一种检测ngal和糖化血红蛋白的检测试纸的制作方法
【专利摘要】本实用新型涉及免疫层析检测技术领域，具体涉及一种检测NGAL和糖化血红蛋白的检测试纸，包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸、检测线a、检测线b、质控线和PVC底板，所述样品垫、所述结合垫、所述硝酸纤维素膜及所述吸水纸依次搭接在所述PVC底板上，所述检测线a、检测线b、所述质控线依次包被于硝酸纤维素膜，所述结合垫包被有NGAL、HbA1c单克隆抗体—胶体金标记物层；所述检测线a包被有NGAL单抗，所述检测线b包被有HbA1c单抗，所述质控线包被有羊抗鼠IgG；采用本方案的一种检测NGAL和糖化血红蛋白的检测试纸具有灵敏度高、特异性强、操作简便、批间差异小、检测快速、准确的优点。
【专利说明】
一种检测NGAL和糖化血红蛋白的检测试纸
技术领域
[0001] 本实用新型涉及免疫层析检测技术领域，具体涉及一种采用胶体金免疫层析法测 定人血液中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白和糖化血红蛋白含量的一种检测NGAL和糖 化血红蛋白的检测试纸。
【背景技术】
[0002] NGAL分子量为25kD，是脂质运载蛋白Iipocalin超家族的2号成员，Kjeldsen在 1993年在人中性粒细胞中发现。NGAL与明胶酶B，即基质金属蛋白酶9(MMP-9)共价结合，形 成1351kD的异二聚体蛋白，由人类中性粒细胞分泌。研究表明，机体暴露在外界有害理化及 生物因素下，全血NGAL浓度明显高于正常水平。现代研究显示，生理状态下，NGAL不仅在中 性粒细胞表达，还在其他一些组织如胃壁细胞、肝胆管细胞、小肠潘氏细胞和肾近曲小管细 胞等均有表达。NGAL参与不同的生理及病理过程，涉及炎症免疫应答、肿瘤的发生发展的各 阶段，并且与肾损伤的发生发展密不可分。在缺血、中毒等损伤因素造成肾小管上皮细胞 NGAL高表达，使其在血液和尿液中能够被检出，而且升高早于血肌酐升高。
[0003] NGAL作为新型AKI早期诊断标志物，在缺血性、脓毒性、肾移植以及早期糖尿病等 的情况下均能在尿液和血液中检测到，并且灵敏度高，能作为更早的诊断指标。
[0004] 糖化血红蛋白（HbAlc)是人体血液中红细胞内的血红蛋白与血糖结合的产物。血 糖和血红蛋白的结合生成糖化血红蛋白是不可逆反应，并与血糖浓度成正比，且保持120 天左右，所以可以观测到120天前。糖化血红蛋白的含量变化可以作为糖尿病监测和诊断的 指标。
[0005] 我国肾病患者已达1.5亿人，其中糖尿病患者已高达9800万人，其他检测方法由于 时间长、费用高。为我国糖尿病和肾病监控和诊断带来了巨大的困难。
[0006] 鉴于此，本实用新型研究和设计了一种检测人血液中中性粒细胞明胶酶相关脂质 运载蛋白和糖化血红蛋白的一种检测NGAL和糖化血红蛋白的检测试纸。 【实用新型内容】
[0007] 本实用新型的目的在于提供一种灵敏度高、特异性强、操作简便、批间差异小、检 测快速、准确并适合床旁检测人血液中中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量和糖化血 红蛋白（HbAlc)的一种检测NGAL和糖化血红蛋白的检测试纸，以便对急性肾损伤、糖尿病的 早期诊断和治疗监控。
[0008] 为实现上述目的，本实用新型提供一种检测NGAL和糖化血红蛋白的检测试纸，包 括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸、检测线a、检测线b、质控线和PVC底板，所述样品 垫、所述结合垫、所述硝酸纤维素膜及所述吸水纸依次搭接在所述PVC底板上，所述检测线 a、检测线b、所述质控线依次包被于硝酸纤维素膜，所述结合垫包被有NGAUHbAlc单克隆抗 体一胶体金标记物层;所述检测线a包被有NGAL单抗，所述检测线b包被有HbAl c单抗，所述 质控线包被有羊抗鼠IgG。
