用于阿尔兹海默症的早期诊断的生物标志物及方法

用于阿尔兹海默症的早期诊断的生物标志物及方法
【专利摘要】本发明在第一个方面涉及用于在受试者中诊断阿尔兹海默症或用于确定发生阿尔兹海默症的风险以及用于确定严重AD的存在的方法，其中测定至少四种特定的生物标志物。此外，提供了包含用于至少四种特定的生物标志物的检测工具、特别是抗体的试剂盒以及阵列。此外，提供了用于诊断阿尔兹海默症或确定发生阿尔兹海默症的风险的计算机程序产品和计算机实施的方法。
【专利说明】用于阿尔兹海默症的早期诊断的生物标志物及方法
[0001] 本发明在第一个方面涉及在受试者中用于诊断阿尔兹海默症或用于确定发生阿 尔兹海默症的风险或用于确定存在严重的阿尔兹海默症的方法，其中对至少四种特定的生 物标志物的组合进行测定。此外，提供了包含用于至少四种特定的生物标志物的检测工具、 特别是抗体的试剂盒以及阵列。此外，提供了用于诊断阿尔兹海默症或用于确定发生阿尔 兹海默症的风险或用于确定严重阿尔兹海默症的存在的计算机程序产品及计算机实施的 方法。
【背景技术】
[0002] 阿尔兹海默症(AD)是对人类生活有巨大代价的进行性大脑疾病。特别是由于日益 增加的处于风险中的大量老年公民，该疾病的影响对于发展中国家的政府也是越来越多的 担忧。阿尔兹海默症是痴呆的最常见形式，是记忆丧失和其它认知障碍的常用术语。通常， 痴呆包括以下形式:血管性痴呆和包括阿尔兹海默症或阿尔茨海默痴呆的退行性痴呆。不 同类型的痴呆被描述为淀粉体病变(阿尔茨海默痴呆）、tau蛋白病变(路易体疾病，克雅二 氏病，皮克氏病)和共核蛋白病(帕金森病）。
[0003] 痴呆的最大风险因素是年龄。超过85岁的人们更可能经历该状况，但是一些痴呆 形式在50岁以下的人们中发生。一些个体在基因上更容易发生特定的痴呆形式，如阿尔兹 海默症和亨廷顿症。此外，若干因素如大脑损伤(包括由中风引起的损伤）、营养失调、感染、 药物反应、中毒、大脑肿瘤或病灶可引起暂时性或永久性痴呆。
[0004] 阿尔兹海默症是慢性进行性神经退行性疾病，其是最普遍的痴呆类型。包括神经 成像方法的当前的诊断工具在不断地改进。然而，提高阿尔兹海默症的诊断的灵敏性和特 异性仍是一个挑战。两种诊断领域尤其是有挑战性的：第一，将阿尔兹海默症的早期阶段与 轻度认知障碍和正常老化区别开来;第二，尤其在相似的临床症状被各种痴呆类型所共有 时提高诊断的特异性。迄今为止，来自脑脊液(CSF)的β-淀粉体（1-42)、总的tau和磷酸化 tau-181的分析是以高的可靠性和有效性诊断阿尔兹海默症和将其与其它痴呆形式区别开 来的最佳生物标志物。Marksteiner J·等(今日药物(Drugs Today)43(6) :423-31,2007)综 述了CSF生物标志物和推定的血液相关标志物的使用。据建议，轻度认知障碍的风险受tau 蛋白基因变异的影响，并且轻度认知障碍与阿尔兹海默症共有共同的基因背景。这可以帮 助阐明认知减退的基因风险和设计有效的临床试验。We lge V.等（神经传递杂志 (J · Neural · Transm ·)，116(2): 203-12，2009)报道了对于脑脊液（CSF)浓度，比率Αβ?-42/Αβ l-38/p-tau有力地将阿尔兹海默症(AD)与非阿尔兹海默痴呆患者区别开来，并且满足了合 适的筛选和差别的诊断AD生物标志物的准确性要求。
[0005] 阿兹海默症协会提供了病程期间的七个阶段，SM:没有损伤，2非常轻度的减退 (早期阶段），3轻度减退，4中度减退，5中度的严重减退，6严重减退，和7非常严重的减退。
[0006] 神经退行性病症的早期检测将能够使得更有效地治疗患者。近期的研究已经证 明，如阿尔兹海默症的病症以可能持续数年的预症状期为特征，在该预症状期期间但在临 床症状出现之前发生神经退化。这提出了两个挑战-如何在该预临床期期间识别个体-以及 机遇。可在疾病症状出现之前的预临床阶段期间开始预防疗法。因此，临床研究的主要目标 是通过开发将诊断向后移到神经退化临时过程的工具而改进这些疾病的早期检测。此外， 处于发生阿尔兹海默症的风险中的个体的早期识别是高度期望的。本领域描述了，AD预防 和治疗在具有所述神经退行性病症的早期检测的患者中更有效，以及更有效地延迟AD的所 述最终进程。
[0007] 在阿尔兹海默症的病理学中涉及聚集的淀粉体-β(Αβ)肽。在体外和在体内，这些 聚集体被发现呈多种形态学，包括球状低聚物和线性原纤维，其具有不同的生物活性。偶发 阿尔兹海默症(AD)的诊断和监测已长时间取决于具有晚期疾病的个体的临床检查。然而， 即将来临的抗-AD疗法在个体显示非常轻度的神经退化体征时最佳地启动。越来越达成共 识将脑脊液淀粉体-β(Αβ)作为AD的轻度认知障碍阶段的核心标志物。在AD的发病机理中直 接涉及Αβ或Αβ与其它的主要致病因素紧密相关。其通过取决于β位点APP-裂解酶1和γ -分 泌酶复合体的蛋白酶解加工由淀粉体前体蛋白（APP)产生，并且被广泛的蛋白酶所降解。
[0008] 脑脊液(CSF)中的淀粉体-邱勺40和42个氨基酸残基形式(Αβ(1-40)和Αβ( 1-42))已 经被提议为阿尔兹海默症(AD)的潜在生物标志物。CSF中的A抑太的定量分析几乎唯一地依 赖于免疫吸附类试验，例如酶联免疫吸附试验(ELISA)程序的使用。然而，由于Α?3肽易于自 发聚集或与其它蛋白和玻璃器皿结合的性质，这种分析是极其有挑战性的。分析进一步被 肽经受翻译后修饰的可能性和在ELISA试验中与CSF的内源性成分发生交叉反应的可能性 而复杂化。近期的发现显示，相对于Αβ( 1-40)降低的血浆Αβ( 1-42)可能增加AD的风险 (Hampel Η.等，阿尔茨海默痴呆(Alzheimers Dement. ),4(1):38-48,2008)。
[0009] 肿瘤坏死因子a(TNF-a)是属于肿瘤坏死因子(TNF)超家族的多功能促炎性细胞因 子。该细胞因子主要由巨噬细胞所分泌。其在包括如下的宽谱生物过程的调节中涉及:细胞 增殖、分化、凋亡，脂质代谢和凝聚。该细胞因子已在包括自身免疫病、抗胰岛素性和癌症的 多种疾病中涉及。小鼠中的敲除研究也显示了该细胞因子的神经保护功能。
[0010] 因此，炎症作为阿尔兹海默症(AD)的主要因素的概念基于与病灶相关的自动破坏 性变化的验尸后发现以及抗炎剂的保护效果的流行病学证据。现今，存在以下证据:AD的风 险基本上受炎症制剂白介素Ia、白介素1β、白介素6、肿瘤坏死因子a、a (2)_巨球蛋白和a (1)-抗胰凝乳蛋白酶中的总共10种多态性所影响。所述多态性均为常见的多态性。
