之间的谱系的对比 进行预测的。22. 根据权利要求21所述的方法，其中所述响应是抵抗性疾病的出现。23. 根据权利要求22所述的方法，其中抵抗性CTC的识别与抵抗性疾病的出现相关。24. 根据权利要求23所述的方法，其中所述抵抗性CTC代表主导抵抗性疾病的克隆谱 系。25. 根据权利要求22所述的方法，其中AR阳性CTC的重新出现预测抵抗性疾病的出现。26. 根据权利要求25所述的方法，其中所述AR阳性CTC的重新出现伴随着基因组变异。27. 根据权利要求26所述的方法，其中所述基因组变异包括AR或MYC扩增。28. 根据权利要求25所述的方法，其中所述AR阳性细胞的重新出现伴随形态学变化。29. 根据权利要求28所述的方法，其中所述形态学变化是细胞圆度降低。30. 根据权利要求20所述的方法，其中对所述时间点进行选择以对应于临床进展或治 疗。31. 根据权利要求20所述的方法，其中所述治疗包括全身化疗、激素介导疗法或辐射。32. 根据权利要求23所述的方法，其进一步包括确定所述抵抗性CTC是否是AR非依赖性 的、AR配体非依赖性的或两者。33. 根据权利要求2所述的方法，其中所述CTC的分离涉及从初始图像获取再定位。34. 根据权利要求33所述的方法，其中所述分离涉及所述CTC的重新成像。35. 根据权利要求34所述的方法，其中所述分离涉及所述CTC的物理提取。36. 根据权利要求1所述的方法，其包括将所述有核细胞作为单层沉积在载玻片上的初 始步骤。37. 根据权利要求1所述的方法，其中所述CTC数据是通过荧光扫描显微镜产生的。38. 根据权利要求37所述的方法，其中所述显微镜提供包括CTC和至少200个周围白细 胞(WBC)的视野。39. 根据权利要求38所述的方法，其中所述CTC包括与周围有核细胞不同的免疫荧光染 色。40. 根据权利要求41所述的方法，其中所述CTC包括与周围有核细胞不同的形态学特 征。41. 根据权利要求40所述的方法，其中所述形态学特征包括由细胞核大小、细胞核形 状、细胞核中孔的存在、细胞大小、细胞形状和细胞核与细胞质的比例、细胞核细节、细胞核 谱系、核仁的存在与否、细胞质的质量、细胞质的量所组成的组中的一个或更多个。42. 根据权利要求36所述的方法，其进一步包括将约200万至约3百万个细胞沉积在所 述玻璃载玻片上。
【文档编号】G01N33/574GK106062561SQ201480054213
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2014年9月30日
【发明人】彼得·库恩, 安格尔·欧内斯托·达戈罗德里格斯, 安德斯·卡尔森, 刘威, 吉姆·希克斯
【申请人】斯克利普斯研究院, 冷泉港实验室