[0009]本实用新型一种检测NGAL和糖化血红蛋白的检测试纸的制备方法，包括以下步 骤：
[0010]步骤一、胶体金的制备:取1个500mL圆底烧瓶，加入IOOmL去离子水，圆底烧瓶上端 接一回流冷凝管，于恒温磁力搅拌器上使用温度档350°C对其进行加热，转速420r/min，加 热至第5min，加入125yL 1%氯金酸。继续加热5min至沸腾状态后，沸腾的标准是水温为100 °C，向圆底烧瓶中快速加入250yL 10%柠檬酸三钠溶液，圆底烧瓶中溶液由紫变红后继续 加热反应10min，直至溶液透亮后，停止加热，继续以420r/min搅拌5min，冷却至室温，4°C密 封保存，即制得胶体金。
[0011]步骤二、金标抗体的制备:取ImL胶体金于1.5mL离心管中，调节pH至8.5。向离心管 中加入10以8/111]^的如41^单克隆抗体、81^/111]^的池41(3单克隆抗体，混勾后静置1〇111；[11，向离心 管中加入IOOyL 10 %BSA溶液，混匀后静置5min，制得金标抗体，即NGAL、HbAlc抗体一胶体 金标记物。
[00?2] 将制得的金标抗体溶液于4 °C 13500r/min离心10min，去除上清液，将沉淀用金标 稀释溶液稀释至原体积3/2，于4°C保存备用。
[0013] 步骤三、NGAL单克隆抗体、HbAl c单克隆抗体、羊抗鼠 IgG包被:取稀释至0.5mg/mL NGAL单克隆抗体、0.5mg/mL HbAlc单克隆抗体和I .Omg/mL羊抗鼠 IgG，采用dispent划膜仪 分别包被至硝酸纤维素膜的检测线a、检测线b和质控线位置。其中0.5mg/mL NGAL单克隆抗 体中含0.3%甲醇，0.51^/111^?^1(3单克隆抗体中含2.5%蔗糖，检测线 &距质控线距离为 14mm，检测线b距质控线距离为8mm，划膜浓度均为]^1^/〇11，平台移动速度为4〇1111]1/8。
[0014] 步骤四、试纸条的组装：（1)将硝酸纤维素膜，即NC膜，和吸水纸分别粘贴于PVC底 板上，吸水纸压住NC膜上方2mm; (2)将粘贴好NC膜和吸水纸的PVC底板在切条机上切割成 4_宽的试纸(3)将样品垫和结合垫切成4mm宽的条，同时将结合垫浸泡于金标抗体溶液中， 并放置于37摄氏度恒温恒湿干燥箱中烘干，制得金标垫；（4)烘干后的金标垫按长度Icm进 行裁剪。将金垫粘贴于PVC底板上，压住NC膜下方2mm，同时用样品垫压住金标垫下方2mm。
[0015] 与现有技术相比，本实用新型具有下列优点：
[0016] 1、本实用新型的检测人血液中中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白和糖化血红 蛋白一种检测NGAL和糖化血红蛋白的检测试纸，具有特异性强、灵敏度高、检测时间短、批 间差异小、结果稳定可靠等优点
[0017] 2、本实用新型的检测试纸条检测时间短，出报告时间快。
[0018] 3、本实用新型的检测试纸条操作简便，不需要专业人员操作。
[0019] 4、本实用新型对胶体金的制备实现程序化操作，大大降低了批间差异。
[0020] 5、本实用新型的抗体标记时间短，比传统时间缩短了 30min以上。
[0021] 6、本实用新型的样品垫和金垫具有优异的释放能力和吸水能力，有着更高准确 度。
[0022] 7、本实用新型中抗体在NC膜上包被方式可以提高免疫层析试纸条的稳定性和亲 水性。
[0023] 8、本实用新型采用氯化钠破坏法确定最终抗体标记浓度，提高试纸条灵敏度的同 时降低抗体用量，节约了成本。
【附图说明】
[0024] 图1为本实用新型一种检测NGAL和糖化血红蛋白的检测试纸的结构示意图：
[0025] 图2为本实用新型一种检测NGAL和糖化血红蛋白的检测试纸检测模式图；
