超灵敏传感器和分析物的快速检测的制作方法

专利名称：超灵敏传感器和分析物的快速检测的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于实时，快速的检测、鉴定和计数广泛种类的分析物的 系统和方法，所述分析物包括，但不限于，细胞(真核，真细菌，古细菌)， 微生物，细胞器，病毒，蛋白质(重组或天然蛋白质)，核酸，朊病毒，和任何 化学品，代谢物或生物标记物。所述系统和方法，包括激光/光学/电子装 置，分析软件，测定方法和试剂以及高容量的自动控制，特别适合于对在 被污染的食物，临床样品和环境样品中的病原体和非病原体进行检测、鉴 定和计数。可以用本发明检测的其它微生物包括临床病原体，原生动物和 病毒。
背景技术：
目前，可获得一些快速检测方法来用于检测分析物诸如细胞(真核，真 细菌，古细菌)，微生物，细胞器，病毒，蛋白质(重组或天然蛋白质)，核酸, 朊病毒,和任何化学品，代谢物或生物标记物。这些方法的实例包括基于核
酸的测定方法(杂交和聚合酶链式反应(PCR)) (1, 2， 17， 32)，生化测定法(16, 24)，免疫测定法(4，9)，物理化学检测方法(42)，电子检测方法(35)，显微镜 检测方法(38)，基于噬菌体的测定法(14， 20),基于选择性培养基和培养的 检测方法(11,25,31)，和基于光学的测定法(26)。所有这些目前可获得的检测方法由于其固有的局限而不符合理想的检测系统的所有要求。
在基于PCR的测定法，包括实时PCR测定法和核酸杂交测定法中， 结合培养步骤来获得高度敏感性是必要的(32)。如果培养步骤没有包括在 内，会检测到死细胞，这导致不理想的后果。此外，这是一个复杂的多重 测定系统，其具有相对高昂的费用，需要训练有素的人员，并且具有比其 它快速方法更长的检测时间。在样品或富集培养基中的各种PCR抑制剂 的存在可能影响引物的结合和扩增并导致假阳性/阴性(36， 39)。因此，所 述基于PCR的测试可能不适合于食品，临床或环境样品(2， 36)。
基于抗体的测定法，诸如ELISA，凝集试验和探针测试是其它广泛使 用的方法。然而，因为一些测定法的低灵敏度(诸如探针测试和凝集试验)， 这些方法通常需要相对较长的富集时间(9)。尽管ELISA的灵敏度相对较 高，其仍旧需要较长的测试时间，并包括费力的程序。此外，ELISA测定 法很昂贵，因为它们需要昂贵的仪器和高质量的纯化的抗原(4)。
另一种基于抗体的方法是免疫磁性分离(IMS)法，其可以縮短富集时 间并通过使用与磁性颗粒或珠偶联的特异性抗体来选择性地捕获细菌(30, 33)。 IMS被用于捕获和浓缩选择性目标生物，蛋白质,或核酸(14， 15)。和 其它基于抗体的测定法一样，IMS也需要富集过程并且受限于用于小体积 的样品(5,7, 8，29)。 IMS本身是不理想的测定系统，需要进行改进并结合 到更灵敏得多和与使用者友好的系统中。实际上，IMS可以适合于与本发 明 一起使用来产生灵敏的检测系统。
基于生化的测定法，诸如生物发光(ATP检测)，与许多其它方法相比 相对较快。然而，有时这种方法需要较长的富集过程来获得纯培养物(12, 18, 28)。使用生物发光的ATP检测方法因为病原体的非选择性，低灵敏度和 固有的ATP干扰(27)而具有限制。因此，其在给定的环境样品中，不会将 病原体从普遍的非致病性的微生物区系生物中区分出来(28，37)。
用于快速检测生物颗粒的更新技术的其中之一是改进的流式细胞术 (FC)。它是有利的研究工具，可以测量基于个体基础上的细胞的特定性质 并具有分选和计数细胞的能力，因为它们经窄的护套孔单列穿过(10,13,22, 23, 41， 43)。用于检测食物传播的细菌的基于FC的系统以前由Advanced Analytical Technology, Inc (AATI) (Ames， Iowa)在市场上销售，但是未取得成功。然而，当应用于检测基于食物的样品中的细菌细胞时，FC会遇到 问题。例如，当在液体样品的流动中和目标细菌一起存在来自食物颗粒的