[0011] WO 2005/052292和WO 2006/133423描述了用于在体液中诊断、层化和监测AD和其 它神经障碍的方法和组合物。例如，源于以上WO申请的EP 2211183B1确定了用于诊断和监 测AD的方法，其中对作为生物标志物的胰岛素样生长因子结合蛋白2(EGFBP-2)进行了测 定。参考的专利申请提供了大量可能的生物标志物，所述生物标志物据称应适合于诊断包 括AD的神经障碍。然而，没有公开允许以高准确性诊断和预测AD的一组特定的生物标志物。 此外，Thambi se tty，Ν·等，生物标志物和医学（biomarker s and medicine),未来医学 (future medicine)，伦敦，第4卷，第1期，第65至79页公开了基于血液的AD生物标志物:有 挑战性但可行。WO 2009/149185识别了双重可变域免疫球蛋白及其用途。
[0012] 近期的发现显示，在阿尔兹海默症(AD)的发病机理中涉及脑源性神经营养因子 (BDNF) ADNF是在成人脑中的神经功能、突触可塑性和结构完整性的维护中涉及的内源性 蛋白。在27个AD患者，作比较的9个常压脑积水(NPH)患者和28个年龄匹配的健康对照中，通 过灵敏ELISA来评估BDNF血清和脑脊液(CSF)浓度。与健康对照（21.3ng/ml; p = 0.041/p = 0.017)相比，发现AD(18.6ng/ml)和NPH患者（I8.1ng/ml)中的BDNF血清浓度显著降低。m)NF 血清浓度不与AD和NPH两种患者中的CSF水平、年龄或简易精神状态检查(MMSE)分数相关。 AD和NPH中的BDNF血清水平的降低可以反映营养支持的缺乏，因此促成在两种疾病中的进 行性退化。
[0013]慢性炎症是阿尔兹海默症(AD)的特征。已经报道了在促炎性细胞因子白介素-6 (IL-6)与抗炎性细胞因子白介素-IO(IL-IO)的基因的调控区中的多态性之间与AD的风险 相关的相互作用。部分由于在所述两种基因中的基因变异而导致的IL-6和IL-10两者在一 些老年人中的失调可以促成AD的生成（Cam-barros 0.等，神经炎症杂志 (J.NeuroinfIammation)，23(6):22，2009)。
[0014] IL-6(也称为干扰素β2)在阿尔兹海默症(AD)中高度升高，并且与其它疾病如糖尿 病有着强的相关性。IL-6还与其它神经退行性疾病和抑郁症有相关性。还认为白介素IL-10、IL-18和血管内皮生长因子(VEGF)在阿尔兹海默症(AD)中起作用。Malaguera L.等（神 经病理学(Neuropathology)，26(4) :307-12,2006)确定了，与非痴呆性年龄匹配的受试者 相比，在患有AD的患者中IL-18的水平显著升高。
[0015] Mateo等（神经病学学报(Acta Neurol · Scand ·)，116( 1): 56-8，2007)描述了血管 内皮生长因子(VEGF)决定重要的神经营养性和神经保护性行为。低的血清VEFG水平与阿尔 兹海默症相关。
[0016] 神经保护的完整性是防备认知障碍和AD的发生的重要组成部分。与健康老年受试 者（IGF-1，9 · 5±2 ·4pg/ml;VEGF，105±31pg/ml;和TGF-βΙ，68± 18pg/ml)相比，阿尔兹海默 症患者组在基线处显示了胰岛素样生长因子（IGF-l)(3.7±1.2pg/ml)、血管内皮生长因子 (VEGF)(63±18pg/ml)和TGF-m(33±10pg/ml)的严重降低。在健康受试者（r = 0·87，p〈 0.001)以及在AD受试者中均发现了IGF-I与VEGF浓度之间的显著正相关性(Luppi C.等，老 年学和老年医学档案(Arch.Gerontol .Geriatr. )49(附录 1): 173-84,2009)。
[0017] 血浆同型半胱氨酸的升高与老龄化常见的问题如认知障碍、痴呆、抑郁、骨质疏松 性骨折和功能减退相关。已知，同型半胱氨酸水平在血管性痴呆患者中比在阿尔兹海默症 (AD)患者或对照中更高。升高的血浆同型半胱氨酸浓度和低的血清叶酸浓度是发生痴呆和 AD的独立的预测因子。血浆同型半胱氨酸水平的正常范围为5-15ymol/L，对于AD患者为15μ mol/L之上。
[0018] 单核细胞趋化蛋白-I (MCP-1)在以富含单核细胞的细胞浸润物为特征的多种疾病 如动脉粥样硬化、充血性心力衰竭和类风湿性关节炎中高度诱发。
[0019] 检测血清中的升高水平的C-反应性蛋白（CRP)对于任何特定疾病是非特异性的。 其是炎性过程的有用的指示剂。在基于群体的背景下，在老年非痴呆人中，血浆CRP与普遍 的轻度认知障碍(MCI)和与非遗忘型MCI相关。这些发现表明在MCI的发病机理中涉及炎症。 在具有MCI的患者中，高的血浆CRP水平与加速的认知减退和增加的痴呆风险相关。AD患者 比血管性痴呆患者具有更高的CRP水平(分别为4.2±0.6相比于1.7±0.2，p〈0.001)。逐步 的多元逻辑回归分析显示，痴呆(让步比=〇R = 4.965,95%置信区间=CI = 1.402-13.23，p =0.004)、纤维蛋白原（OR= 1.011 ,Cl = 1.007-1.015，p〈0.001)和年龄(OR= 1.158 ,CI = 1.063-1.261，p〈0.001)独立地与高水平的CRP相关。研究表明炎症可在AD中具有发病的作 用(Mancinella A.等，老年学和老年医学档案(Arch.Gerontol .Geriatr. )49(附录I): 185- 94,2009)。
[0020] 目前对于阿尔兹海默症没有治愈，但是对于其治疗存在基于药物和非药物的方 法。一般来讲，药物治疗被用于减缓症状的发展。几种生物标志物很好地证明在一大群患者 中是有效的，但是成功与在其早期识别疾病载体直接相关。这证实了对通过分子工具的及 时且准确的诊断形式的需要，Ray S.等，自然医学(Nat.Med. )13(11) :1359-62,2007。
[0021] 总而言之，用于早期阿尔兹海默症的改进的诊断筛选具有大量的益处。早期诊断 允许在疾病早期阶段中的人们促成进行关于药物治疗的过程的决定。如果现有的治疗方法 将会起作用，则它们在疾病的早期阶段最好地起作用。早期检测允许早期干预。随着药物治 疗的发展，在未来极有可能的是，早期检测将防止随着阿尔兹海默症的发展而发生的对脑 的不可逆损伤。因此，对于允许在早期阶段以高的特异性诊断AD的方法和测试体系有着不 断的需要。此外，为了将AD与其它类型的痴呆区别开来，需要新的方法和测试。也就是说，鉴 定AD之后的步骤对于允许确定治疗方案是有帮助的。