[0026] 图3为制备本实用新型一种检测NGAL和糖化血红蛋白的检测试纸的NGAL的线性范 围相关性；
[0027]图4为制备本实用新型一种检测NGAL和糖化血红蛋白的检测试纸的HbAlc的线性 范围相关性。
[0028] 其中，1为样品垫，2为结合垫，3为硝酸纤维素膜，4为吸水纸，5为检测线a，6为检测 线b，7为质控线，8为PVC底板，9为加样孔，T为层析方向。
【具体实施方式】
[0029] 下面结合附图和【具体实施方式】对本实用新型作进一步详细的说明：
[0030] 如图1、2所示本实用新型揭示了一种检测NGAL和糖化血红蛋白的检测试纸，包括 样品垫1、结合垫2、硝酸纤维素膜3、吸水纸4、检测线a 5、检测线b 6质控线7和PVC底板8。所 述样品垫1、所述结合垫2、所述硝酸纤维素膜3及所述吸水纸4依次粘接在所述PVC底板8 上;所述结合垫2包被有NGAUHbAlc克隆抗体一胶体金标记物;所述检测线a 5上包被有中 性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白单克隆抗体，所述检测线b 6上包被有糖化血红蛋白单 克隆抗体，所述质控线7上包被有羊抗鼠 IgG。
[0031 ] -种制备一种检测NGAL和糖化血红蛋白的检测试纸的制备方法，包括以下步骤： [0032] 步骤一、胶体金的制备：取一个500mL的圆底烧瓶，加入IOOmL去离子水，圆底烧瓶 上端接一根回流冷凝管，于恒温磁力搅拌器上使用温度挡350°C对其进行加热，转速420r/ min，加热至第5min，加入125uL 1 %氯金酸。继续加热5min至沸腾状态后，沸腾的标准是水 温为100 °C，向圆底烧瓶中快速加入250yL 10 %柠檬酸三钠溶液，圆底烧瓶中溶液由紫变红 后继续加热反应1〇111；[11，直至溶液透亮后，停止加热，继续以4201'/1]1；[11搅拌51]1；[11，冷却至室 温，4 °C密封保存，即制得胶体金。
[0033] 步骤二、金标抗体的制备:取ImL胶体金于1.5mL离心管中，调节pH至8.5。向离心管 中加入10以8/111]^的如41^单克隆抗体、81^/111]^的池41(3单克隆抗体，混勾后静置1〇111；[11，向离心 管中加入IOOyL 10 %BSA溶液，混匀后静置5min，制得金标抗体，即NGAL、HbAlc抗体一胶体 金标记物。
[0034] 将制得的金标抗体溶液于4°C13500r/min离心10min，去除上清液，将沉淀用金标 稀释溶液稀释至原体积3/2，于4°C保存备用。
[0035] 步骤三、NGAL单克隆抗体、HbAl c单克隆抗体、羊抗鼠 IgG包被:取稀释至0.5mg/mL NGAL单克隆抗体、0.5mg/mL HbAlc单克隆抗体和I .Omg/mL羊抗鼠 IgG，采用dispent划膜仪 分别包被至硝酸纤维素膜的检测线a、检测线b和质控线位置。其中0.5mg/mL NGAL单克隆抗 体中含0.3%甲醇，0.51^/111〇^41(3单克隆抗体中含2.5%蔗糖，检测线 &距质控线距离为 14mm，检测线b距质控线距离为8mm，划膜浓度均为]^1^/〇11，平台移动速度为4〇1111]1/8。
[0036]步骤四、试纸条的组装：（1)将硝酸纤维素膜，即NC膜，和吸水纸分别粘贴于PVC底 板上，吸水纸压住NC膜上方2mm; (2)将粘贴好NC膜和吸水纸的PVC底板在切条机上切割成 4mm宽的试纸条；（3)将样品垫和结合垫切成4mm宽的条，同时将结合垫浸泡于金标抗体溶液 中，并放置于37摄氏度恒温恒湿干燥箱中烘干，制得金标垫；（4)烘干后的金标垫按长度Icm 进行裁剪。将金垫粘贴于PVC底板上，压住NC膜下方2mm，同时用样品垫压住金标垫下方2mm。
[0037] 作为实施的优选方式:在所述步骤一之前对实验所用容器的清洗:首先将实验用 玻璃容器浸泡于5 %二氯二甲硅烷的氯仿溶液中1分钟，室温干燥后蒸馏水冲洗，再干燥备 用。