碎片或大小大于0.25 mm的凝固的微生物区系时，护套和/或孔的开口会被 封闭。不是所有的细菌都是相同大小，因此固定的护套直径将需要适应不 同的细胞大小，而同时要容许细胞单列流过来进行精确的检测和计数。这 样的基于FC的系统也需要16-36小时的富集阶段来获得高灵敏度。与细 菌接触的真空管、护套和其它的静态部分需要在每次检验样品后彻底的洗 涤和消毒，因此其不是用户友好的。此外，因为这样的仪器的校准是耗时 和复杂的过程，该系统可能不适合于不熟悉FC功能和分析的未经训练的 人员。此外，太多复杂的部分可导致问题解答中的困难和频繁的故障，尤 其是关于真空驱动系统。这种仪器也是相当昂贵的，并且机器本身大且笨 重。费用和空间需求将会使这种仪器仅适合于大的且充分建立的测试实验 室或机构。事实上，AATI已经从食品检验市场撤回了其FC机器。
荧光相关光谱学(FCS)是另一种用于获得生物分子的灵敏和精确检测 的技术。FCS是测量非常小体积样品中的荧光颗粒的波动的技术。所述波 动由荧光颗粒(或荧光标记颗粒)在检测体积中分散而导致。限定的检测 体积位于样品中并且通过这样的区域确定，在所述区域中激发激光通过高 孔径显微目标物聚焦。发射的荧光信号通过光子计数传感器(例如，光电 倍增管(PMT)或电荷耦合器件(CCD))检测，当颗粒在给定的时间阶段中 通过检测体积时，其收集关于荧光强度和颗粒数量的信息。开发于19世 纪70年代，FCS广泛应用在以低浓度存在的荧光发射颗粒的动态研究中 (40)。就在最近，在共焦显微镜装置的辅助下，检测微升范围的样品体积 的单一颗粒成为可能(6, 19)。这导致在生物相关系统中的一些应用，其中 可以研究纳米到微米大小分子的动力学，动态学和浓度。用于检测微生物 和生物分子的多种FCS应用结合核酸扩增方法和免疫学方法己经成功在 受控制的样品中得到证实。例如，已经显示结合在样品的微米范围体积的 细菌，病毒和蛋白质团聚体中的特异性目标分子中的荧光染料的动态学(3， 21, 34)。
尽管FCS技术具有高灵敏度，关于作为未加工的食品，环境或临床 样品的检测或诊断工具的FCS技术的应用存在明显的缺陷。尽管当在检测
8体积中存在均一的颗粒时，获得了最佳的灵敏度，事实上，在真正的天然 存在的测试样品诸如食品，环境和临床样品中获得均一性是困难的。例如， 食品匀浆物是包含盐、蛋白质、脂质、糖、胶粒等的复杂和混浊的流体混 合物。这样的样品的不同种类的组成实质上以许多不同的方式，诸如自身 荧光的干扰，当颗粒的复合物通过检测体积时噪声信号水平的增加，和来 自意欲的目标分子的发射的荧光信号的物理封闭而损害FCS的灵敏度。因
此，由于天然存在的样品的不均一性，FCS技术并不十分适合于微生物和
纳米范围的生物分子的检测。
FCS的另一种局限存在于可以测量的样品的体积中。对这种系统进行 设计从而分析其中以微升(或更少)范围包含几种目标生物或分子的样品。 然而，大多数生物和环境样品包含大体积(毫升范围)的少量目标分子。为 了符合FCS的体积要求，需要集中和耗时的步骤来浓缩目标分子到最初样 品体积的千分之一。尽管通过测量更大样品体积的多个小级分使用FCS 来检测目标颗粒是可能的，对于可能仅以一个或两个被分析的小级分存在 的稀少的目标颗粒而言，这种耗时的任务在统计学上将是不可靠的。当发 现以超过FCS的能力的更大体积存在的小量的目标微生物或分子时，这种 事实阻止FCS提供快速和实时的筛选或检测。
FCS系统由紧密控制的和聚焦的激光束，复杂的共焦装置和精确的激 光发射源组成，所有的它们需要被结合到足够大的仪器中以适合于必需的 部分，还要对其进行设计以容许易于修理或更换零件，并且其足够简洁而 使终端使用者方便操作。这些仪器的开始的生产可以是非常昂贵的并且随 后的必要的或需要的修理也可以是昂贵的。此外，数据分析通常必须由经 专门训练的人员进行以确保精确地解释结果。因为这些因素，与在本公开 内容中所述的本发明相比，目前的FCS仪器不是那么通用和经济。目前可 以获得两种商业FCS仪器。其中之一是Carl Zeiss (德国)的ConfoCor2/LSM 510，另一种是ISS (Champaign, IL)的ALBA。
如上讨论，存在于目前快速检测分析物，特别是来自食品、环境和临 床来源的生物分析物的方法中的主要缺陷包括对于富集过程的需要，低检 测灵敏度，需要专门的经过训练的人员，和对于多重或复杂的步骤的需要。 这些缺陷的任何一种都会导致不精确的测量或将结果的得到从一天延迟到数天。在食物传播的或环境病原体和/或它们的副产物的检测和随后的控 制上延迟可能会导致对于公众的严重的医疗问题和对于食品和诊断工业 的经济损失。最近，恐怖分子的威胁和在我们国家食品基础设施中的意外 的污染已经导致了我们社会中的增加的安全问题。