[0022] 发明简述
[0023] 本发明在第一个方面涉及用于诊断阿尔兹海默症(AD)或用于预测发生阿尔兹海 默症(AD)的风险的方法，所述方法包括：
[0024] a)测定来自受试者的生物样品中的AD生物标志物的水平或量;和
[0025] b)基于所述生物标志物的水平或量确定或诊断AD的存在或发生AD的风险，
[0026]其中所述生物标志物是至少四种选自如下的生物标志物：脑源性神经生长因子 (BDNF)，胰岛素样生长因子-UIGF-I )，肿瘤生长因子m(TGF-m)，血管内皮生长因子 (VEGF)，白介素18(IL-18)和单核细胞趋化蛋白-I(MCP-I)，并且在第一个实施方式中，其中 IL-18和/或MCP-I的增加和/或BDNF、IGF-1、VEGF和/或TGF-βΙ的降低指示AD的存在或发生 AD的风险。此外，同型半胱氨酸可用作用于验证诊断的另外的生物标志物。在AD患者中，同 型半胱氨酸的水平或量降低。
[0027]此外，用于确定受试者中阿尔兹海默症(AD)的状态的方法包括：
[0028] a)测定来自受试者的生物样品中的AD生物标志物的水平或量;和 [0029] b)基于所述生物标志物的水平或量以高的特异性确定AD的存在或状态，
[0030]其中所述AD生物标志物是至少四种选自如下的生物标志物:脑源性神经生长因子 (BDNF)，胰岛素样生长因子-UIGF-I )，肿瘤生长因子m(TGF-m)，血管内皮生长因子 (VEGF)，白介素18(IL-18)，和单核细胞趋化蛋白-I(MCP-I)，并且其中IL-18和/或VEGF的增 加和/或8〇即、16?-1、1〇 3-1和/或了6?-01的降低指示严重4〇的存在。
[0031]也就是说，在另一个实施方式中，在痴呆患者中确认遭受从严重AD开始的后期AD 的特征是IL-18和/或VEGF的升高和/或BDNF、IGF-1、MCP-1和/或TGF-βΙ的降低。
[0032]所提及的生物标志物中的至少4种的组合一方面允许以至少90 %的高特异性对发 生AD的风险进行早期诊断和检测，另一方面以至少90%的高特异性确定严重情况的存在。 [0033] 优选对生物标志物BDNF、IGF-I、TGF-m、VEGF、IL-18和MCP-I中的至少四种，如至 少五种或全部生物标志物进行测定。
[0034]包含以上鉴定的生物标志物中的至少四种的生物标志物分子标签在预测临床AD 上实现平均90%，如95%，特别是96%的准确性如灵敏性。至少，所述生物标志物分子标签 在尽早着手合适的疗法方面允许早期检测阿尔兹海默症的风险，以及允许确定严重AD的存 在。
[0035]此外，在第二个方面，本发明涉及用于诊断或预测发生阿尔兹海默症的风险以及 用于确定严重AD的存在的试剂盒，所述试剂盒包含用于至少四种选自如下的生物标志物的 检测工具：脑源性神经营养因子（BDNF)，胰岛素样生长因子-I(IGF-I)，肿瘤生长因子β? (TGF-βΙ)，血管内皮生长因子(VEGF)，白介素18(IL-18)和单核细胞趋化蛋白-I(MCP-I)，以 及任选地，同型半胱氨酸，所述试剂盒用于诊断AD或确定发生AD的风险，任选地，所述试剂 盒含有关于如何在根据本发明的用于诊断AD的存在或发生AD的风险以及用于确定严重AD 的存在的方法中使用所述试剂盒的说明书。
[0036]此外，本发明涉及如本文中限定的生物标志物中的至少四种、如至少五种用于AD 的诊断以及评估或疗法对照中的体外应用，其通过如下进行:确定个体的生物样品中的所 述生物标志物的水平或量，和与所述生物标志物的参比水平或量相比，确定所述生物标志 物中的至少四种、如至少五种的升高或降低。当水平或量分别在所述特定生物标志物的界 限之上或之下时，生物标志物指示AD。此外，本发明涉及包含用于检测根据本发明的生物标 志物中的至少四种的工具的阵列，特别是其中检测工具为抗体且免疫学地进行所述生物标 志物的检测的阵列或试剂盒。
[0037]此外，本发明涉及诊断AD或确定发生AD的风险的计算机实施的方法，所述方法包 括以下步骤：
[0038] a)获得在受试者和任选对照的生物样品中的根据本发明的AD生物标志物中的至 少四种的测定的水平或量的数据；
[0039] b)通过将所述样品中的生物标志物的水平或量与从数据库获得的界限值或作为 界限对照的测定水平或测定量获得的界限值进行比较而对步骤a)的数据进行运算；
[0040] c)鉴定其水平或量升高或降低至界限水平之上或之下的生物标志物。
[0041]最后，本发明涉及具有用于执行根据本发明的方法的计算机可执行的指令的计算 机介质或计算机程序产品。
[0042] 附图简述
[0043]在图1中，提供了显示各探针位置的微量滴定板的方案。对各样品进行测定，一式 两份。此外，存在阳性对照、阴性对照和界限对照，从而允许在板上具有内部对照。在本情况 下，测试了 5个患者样品。
[0044] 在图2中，示出了在表5中示出的生物标志物组合的特异性。如显示的，使用六种标 志物中的至少四种标志物给出超过90 %的特异性。发明详述
[0045] 如本文中使用的，术语"阿尔兹海默症"是指将大脑皮层中的神经细胞杀死而使大 脑的额叶和颞叶中的脑回（大脑皮层上的脊)萎缩或减小的退行性大脑疾病，特别是如由 NINCDS-ARDA标准（国家神经和沟通障碍和中风研究所（National Institute of Neurological and Communicative Disorders and Stroke)，和阿尔兹海默症及相关疾病 协会)所定义的。
[0046] 如本文中使用的，术语"诊断"是指鉴定病理状态的存在或特征。关于本发明的目 的，"诊断"是指基于体液的离体分析确定患阿尔兹海默症的风险。
[0047] 如在本文中使用的，术语"生物标志物"是指能够指示疾病状态的物质。在旨在诊 断阿尔兹海默症的本发明的上下文中，"生物标志物"是指指示大脑细胞是否处于正常状态 或发作阿尔兹海默症的物质。"生物标志物"包括多肽和糖蛋白，与正常的健康受试者相比， 遭受阿尔兹海默症或易于受阿尔兹海默症折磨的患者中它们的量升高或降低。
[0048] 如本文中使用的，术语"血液"包括全血、血清和血浆。
[0049] 如在本文中使用的，术语"抗体"是指与生物分子的抗原区域特异结合的免疫球蛋 白。关于本发明的目的，抗体与生物标志物特异地结合，并且包括多克隆抗体、单克隆抗体 和重组抗体。此外，本发明的抗体包括抗体分子的功能性片段，以及具有两个全长轻链和两 个全长重链的完整形式。抗体分子的功能片段是指保留至少抗原结合功能的片段，并且包 括? &13、？(&13'）2^4卩类似的片段。