[0038] 作为实施的优选方式:在所述步骤一中，所用去离子水电阻率为18.2Ω。
[0039]作为实施的优选方式:在所述步骤二中，金标稀释液为含有3 环糊精、0.01 % 酪蛋白、0.5%83厶、0.05%吐温的?!1为7.4，的0.0謂的?83。
[0040]作为实施的优选方式:在所述步骤四（3)中，还包括对样品垫进行前处理的步骤， 即将样品垫用切条机分别切成4mm的长条，用含有5%的蔗糖、I %BSA、0.2 %吐温的pH为7.6 的0.01M的PBS。
[0041 ]抗体最佳标记量的确定：
[0042]氯化钠破坏法:取20支1.5mL离心管，对其从1 一20编号，分别加入ImL胶体金溶液， 然后加入IOyl 〇 · IM K2CO3调节pH，混勾。1 一10管加入0以8、2以8、4以8、6以8、8以8、1(^8、12以8、14 yg、16yg、18yg中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体，11 一20管加入Oyg、2yg、4yg、6yg、 8yg、10yg、12yg、14yg、16yg、18yg糖化血红蛋白抗体，震荡混勾。最后1至20号管分别IOOyL 10%NaCl溶液，静置观察每支离心管的颜色变化，当有离心管颜色变为紫色时说明该抗体 浓度不是最适合标记浓度，颜色保持红色不变的标记浓度为适合标记浓度，保持红色不变 的最低标记浓度为最小标记量。
[0043]表一：中性粒细胞明Jj父酶相关脂质运载蛋白抗体最佳蛋白标记量的确定
[0045]表二:糖化血红蛋白抗体最佳标记量确定
[0047]抗体最佳标记pH值的确定
[0048]氯化钠破坏法:取7支1.5mL离心管，对其从1 一7编号，分别加入ImL胶体金溶液，然 后按1 一7序号分别将胶体金溶液pH值调整至6、7、7.5、8、8.5、9、9.5，混匀。再加入IOng中性 粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体和Sng糖化血红蛋白抗体，震荡混匀。最后1至7号管分 别IOOyL 10 %NaCl溶液，静置观察每支离心管的颜色变化，当有离心管颜色变为紫色时说 明该PH值不是最适合标记pH值，颜色保持红色不变的pH值为最适合标记pH值。
[0049]表三:最佳标记pH值的确定
[0051 ]试纸条性能测试 [0052] 1试纸条的灵敏度
[0053]将0.5mg/mL中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白标准品溶液用阴性全血分别稀 释为 Ong/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL、1500ng/mL 的一系列标准溶 液，每个标准浓度取50μ1，加入200yL0.0IM pH7.6PBS中，混匀，取75yL加入加样孔，计时 3min后检测。仪器可以检测到产生变化的最小OD值对应浓度为20ng/mL，因此中性粒细胞明 胶酶相关脂质运载蛋白的最低检出限为20ng/mL。取糖化血红蛋为16%的患者全血样本，分 别稀释至〇 %、1.5 %、3 %、6 %、12 %、16 %的一系列标准浓度，每个标准浓度取50μ 1，加入 200yL0.0 lM pH7.6PBS中，混匀，取75yL加入加样孔，计时3min后检测。仪器可以检测到产生 变化的最小OD值对应浓度为3%，因此糖化血红蛋白的最低检出限为3%。
[0054] 2试纸条的重复性测试
[0055]配制浓度为0即/1111^(0%)、50]^/1111^(6%)、10001^/1111^(16%)的如41^和池41(3混合标 准品溶液，括号里面为HbAlc的浓度。取同一批次的90条试纸条进行检测，每个浓度用30条 试纸条进行测定，测试OD值，浓度为0ng/mL(0% )的CV值为7%、50ng/mL(6% )的CV值为8%、 1000ng/mL( 16% )的CV值为6.5%。根据检测结果可知，该试纸条具有较好的重复性。
