一种检测碱性磷酸酶的方法
【专利摘要】本发明提供了一种检测碱性磷酸酶的方法，利用碱性磷酸酶ALP还原抗坏血酸磷酸酯AAP生成抗坏血酸AA，然后抗坏血酸使Cu2+还原成Cu+，Cu+可以抑制辣根过氧化物酶的活性，从而不能使TMB?H2O2溶液变色，实现了ALP的检测。与现有技术相比，本发明利用比色法进行ALP的定量检测，灵敏度高，检测限低，而且准确度高。
【专利说明】
一种检测碱性磷酸酶的方法
技术领域
[0001]本发明属于光化学技术领域，具体涉及一种检测碱性磷酸酶的方法，构建Cu2+和HRP-TMB-H202比色体系实现对碱性磷酸酶的灵敏检测。
【背景技术】
[0002]近年来，人类的健康状况越来越受到关注，碱性磷酸酶(ALP)作为一个典型的磷酸单酯酶是人类多种疾病的重要生物标志物之一，它能将多种多样的催化水解并且转磷酸，包括一些生物大分子和小分子。因此，碱性磷酸酶在细胞周期、生长、凋亡的信号转导和细胞内的调节过程起着关键性的作用。人体中的ALP水平的异常是多种疾病的信号，尤其是涉及到肝和骨血清中的ALP活性是经常作为一些疾病的诊断指标，包括骨骼疾病(骨肿瘤，佩吉特病，骨软化症)、肝脏疾病(癌症，肝炎，阻塞性黄疸)等。尽管对ALP的研究较为广泛，但其不同的生理和病理功能尚未完全阐明。近日，ALP对肠道内环境稳态的维持和保护作用也开始显露出来。因此，对各种生物系统的动态ALP活性做进一步研究是非常有必要的。
[0003]考虑到它们的重要性，近年来不同的方法已被用于检测生物体内ALP浓度。就ALP而言，有荧光，电化学，化学发光和表面增强共振拉曼散射等研究手段。尽管这些方法中的某些具有较高灵敏度，但它们大多数不能实时监测酶活性。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种检测碱性磷酸酶的方法，构建Cu2+和HRP-TMB-H2O2比色体系实现对碱性磷酸酶的灵敏检测。本发明利用碱性磷酸酶ALP还原抗坏血酸磷酸酯AAP生成抗坏血酸AA，然后抗坏血酸使Cu2+还原成Cu+，Cu+可以抑制辣根过氧化物酶的活性，从而不能使TMB-H2O2溶液变色，实现了 ALP的检测。
[0005]本发明提供的一种检测碱性磷酸酶的方法，包括以下步骤:
[0006]a、将抗坏血酸磷酸酯AAP溶液和一系列浓度梯度的碱性磷酸酶ALP溶液混合在PBS缓冲溶液中，然后加入CuSO4溶液，反应，得到混合溶液；
[0007]b、分别在步骤a制备的混合溶液中加入HRP溶液，室温下反应后，加入TMB-H2O2显色溶液，分别检测其吸光度，构建碱性磷酸酶ALP溶液浓度与吸光度的线性关系；
[0008]c、利用线性关系，得到待检测碱性磷酸酶ALP溶液浓度。
[0009]进一步的，步骤a中所述一系列浓度梯度的碱性磷酸酶ALP溶液的浓度为:OmU/mL，1mU/mL,2OmU/mL,40mU/mL,60mU/mL,80mU/mL, 10mU/mL和120mU/mL。
[0010]步骤a中，PBS缓冲溶液的pH为5-9;优选的为pH=7.4。
[0011]进一步的，步骤a中所述反应，具体为在20-25°C下，ALP和AAP反应时间5_90min。
[0012]进一步的，步骤a具体为:
[0013]将1yLlmg/mL的抗坏血酸磷酸酯AAP溶液和15yL—系列浓度梯度的碱性磷酸酶ALP溶液混合在10mL pH= 7.4的I3BS缓冲溶液中，浓度梯度分别为OmU/mL，I OmU/mL，20mU/mL，40mU/mL，60mU/mL，80mU/mL，100mU/mUP120mU/mL，然后分别加入1yL，100yg/mL CuSO4溶液，在室温下反应40min ；
[0014]步骤b具体为:分别在上述步骤a所得混合溶液中加入50yL 10ng/mL的HRP溶液室温下反应20min后，最后加入10yL 8.3mM的TMB-H2O2显色溶液，分别检测其吸光度，构建碱性磷酸酶ALP溶液浓度与吸光度的线性关系。