[0050] 如在本文中使用的，术语"抗原-抗体复合物"是指生物标志物与识别它的抗体的 结合产物。
[0051] 如在本文中使用的，术语"包含"和术语"含有"包括"由…组成"的实施方式。
[0052]如在本文中使用的，术语"界限水平"是指为了在遭受AD的个体或处于发生AD的风 险中的个体之间区别开来而确定的相对或绝对水平。界限水平在相对水平的情况下以倍数 差异给出，在绝对值的情况下以特定的值给出，例如在蛋白水平的情况下表示为ng/ml或 pg/ml。如在本文中指示的，分别在界限水平之上或之下的值被视为允许诊断AD或确定发生 AD的风险，或允许确定严重AD的存在，并且最终视为AD患者中的疗法对照。
[0053]如在本文中使用的，术语"AD生物标志物"是指为AD诊断生物标志物的生物标志 物。
[0054]如在本文中使用的，术语"预测"是指做出个体具有发生生物疾病的显著提高的可 能性的发现。
[0055] 如在本文中使用的，术语"生物样品"涵盖了多种从个体得到的样品类型，并且可 用于诊断或监测测试。生物流体样品涵盖了血液、脑脊液(CSF)、尿和其它生物来源的液体 样品。如果需要，样品可预先进行处理，例如浓缩或分离。
[0056] "个体"是哺乳动物，更优选是人类，术语个体或受试者在本文中交互使用。
[0057]如在本文中使用的，"参比值"可以是绝对值、相对值、具有上限或下限的值、值的 范围、平均值、中值、均值、或与特定的对照或基线值相比较的值。参比值可基于单个的样品 值，例如由来自待测个体的在较早的时间点获得的样品获得的值，或者由来自除被测个体 外的AD患者或作为未诊断有AD的个体的正常个体的样品获得的值。参比值可基于例如来自 AD患者或正常个体的大量样品，或基于包括待测样品的样品池。
[0058]如在本文中使用的，除非另有指出，否则"一个(a)"、"一种(an)"和"所述(the)"可 指单数或复数。
[0059]如在本文中使用的，词组倍数差异是指AD生物标志物的测定值和参比值之间的幅 度差异的数值表示。通过用测定数值除以参比数值来数学计算倍数差异。例如，如果AD生物 标志物的测定值为20纳克/毫升(ng/ml)且参比值为10ng/ml，则倍数差异为二。或者，如果 AD生物标志物的测定值为10ng/ml且参比值为20ng/ml，则倍数差异为50%。
[0060]本发明人认识到，当对至少四种选自脑源性神经营养因子(BDNF)、胰岛素样生长 因子-I(IGF-I)、肿瘤生长因子m(TGF-m)、血管内皮生长因子(VEGF)、白介素 18(IL-18)、 和单核细胞趋化蛋白-I(MCP-I)和任选地同型半胱氨酸中的生物标志物的组合的水平或量 进行测定时，在第一个实施方式中，其中对来自受试者的生物样品中的IL-18、MCP-1和/或 同型半胱氨酸的增加和/或BDNF、IGF-1、VEGF和/或TGF-βΙ的降低进行确定，可以以比仅使 用1、2或3种标志物的组合更高的特异性诊断早期AD或确定发生阿尔兹海默症的风险。特别 地，已证实阿尔兹海默症或发生阿尔兹海默症的风险与本文中指定的六种标志物的表达水 平的变化，即IL-18、MCP-1和/或同型半胱氨酸的增加以及BDNF、IGF-1、VEGF和/或TGF-βΙ的 降低相关。此外，已经认识到，当将脑源性神经营养因子(BDNF)、胰岛素样生长因子-I(IGF-1)、肿瘤生长因子m(TGF-m)、血管内皮生长因子(VEGF)、白介素18(IL-18)和单核细胞趋 化蛋白-I (MCP-1)中的至少四种，优选至少五种，如全部六种生物标志物组合时，特异性和 灵敏性高到足以诊断和预后AD，而所述生物标志物中的每个单独可能在除AD外的不同疾病 或状况中变化。此外，同型半胱氨酸的量或水平可用于确认结果。
[0061] 在又一个方面，根据本发明的方法允许将AD与确定的痴呆的其它形式区别开来， 并允许确定AD的后期阶段，即严重阶段和非常严重的阶段。也就是说，确定的AD的特征在于 BDNF、IGF-l、MCP-l和/或TGF-m的降低和/或VEGF和/或IL-18的增加。表2显示了正常健康 对照组和严重阿尔兹海默症患者组的血清样品中的所述蛋白的测定量。在这一点上，要注 意的是术语"严重的"和"确定的"在本文中交互使用。
[0062] 表 2
LOOM」特别地，当如本文中I很定的六柙生物标志物中的全少四柙生物标志物分别增加或 降低时，诊断AD或确定发生AD的风险以及确定严重AD的存在的准确性非常高，并且可以监 测治疗。特别地，准确性为至少90%，例如至少95%，且在一些情况下为至少96%。例如，该 方法的灵敏性在至少90%，如至少95%，例如至少96%的范围内。此外，根据本发明的方法 的特异性为至少85%，如至少90%，例如至少92%或至少95%。因此，根据本发明的生物标 志物的特定组合允许以高的准确性，特别地以相比于现有技术的高的准确性诊断或确定 AD0
[0065]如果需要，根据本发明的生物标志物可与本领域已知并且描述为合适的AD生物标 志物的其它生物标志物相组合。本领域技术人员很清楚可与本文中限定的生物标志物相组 合的合适的生物标志物。
[0066]现有技术描述了相比于对照组在遭受AD的受试者中水平或量变化的一些生物标 志物。然而，特别是鉴于单种生物标记物其表达水平或量可能也在其它疾病中变化的事实， 它们的特异性和灵敏性即准确性不足以或不满足于在受试者中诊断AD或确定发生AD的风 险。
[0067]相比之下，根据本发明的该组生物标志物，即作为根据本发明的生物标志物中的 至少四种的生物标志物允许以高的准确性和特异性早期诊断AD以及确定严重AD的存在。
[0068] 此外，注意术语测定、确定或诊断包括物理地测定、物理地确定或物理地诊断AD生 物标志物的水平或量的步骤。也就是说，该方法包括以下步骤:利用对于测定水平或量有用 的已知方法测定AD生物标志物的水平或量，和使用所述测定的水平或量相应地确定或诊 断。
[0069] 在一个优选实施方式中，生物标志物以其肽或蛋白的形式加以确定。然而，也可以 在核酸水平，例如基于生物样品中的mRNA水平或量测定AD生物标志物的水平或量。
[0070] 根据本发明，本文中公开的方法分别涉及体外和/或体内方法。优选地，所述方法 是基于获自个体的和体外提供的样品的体外方法。