[0056] 3试纸条的稳定性测试
[0057]将试纸条保存于装有干燥剂的铝箱袋中，置于37°C恒温干燥箱中，密封保存。分 别在1、2、3、4周后进行测试。配制浓度为0ng/mL(0% )、50ng/mL(6% )、1000ng/mL( 16% )的 NGAL和HbAl c混合标准品溶液，括号里面为HbAl c的浓度，进行测试。在第4周，各浓度标准品 检测OD值没有降低。说明该试纸条可以稳定存放两年。
[0058] 标准曲线的绘制 [0059] I. NGAl标准曲线绘制
[0060] 取0 · 5mg/mL的NGAl标准品用阴性全血分别稀释成Ong/mL、20ng/mL、50ng/mL、 125ng/mL、312ng/mL、782ng/mL、1500ng/mL的一系列标准浓度。每个浓度重复测试3次，取平 均值，以浓度为X，以OD值为Y绘制标准工作曲线，经统计拟合标准工作曲线的表达式列出方 程为 Υ = 3·28638/[ 1 + (Χ/457· 86033)-2·32345]+0· 11853，拟合系数 R2 = 0.99618.结果见附图 3，图3为线性检测标准工作曲线，NGAL测定范围为20ng/mL~1500ng/mL.
[0061 ] 2 .HbAl c标准曲线绘制
[0062] 取HbAI c为16 %的患者抗凝全血标本，配制成HbAI c为1 · 5 %、3 %、6 %、8 %、16 %的 全血标本，每个浓度重复测试3次，记录OD值，以浓度为X，测定OD值为Y绘制标准工作曲线， 经拟合标准工作曲线的表达式列出方程为:Y = 2.81517/[1+(Χ/6.39003)-2·69146]-0.09493， 拟合系数R2 = 0.99342.结果见附图4,图4为线性检测标准工作曲线。HbAlc测定范围为3% ~16% 〇
[0063] 干扰试验
[0064] -、将一新鲜抗凝全血标本分成6份，每份ImL，第1、2份加入葡萄糖分别为30mmol/ 1^、501111]1〇1凡的10(^1^高糖物质，第3、4份加入总胆红素分别为0.21111]1〇1凡、0.41]11]1〇1凡的血清 100yL，第5、6份加入甘油三酯分别为7mmol/L、10mmol/L的血清100μΙ，混匀后测定HbAlc和 NGAL 值。
[0065]二、采集患者全血标本，分别注入含EDTA、肝素、构橼酸钠3种抗凝剂，混匀后测定 HbAl c 和 NGAL 值。
[0066] 三、结果表明，在葡萄糖为30mmol/L以下高糖标本，总胆红素为0.2mmol/L以下的 黄疸标本以及甘油三酯为IOmmo 1/L以下的血脂标本对本方法测定HbAlc和NGAL无明显干 扰。采用Η)ΤΑ、肝素抗凝剂对实验结果也无明显干扰。
[0067]本领域的科研人员从本实用新型公开内容直接导出或联想到的所有变形，均应认 为是本实用新型的保护范围。
【主权项】
1. 一种检测NGAL和糖化血红蛋白的检测试纸，其特征在于：包括样品垫、结合垫、硝酸 纤维素膜、吸水纸、检测线a、检测线b、质控线和PVC底板，所述样品垫、所述结合垫、所述硝 酸纤维素膜及所述吸水纸依次搭接在所述PVC底板上，所述检测线a、检测线b、所述质控线 依次包被于硝酸纤维素膜，所述结合垫包被有NGAUHbAlc单克隆抗体一胶体金标记物层； 所述检测线a包被有NGAL单抗，所述检测线b包被有HbAlc单抗，所述质控线包被有羊抗鼠 IgG0
【文档编号】G01N33/558GK205539004SQ201620061930
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年1月21日
【发明人】雷均平, 田奇, 曾繁兵
【申请人】深圳市博卡生物技术有限公司