[0015]步骤a之前，将购买的碱性磷酸酶ALP和抗坏血酸AAP用二次水溶解，分别配成
0.lU/mL的碱性磷酸酶ALP溶液和lmg/mL抗坏血酸磷酸酯AAP溶液，然后分别配制100yg/mLC11SO4溶液、10ng/mL HRP和8.3mM TMB-H2O2溶液，并在4°C下保存备用。
[0016]本发明基于Cu+可以抑制HRP的活性，从而使TMB-H2O2溶液颜色产生变化，构建比色体系。在检测ALP的溶液中，溶液颜色不变蓝，随着颜色的逐步变淡，吸光度逐渐减小;基于Cu2+和HRP比色体系成功实现对ALP的检测。由于颜色的深浅和ALP的浓度相关，随着ALP的浓度增加，颜色逐渐变浅直至无色，因此该比色体系可以对不同浓度的ALP进行定量检测。
[0017]与现有技术相比，本发明利用比色法进行ALP的定量检测，灵敏度高，检测限低，而且准确度高，检测限是0.9966。
【附图说明】
[0018]图1为基于Cu2+和辣根过氧化物酶HRP制备比色体系比色法检测碱性磷酸酶ALP的实验原理图；
[0019]图2为检测ALP的可行性分析图;ALP存在和不存在两种情况下的紫外光谱图，其中a为存在ALP，13为不存在ALP ；
[0020]图3A为pH对本实验的影响图；控制整个体系的pH，pH分别为5,6,7.4,8和9；
[0021 ]图3B为反应时间对本实验的影响图；控制AAP和ALP的反应时间，反应时间分别为5min,1min,20min,40min,60min和90min；
[0022]图3C为反应温度对本实验的影响图；控制AAP和ALP的反应温度，分别控制在20°C，25°C，30Γ，37°C，40Γ，45°C 和50Γ ；
[0023 ]图 4A为ALP溶液的浓度为OmU/mL, I OmU/mL, 20mU/mL, 40mU/mL, 60mU/mL, 8OmU/mL,lOOmU/mL和120mU/mL的ALP的紫外光谱图；
[0024]图4B为ALP的线性关系图；
[0025]图5为比色体系对Hemoglobin, thrombin, Iysozyme和ALP四种蛋白质的选择性对比图；
【具体实施方式】
[0026]实施例1
[0027]—种检测碱性磷酸酶的方法，包括以下步骤:
[0028]将购买的碱性磷酸酶ALP和抗坏血酸AAP用二次水溶解，分别配成0.lU/mL的碱性磷酸酶ALP溶液和lmg/mL抗坏血酸磷酸酯AAP溶液，然后分别配制100yg/mL CuSO4溶液、10ng/mL HRP和8.3mM TMB-H2O2溶液，并在4°C下保存备用。
[0029]a、将1yL lmg/mL的抗坏血酸磷酸酯AAP溶液和15yL—系列浓度梯度的碱性磷酸酶ALP溶液混合在10mL PBS缓冲溶液(pH= 7.4)中，浓度梯度分别为OmU/mL，10mU/mL，20mU/mL，40mU/mL，60mU/mL，80mU/mL，100mU/mUP120mU/mL，然后分别加入 I OyL，100yg/mLCuS04溶液，在室温下反应40min ；
[0030]b、分别在上述步骤a所得混合溶液中加入50yL 10ng/mL的HRP溶液室温下反应20min后，最后加入10yL 8.3mM的TMB-H2O2显色溶液，分别检测其吸光度，构建碱性磷酸酶ALP溶液浓度与吸光度的线性关系。如图4A、4B所述。
[0031 ] c、利用线性关系，得到待检测碱性磷酸酶ALP溶液浓度。
[0032]实施例2
[0033]一种检测碱性磷酸酶的方法，PBS缓冲溶液的pH分别为5,6,7.4,8和9，其他与实施例I操作相同，结果如图3A所示。实施例3
[0034]一种检测碱性磷酸酶的方法，步骤a中反应时间为5min , 1min , 20min , 40min ,60min和90min，其他与实施例1操作相同，结果如图3B所示。
[0035]实施例4