[0071] 本发明人旨在证明，测定和确定特定的AD生物标志物，即脑源性神经营养因子 (BDNF)、胰岛素样生长因子-UIGF-I )、肿瘤生长因子m(TGF-m)、血管内皮生长因子 (VEGF)、白介素18(IL-18)和单核细胞趋化蛋白-I (MCP-1)的水平或量，允许诊断或预测发 生AD的风险，以及允许将AD与其它类型的痴呆区别开来和确定AD的后期阶段。
[0072] 在一个优选实施方式中，对下面指示的生物标志物的组合进行测定：
[0073] a)BDNF、IGF-l、VEGF和TGF-βl;
[0074] b)BDNF、IGF-I、VEGF、IL-18和MCP-I;
[0075] c)BDNF、VEGF、TGF-βΙ、IL-18和MCP-I;
[0076] d)IGF-I、VEGF、TGF-m、IL-18、MCP-1。
[0077] 另一个优选实施方式包括以下组合：
[0078] e) BDNF、IGF-UVEGF 和 MCP-I
[0079] f) BDNF、IGF-I、TGF-m、MCP-l
[0080] g)BDNF、IGF-I、VEGF、TGF-m、MCP-1。
[0081] 在本发明的一个实施方式中，所述方法包括测定如本文中限定的所有生物标志物 的水平或量。此外，也确定了同型半胱氨酸的水平或量。
[0082] 如提及的，生物标志物标签，即根据本发明的生物标志物的水平或量，允许以平均 96%的准确性预测临床阿尔兹海默症。这可用于确认具有明显的痴呆体征的患者反映为 AD，此外，这可用于诊断具有不清楚的症状或轻度认知障碍的患者，这种患者具有大的或甚 至更高的感染AD的风险。与诊断AD的现有技术相比，当前请求保护的生物标志物具有大量 的优点。例如，所有的生物标志物存在于血液中。它们可容易地和可信地利用标准设备在血 液或血清样品中进行测定，而不需要分析组织或脑脊液。
[0083]在本发明的一个实施方式中，生物样品选自血液、组织或体液。在优选的实施方式 中，生物样品是血液，特别是血清。
[0084]如提及的，在一个实施方式中，在特别是处在早期疾病阶段的AD患者的样品中，如 在AD患者组的血液中，生物标志物IL-18和MCP-I以及同型半胱氨酸相比于所述生物标志物 在用作对照受试者的非疾病人类组中的水平或量增加。对于确定的（严重)AD，生物标志物 IL-18 和 VEGF 增加。
[0085] 此外，与在非疾病人类组的样品中的量相比，BDNF、IGF-l、TGF-m和VEGF以较低的 量存在于特别是处在早期疾病阶段的AD患者组的样品中。对于确立的（严重)AD，生物标志 物 BDNF、IGF-I、TGF-βΙ 和 MCP-I 增加。
[0086]也就是说，对于单个的生物标志物，在AD组中的量或水平的变化相比于对照组或 参比组在高达至70%的范围内，而如本文中限定的生物标志物的组合，即确定至少四种生 物标志物的水平或量的变化或改变允许将诊断AD或确定发生AD的风险的准确性增加90% 以上。
[0087] 例如，相比于对照受试者，BDNF在AD患者的血液中降低几乎70%。细胞因子与年龄 显不尚的显者的相关性。
[0088]表1显示在正常健康对照组和早期阿尔兹海默症患者组的血清样品中的生物标志 物蛋白和所述蛋白的测定量。
[0089]表1
[0091 ]通过已知方法进行根据本发明的生物标志物的水平或量的测定。例如，在蛋白水 平确定水平或量的情况下，进行免疫试验，例如ELISA、RIA、放射免疫扩散、蛋白印迹、奥克 特洛尼免疫扩散、火箭免疫电泳、免疫组化染色、免疫沉淀试验、补体结合试验、FACS和蛋白 质芯片试验以及免疫荧光试验、多重免疫试验、线性试验或斑点印迹试验。
[0092] 在一个优选实施方式中，进行ELISA。用于测定生物标志物的水平或量的测定工具 的典型实例包括蛋白特异性抗体。特定的分子抗体在本领域是已知的或者可基于本领域描 述的方法容易地制备。测定蛋白水平意味着通过使用与蛋白特异结合的测定工具如抗体测 定蛋白的量。所述测定方法可限定为上述方法中的任一种。通常，所述方法包括形成抗原抗 体复合物和通过已知方法确定该复合物。
[0093] 通过测定生物标志物蛋白的测定标签或表达标签的信号大小，可以确定抗原-抗 体复合物形成的量。也就是说，抗体可贴上本领域已知的检测标签，所述检测标签包括但不 限于酶、荧光标志物、配体、发光体、微粒子和氧化还原分子。可用作检测标签的酶的实例包 括但不限于D-葡萄糖苷酶、脲酶、过氧化物酶、碱性磷酸酶、乙酰胆碱酯酶、葡萄糖氧化酶、 己糖激酶、GDP酶、RNA酶、萤光素酶、磷酸果糖激酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基 转移酶和磷酸烯醇丙酮酸脱羧酶。荧光标志物的实例包括但不限于异硫氰酸荧光素、罗丹 明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白和荧光胺。配体的实例包括但不限于生物素、亲和素以 及生物素和亲和素的衍生物。
[0094] 如上所述，为了对选自所提及的蛋白生物标志物中的蛋白种类的水平进行测定， 本发明提供了如下的组合物，其包含对所述生物标志物蛋白有特异性的制剂，例如抗体，优 选单克隆抗体、重组抗体或抗体片段的形式。
[0095] 在一个实施方式中，根据本发明的方法包括以下步骤:将在所述生物样品中测定 的AD生物标志物的水平或量与生物标志物的参比水平或量进行比较。所述参比标签是：
[0096] a)从未患有AD的群体获得的平均标签;和/或
[0097] b)来自包括AD患者的个体的组的平均或中值水平。
[0098] 特别地，确定生物标志物的水平或量是否分别在界限水平之上或之下。
[0099] 例如，表3和4提供了在早期诊断的情况下在测定血液样品如血清样品中的生物标 志物蛋白的水平或量时的界限水平(表3)。
[0100] 衷3
[0102] 例如，对于BDNF，量降低至少50%，例如从正常健康对照组中的20ng/ml降至AD患 者组中的约l〇ng/ml以下。对于IGF-I，变化为约降低超过40%，例如从70ng/ml之上降至 6〇1^/1111以下。\^?降低约18%以上，例如从3〇9口8/1111降至25(^8/1111以下。对于16?-01，降低 为至少20%，例如从370? 8/1111降至300?8/1111以下。对于抓?-1，增加为40%以上，例如从 160pg/ml增至300pg/ml以上。对于IL-18,增加至少15%，例如增至200pg/ml以上。此外，可 确定同型半胱氨酸的水平或量，用于确认或证实使用如本文中限定的生物标志物获得的结 果。
[0103] 此外，表4显示具有严重AD的患者情况下的界限水平。
[0104] 表4
[0107] 在另一个方面，本发明涉及如下的试剂盒，所述试剂盒包含用于至少四种选自如 下的生物标志物的检测工具:脑源性神经营养因子(BDNF)，胰岛素样生长因子-I(IGF-I)， 肿瘤生长因子m(TGF-m)，血管内皮生长因子(VEGF)，白介素18(IL-18)和单核细胞趋化蛋 白-I (MCP-1 )，所述试剂盒用于诊断AD或确定发生AD的风险，以及用于确定严重AD的存在， 任选地，所述试剂盒含有关于如何以根据本发明的用于诊断AD的存在或发生AD的风险以及 用于确定严重AD的存在的方法使用所述试剂盒的说明书。
[0108] 用于检测诊断生物标志物的本发明试剂盒包含对以上蛋白有特异性的抗体，并且 可还包含与用于与底物的显色反应的标签例如酶偶联的第二抗体;诱发与标签的显色反应 的显色底物溶液;洗液;和酶反应停止液。其可还包含合适的微孔板、标准溶液和方案。对上 文和下文描述的生物标志物有特异性的（第一)抗体可自身代替与标签偶联的第二抗体而 与标签偶联。
[0109] 用于检测诊断生物标志物的本发明试剂盒可通过经抗原-抗体结合反应定性地或 定量地分析抗原而诊断阿尔兹海默症，并且抗原-抗体结合反应可通过常规方法如ELISA (酶联免疫吸附试验)或夹心试验进行测定。例如，用于检测如上文或下文所述的诊断生物 标志物的试剂盒可以设置为以下方式:通过使用表面涂布有分析物和对照的96孔微量滴定 板进行用于与重组单克隆抗体蛋白反应的ELISA。作为抗原-抗体结合反应的接受器，可以 使用聚乙烯树脂或聚苯乙烯树脂，硝基纤维素膜，或载玻片。
[0110]进行显色反应的常规标签如HRP(辣根过氧化物酶），碱性磷酸酶，胶体金，荧光标 签，如荧光素，FITC(聚L-赖氨酸-异硫氰酸荧光素)或RITCX异氰酸罗丹明-B)或染料可优选 用作第二抗体偶联物的标签或者用作第一抗体偶联物的标签。
[0111] 取决于标签而选择产生显色反应的底物。特别优选的底物是要与过氧化物酶，例 如与辣根过氧化物酶使用的底物，并且例如为TMB(3，3 '，5，5 '-四甲基联苯胺），ABTS(2，2 '-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）），或OPD(邻苯二胺）。优选地，在缓冲液(例如0 . IM 乙酸钠 ，pH 5.5)中以溶解的状态制备显色底物。用作抗体偶联物的标签的HRP(辣根过氧化 物酶)分解显色底物如TMB，以在过氧化氢的存在下制造显色沉淀。通过用裸眼检查显色沉 淀的沉淀程度，检测蛋白生物标志物的存在与否。在450nm下测定TMB的颜色，在420nm下测 定ABTS的颜色，和在492nm下测定(PD的颜色。硫酸溶液(H 2SO4)可优选用作过氧化物酶停止 液。
[0112] 可选地，可以使用作为酶标签的碱性磷酸酶和作为显色底物的PNPP(对硝基苯磷 酸盐）。可在405nm下测定硝基苯酚的黄色。通过添加氢氧化钠来停止该反应。
[0113] 洗液优选包含磷酸盐缓冲溶液、NaCl和吐温20,并且更优选地是包含0.02M磷酸盐 缓冲液、〇. 13M的NaCl和0.05 %的吐温20的缓冲溶液。在进行抗原-抗体结合反应以形成抗 原-抗体复合物之后，抗原-抗体复合物与第二抗体偶联物反应，然后通过将适量的洗液添 加至反应器而进行洗涤3到6次。
[0114] 也考虑确定生物标记物的量的其它方法，特别是RIA(放射免疫检测），聚丙烯酰胺 凝胶上的蛋白印迹，免疫印迹和免疫组化染色。如本领域众所周知的，针对考虑用于生物标 志物的定量确定的特定方法调整试剂盒。
[0115] 在本发明的优选实施方式中，利用辣根过氧化物酶和选自TMB、ABTS和OPD中的显 色底物，通过ELI SA测定生物标志物的量。
[0116]如上指出的，在蛋白水平确定生物标志物的水平或量的情况下，检测工具例如是 抗体。可选地，在核酸水平检测水平或量的情况下，检测工具可以是核酸分子。
[0117]例如，试剂盒是ELISA或本领域技术人员已知的其它合适的免疫试验。
[0118] 此外，本发明提供包含用于检测如本文中限定的生物标志物中的至少四种，例如 检测所述生物标志物中的至少五种，特别是如本文中限定的生物标志物中的六种的工具的 阵列。
[0119] 根据本发明的试剂盒或阵列对于进行根据本发明的方法是特别有用的。在所述试 剂盒或阵列的一个实施方式中，检测工具是与如本文中限定的生物标志物特异性结合的抗 体，如单克隆抗体。
[0120] 例如，根据本发明的阵列可以是微量滴定板。
[0121] 所述微量滴定板可允许确定生物标志物的水平或量，以及确定阳性对照、阴性对 照和/或界限对照的水平或量。因此，所述阵列允许确定所述生物标志物的增加或降低，特 别是所述生物标志物在界限水平之下或之上的增加或降低，由此允许基于所述生物标志物 的水平或量，容易地确定或诊断AD的存在或发生AD的风险，以及确定严重AD的存在。在图1 中，提供了显示合适的微量滴定板的方案。如指出的，患者样品1~5用六种分析物，即选自 根据本发明的七种生物标志物中的分析物1~6进行测定。此外，提供了阳性对照以及阴性 对照。此外，为了确定样品中的生物标志物的水平或量是否适合于允许确定或诊断AD，提供 了界限对照。因此，在同一阵列上的这一对照允许容易地确定AD生物标志物的测定水平或 量是否适合于诊断。这对于计算机实施的方法或系统是特别有价值的。
[0122] 也就是说，本发明在另一个方面涉及如本文中限定的生物标志物中的至少四种， 如五种，例如六种或全部用于阿尔兹海默症的诊断、风险评估或疗法对照中的体外应用，其 通过如下进行:确定个体的生物样品中的所述生物标志物的水平或量，和与所述生物标志 物的参比水平或量相比，确定所述生物标志物中的所述至少四种、如至少五种、如六种或全 部的升高或降低，其中参比水平是从未患有AD的群体获得的平均水平;和/或来自包括AD患 者的个体的组的中值水平，其中所述个体生物标志物的界限水平被相应地用于鉴定增加或 降低。在本发明的一个实施方式中，由在根据本发明的方法中作为对照存在的合适的界限 对照反映界限水平，例如，如在根据本发明的阵列中所述的。
[0123]此外，本发明涉及诊断AD或确定发生AD的风险的计算机实施的方法，所述方法包 括以下步骤：
[0124] a)获得如本文中限定的AD生物标志物，即脑源性神经营养因子(BDNF)、胰岛素样 生长因子-I(IGF-1)、肿瘤生长因子m(TGF-m)、血管内皮生长因子(VEGF)、白介素18(IL-18)和单核细胞趋化蛋白-I(MCP-I)中的至少四种在受试者和任选对照的生物样品中的测 定水平或量的数据；