[0036]一种检测碱性磷酸酶的方法，步骤a中反应温度为20°C，25°C，30°C，37°C，40°C ,45°(:和50°(:，其他与实施例1操作相同，结果如图3C所示。
[0037]实施例5选择性实验
[0038]将4组1yL,lmg/mL的AAP分别加入 120mU/mL ALP , ΙμΜ thrombin, ΙΟμΜHemoglobin,和8kU/mL(29mM) lysozyme在37°C 下反应40min后，分别加入50yL, 10ng/mL的HRP反应20min，最后加入10yL，8.3mM的TMB，观察溶液的颜色；另做一组空白实验，不加ALP，操作与上述相同。
[0039]吸光度结果如图5所示，可见该方法对ALP的检测的选择性较高。
【主权项】
1.一种检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于，所述检测碱性磷酸酶的方法包括以下步骤: a、将抗坏血酸磷酸酯AAP溶液和一系列浓度梯度的碱性磷酸酶ALP溶液混合在PBS缓冲溶液中，然后加入CuSO4溶液，反应，得到混合溶液； b、分别在步骤a制备的混合溶液中加入HRP溶液，室温下反应后，加入TMB-H2O2显色溶液，分别检测其吸光度，构建碱性磷酸酶ALP溶液浓度与吸光度的线性关系； c、利用线性关系，得到待检测碱性磷酸酶ALP溶液浓度。2.根据权利要求1所述的检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于，步骤a中所述一系列浓度梯度的喊性磷酸酶ALP溶液的浓度为:OmU/mL, 10mU/mL, 20mU/mL, 40mU/mL, 60mU/mL,80mU/mL，10mU/mL和120mU/mL。3.根据权利要求1或2所述的检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于，步骤a中，PBS缓冲溶液的pH为5-9。4.根据权利要求1或2所述的检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于，步骤a中所述反应，具体为在20-25 °C下，ALP和AAP反应时间5_90min。5.根据权利要求1或2所述的检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于，步骤a具体为:将10μL lmg/mL的抗坏血酸磷酸酯AAP溶液和15yL—系列浓度梯度的碱性磷酸酶ALP溶液混合在10mL pH= 7.4 的 PBS 缓冲溶液中，浓度梯度分别为 OmU/mL，I OmU/mL，20mU/mL，40mU/mL，60mU/mL，80mU/mL, lOOmU/mL和 120mU/mL，然后分别加入1yL, 100yg/mL C11SO4溶液，在室温下反应40mino6.根据权利要求1或2所述的检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于，步骤b具体为:分别在上述步骤a所得混合溶液中加入50yL 10ng/mL的HRP溶液室温下反应20min后，最后加入10yL 8.3mM的TMB-H2O2显色溶液，分别检测其吸光度，构建碱性磷酸酶ALP溶液浓度与吸光度的线性关系。
【文档编号】G01N21/78GK106066325SQ201610352426
【公开日】2016年11月2日
【申请日】2016年5月25日 公开号201610352426.2, CN 106066325 A, CN 106066325A, CN 201610352426, CN-A-106066325, CN106066325 A, CN106066325A, CN201610352426, CN201610352426.2
【发明人】王广凤, 史东敏, 孙悦
【申请人】安徽师范大学