[0125] b)通过将所述样品中的生物标志物的水平或量与从数据库获得的界限值或作为 界限对照的测定水平或测定量获得的界限值进行比较而对步骤a)的数据进行运算；
[0126] c)分析和鉴定其水平或量升高或降低至界限水平之上或之下的生物标志物。
[0127] 任选地，所述方法还包括在输出单元将每一种生物标志物的结果或仅仅阳性或阴 性诊断或风险评估的结果以例如有色和突出显示的形式展示呈现的步骤。
[0128] 例如，通过主成分分析进行分析。所述分析可伴有误差分析。
[0129] 最后，本发明涉及如下的计算机介质或计算机程序产品，其具有用于执行根据本 发明的方法的步骤的计算机可执行的指令。
[0130] 在一些实施方式中，测定值和参比值的比较包括计算测定值和参比值之间的倍数 差异，从而相应地鉴定测定值是否在界限值之上或之下。 实施例
[0131] 实施例1:从具有退行性脑疾病的患者和从正常健康受试者收集的血液的定量蛋 白分析
[0132] 在患者同意且遵循可适用的伦理准则的情况下，从患有阿尔兹海默症的患者和从 健康人受试者的对照组收集血液样品。
[0133] 使用血清分离管，并使得样品在室温下凝结2小时或在4°C下过夜，然后在约1000 Xg下离心约20分钟。立即对新鲜制备的血清进行测定或者将样品以等份储存在_20°(：或-80 °C下。应避免重复的冷冻/解冻循环。
[0134] 使用对以下标志物蛋白的收集样品的抗原有特异性的抗体进行ELISA(测定样品 抗原的夹心ELISA):BDNF，IGF-I，TGF-βΙ，VEGF，MCP-1 和IL-18。
[0135] 实施例 2:80陬、见？-1、了6?-财、￥￡6?、11-18和如卩-1的￡115八
[0136] 制备各抗原在pH7.4的I3BS中的I.Oml(lμg/ml)的标准稀释物。将其在室温下保持 1 〇分钟，并轻轻地摇动。
[0137] 从B&D Biosciences、Bachem、Novagen、Invitrogen或GenScript或其它购买分别 预涂布有 IL-18、TGF-βl、VEGF、BDNF、MCP-l和IGF-l的抗体的孔。
[0138] 制备提及的lμg/ml标准抗原溶液的I: I、1: 2、1:4、1:8、1:16、1:32和1:64的稀释液 各IOOyl并且各添加至一个孔(7个孔）。第8个孔预留为空白。利用封板机将孔封闭并在持续 摇动下（700rpm)在室温下孵育2小时。在孵育后，将板抽干，用400μ1洗液洗涤三次，并再次 抽干。然后，将1〇〇μ1各自的抗-HRP-偶联的抗体添加到板的各个孔中，并且在700rpm下的摇 动下在室温下孵育2小时。将各个孔的内含物抽干。将板再次洗涤三次，然后添加200μ1的 OPD(邻苯二胺二盐酸盐)底物溶液。通过将两片i〇mg的oro片剂添加到供应的oro稀释剂中， 然后添加50μ1的3 %H2O2，从而制备(PD底物溶液。然后将板在黑暗中孵育20-25分钟，同时产 生颜色。添加1 〇〇μ 1的停止液(3N硫酸)使显色停止。在微孔板读取仪中，在492nm下读取板。
[0139] 可使用ABTS(2,2'_连氮基-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸））、TMB(3,3'，5,5'_四 甲基联苯胺)或DAB(3，3 ' -二氨基联苯胺)代替(PD作为显色底物。
[0140] 可选地，可以使用作为酶的碱性磷酸酶和PNPP(对硝基苯磷酸盐）。在15分钟之后， 在室温下，可以在405nm下测定硝基苯酚的黄色。通过添加等体积的0.75M NaOH而停止该反 应。
[0141]由板上的标准品建立标准曲线，并且将其用于计算样品中的目标抗原的浓度。
[0142] 实施例3:来自阿尔兹海默症患者和正常健康受试者的测试样品
[0143] 用 IL-18、TGF-m、VEGF、BDNF、MCP-l和IGF-l各自的抗体（购自B&DBiosciences、 Genscript、Invitrogen、Genzyme、IBL international、Innogenetics或Calbiochem的特定 抗体的20μ1的1:100稀释溶液）以lOμg/ml的浓度对96孔高结合Stripwell免疫测试板 (Corning LifeSciences，NY，或BD Bioscience)进行预涂布，并进行封闭。将以1: 1、1:2、1: 4、1: 8、1:16和1:64的比率用PBS稀释的血浆样品100μΙ添加到各个预涂布的孔中。将板在 700rpm的旋转下，在室温下孵育2小时。在4 °C下，将孔用I3BS中的3 %牛血清白蛋白封闭过 夜。在用PBS/Ο. 1 %吐温20洗涤三次后，将BDNF、IGF-I、TGF-m、VEGF、IL-18和MCP-I的特异 抗体100μΙ施用到各个孔中，并且在4°C下孵育过夜。添加对第一抗体有特异性的HRP连接的 第二抗体50μ1，并且在700rpm下、在室温下孵育2小时。用0.1 M的PBS(碳酸氢钠缓冲液， Sigma，pH 9.6)将板洗涤三次，从而除去未结合的抗体-酶偶联物。添加100μ1的TMB(3，3 '， 5，5 四甲基联苯胺），在H2O2在甲醇中的3 %溶液的存在下，该TMB被酶转化为黄色。添加100 μL的3Ν硫酸使反应停止。在450nm下测定板孔的吸光度，从而确定抗原的存在和量。吸光度 和浓度的相关性是测试样品的标准(参比）曲线。
[0144] 表5:显示如本文中限定的生物标志物的组合，其中编号如下：1=BDNF，2 = IGF-I， 3 = VEGF，4 = TGF-m，5=MCP-1，6 = IL-18
[0147] 实施例4:同型半胱氨酸的确定
[0148] 遵循Araki A.和Sako Y.，色谱杂志（J.Chromatogr. ),422:43-52,1987,通过具有 荧光检测的高效液相色谱(HPLC)测定同型半胱氨酸。
[0149] 结果：
[0150] 在图2中，示出了如本文中限定的6种生物标志物中的至少4种的组合与特异性的 相关性。如显示的，仅仅在将至少4种标志物组合时才获得至少90%的特异性，然而仅仅在 将至少4种标志物组合时，就足以获得至少90%的特异性。
【主权项】
1. 一种用于诊断受试者中的阿尔兹海默症（AD)或确定受试者中发生阿尔兹海默症 (AD)的风险的方法，所述方法包括： a) 测定来自受试者的生物样品中的AD生物标志物的水平或量;和 b) 基于所述生物标志物的水平或量，以高的特异性确定或诊断AD的存在或发生AD的风 险，其中所述AD生物标志物是至少四种选自脑源性神经营养因子(BDNF)、胰岛素样生长因 子-l(IGF-l)、肿瘤生长因子m(TGF-m)、血管内皮生长因子(VEGF)、白介素18(IL-18)和单 核细胞趋化蛋白-1 (MCP-1)中的生物标志物，并且其中IL-18和/或MCP-1的增加，和/或 BDNF、IGF-1、VEGF和/或TGF-βΙ的降低指示AD的存在或发生AD的风险。2. -种用于确定受试者中的阿尔兹海默症(AD)的状态的方法，所述方法包括： a) 测定来自受试者的生物样品中的AD生物标志物的水平或量;和 b) 基于所述生物标志物的水平或量，以高的特异性确定AD的存在或状态， 其中所述AD生物标志物是至少四种选自脑源性神经营养因子(BDNF)、胰岛素样生长因 子-l(IGF-l)、肿瘤生长因子m(TGF-m)、血管内皮生长因子(VEGF)、白介素18(IL-18)和单 核细胞趋化蛋白-1 (MCP-1)中的生物标志物，其中IL-18和/或VEGF的增加，和/或BDNF、IGF- 1、MCP-1和/或TGF-βΙ的降低指示严重AD的存在。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其还包括提供来自受试者的生物样品的步骤。4. 根据权利要求1~3所述的方法，其中测定如权利要求1中限定的至少五种AD生物标 志物的水平或量，优选地，其中测定如权利要求1中限定的全部生物标志物。5. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述生物标志物为蛋白或肽的形式。6. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中测定如下的生物标志物的组合： a) BDNF、IGF-1、VEGF和TGF-βΙ; b) BDNF、IGF-1、VEGF、IL-18和MCP-1; c) BDNF、VEGF、TGF-β1、IL-18和MCP-1; d) IGF-1、VEGF、TGF-β1、IL-18、MCP-1; e) K)NF、IGF-1、VEGF和MCP-1; f) BDNF、IGF-1、TGF-βΙ、MCP-1; g) BDNF、IGF-1、VEGF、TGF-βΙ、MCP-1。7. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中诊断AD或预测AD的风险以及确定严重 AD的存在的特异性具有至少90%，优选至少95%的准确性。8. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述生物样品选自组织或包括血液的 体液，优选选自外周血液，特别是选自血清。9. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，使用免疫试验，优选ELISA、 RIA、多重免疫试验或免疫荧光试验、蛋白印迹、线性试验、斑点印迹试验进行测定。10. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述样品中的AD生物标志物的水 平或量与所述生物标志物的参比水平或量进行比较，其中所述参比水平是： a) 从未患有AD的群体获得的平均水平;和/或 b) 来自包括AD患者的个体的组的平均或中值水平，并且 其中分别在预定的相对或绝对界限水平或量之上或之下，所述生物标志物的水平或量 指示AD的存在或发生AD的风险或者指示严重AD的存在。11. 一种试剂盒，其包含用于至少四种选自脑源性神经营养因子(BDNF)、胰岛素样生长 因子-l(IGF-l)、肿瘤生长因子m(TGF-m)、血管内皮生长因子(VEGF)、白介素18(IL-18)和 单核细胞趋化蛋白-l(MCP-l)中的生物标志物的检测工具，所述试剂盒用于诊断受试者中 的AD或确定受试者中发生AD的风险或用于确定受试者中严重AD的存在，任选地，所述试剂 盒含有关于如何在根据权利要求1~10中任一项所述的用于诊断AD的存在或发生AD的风险 以及用于确定严重AD的存在的方法中使用所述试剂盒的说明书。12. 根据权利要求11所述的试剂盒，其是ELISA、RIA、多重免疫试验或免疫荧光试验、蛋 白印迹、线性试验、斑点印迹试验。13. 根据权利要求11~12中任一项所述的试剂盒，其用于根据权利要求1~10中任一项 所述的方法中。14. 一种阵列，其包含用于检测如权利要求1中限定的生物标志物中的至少四种、优选 所述生物标志物中的至少五种或用于根据权利要求1~10中任一项所述的方法中的工具。15. 根据权利要求11~14中任一项所述的试剂盒或阵列，其中所述检测工具是特异性 地针对如权利要求1中限定的AD生物标志物的抗体，优选单克隆抗体。16. 如权利要求1中限定的AD生物标志物中的至少四种、如五种的组合用于AD的诊断、 风险评估或疗法对照中的体外用途，其通过如下进行:确定个体的生物样品中的所述生物 标志物的水平或量，并且确定与所述AD生物标志物的参比水平或量相比，所述生物标志物 中的至少四种、如至少五种的增加或降低，其中所述参比水平是： a) 从未患有AD的群体获得的平均水平;和/或 b) 来自包括AD患者的个体的组的平均或中值水平，并且 分别在预定的相对或绝对界限水平或量之上或之下，所述生物标志物的水平或量指示 AD的存在或发生AD的风险。17. -种诊断AD或确定发生AD的风险的计算机实施的方法，所述方法包括以下步骤： a) 获得根据权利要求1所述的AD生物标志物中的至少四种在受试者和任选对照的生物 样品中的测定水平或测定量的数据； b) 通过将所述样品中的AD生物标志物的水平或量与从数据库获得的界限值或作为界 限对照的测定水平或测定量获得的界限值进行比较而对步骤a)的数据进行运算； c) 分析和鉴定其水平或量升高或降低至界限水平之上或之下的AD生物标志物。18. 根据权利要求17所述的计算机实施的方法，其中所述分析是主成分分析。19. 根据权利要求17或18所述的计算机实施的方法，其还包括以下步骤： d) 在输出单元上示出分析和鉴定AD标志物的数据，特别地，示出AD的诊断或风险的结 果。20. 计算机可读介质或计算机程序产品，其具有用于执行如权利要求1~10或权利要求 17~19中指出的步骤的计算机可执行的指令。
【文档编号】G01N33/68GK106062563SQ201580006178
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2015年1月28日
【发明人】安格莱特·福伊尔黑尔姆-海德尔
【申请人】普雷德姆泰克有限公司