存在对于发展更灵敏的诊断方法的明显的需要，所述诊断方法可以用 于快速检测和鉴定在食品以及环境和临床样品中的低浓度病原体的存在。 本发明倾向于克服在目前可获得的分析物检测技术中的缺陷。
将参考下面的附图和伴随的说明书来讨论本发明这些和其它方面以 及性质。
附图简述


图1是本发明的示范性仪器的示意图。图1A是所述仪器的侧视图， 图1B是所述仪器的俯视图2A是中空的小杯设计的举例说明；图2B是薄的矩形小杯设计的 举例说明；
图3是用于分析本发明的数字化信号的软件的算法的实例； 图4是具有光源的本发明的另一个实施方案的示意图，所述光源与小 杯和显微镜接物镜一起排列。
图5是被设计用于防止样品混合物在侧面和其它运动中的沉淀；
图6是仅用一个动力装置提供同时的垂直和旋转运动的运动控制装
置；
图7是与薄的矩形小杯和光电倍增管(PMT)—起使用的光图象处理系
统；
图8是与薄的矩形小杯和俘获-电荷耦合器件(CCD)—起使用的光图象 处理系统；
图9显示在磷酸盐缓冲液中的荧光信号计数对比荧光微球体数量的相 关性。每次测量用2分钟。在不同的天数收集所有的数据。按照珠的数量 对荧光信号计数进行绘图。图例显示实验的日期和具有R平方值的趋势 线；
图10显示在磷酸盐缓冲液中通过使用与荧光染料缀合的多克隆抗体来检测鼠伤寒沙门氏菌f5. (KpWmwn'"m)计数的结果。显示荧光信号的平均 计数对比CFU/ml的绘图。与对照相比，Ie4/ml的信号计数和更大的浓度 明显更大(ANOVA, p<0.05)。在104细胞/ml到1(^细胞/ml的浓度范围内 观察在信号计数和CFU/ml之间的高相关性(112=0.9685)。通过MPN(最大 或然数)方法来确定CFUs。以log等级来表示数据。以不同的时间来进行 13组测试(11=13)。显示平均值+- S.E.(标准差)；
图11显示在绞细牛肉中通过使用与荧光染料缀合的多克隆抗体来检 测鼠伤寒沙门氏菌的结果。显示平均信号计数对比CFU/ml的绘图(log等 级)。与对照相比，Ie4/ml的计数和更大的浓度明显不同。在104细胞/ml 到106细胞/1111的浓度范围内观察在信号计数和CFU/ml之间的高相关性 (R2=0.9685)。通过MPN(最大或然数)方法来确定CFUs。以不同的时间来 进行4组测试(11=4)。显示平均值+- S.E.(标准差)；
图12显示通过使用荧光纳米球体在磷酸盐缓冲液中检测鼠伤寒沙门 氏菌的结果。显示低频率信号的振幅对比CFU/ml的绘图。通过PSD函数 来评估低频度信号的振幅。通过MPN法来测定CFU/ml。与对照相比，104 细胞/ml样品的低频度信号的振幅显著更高(ANOVA， p<0.01， t-检验, pO.Ol)。细胞的浓度以log等级表示。以不同的时间进行三组测试(n二3)。 显示平均值+- S.E.(标准差)；
图13显示通过使用荧光珠在磷酸盐缓冲液中检测鼠伤寒沙门氏菌的 结果。显示平均信号计数对比CFU/ml的绘图。通过MPN法来确定CFUs。 以不同的时间进行10组测试(n-10)。显示平均值十-S.E.(标准差)。空心三 角是信号计数的方法。闭合的圈是加权计数的方法；
图14A是在绞细牛肉中检测鼠伤寒沙门氏菌的结果，图14B是通过 使用荧光珠在莴苣中检测鼠伤寒沙门氏菌的结果。显示平均荧光计数对比 CFU/ml的绘图。通过MPN方法来确定CFUs。以不同的时间进行每个样 品的6组测试(11=6)。显示平均值十-S.E.(标准差)；禾口
图15是使用荧光染料在磷酸盐缓冲液中检测牛血清白蛋白(BSA)的 结果。对荧光击打计数对比蛋白质浓度/ml的绘图进行计算。每次测量用2 分钟(120秒)。发明详述
尽管本发明容许许多不同形式的实施方案，在附图中显示和本文中详 细描述的是其具体的实施方案，要理解的是本公开内容将被视为本发明原 理的举例说明而不意欲将本发明限制到举例说明的具体的实施方案。
本发明涉及用于实时，快速的检测、鉴定和计数广泛种类的分析物的 系统和方法，所述分析物包括，但不限于，细胞(真核，真细菌，古细菌)， 微生物，细胞器，病毒，蛋白质(重组或天然蛋白质)，核酸，朊病毒，和任何 化学品，代谢物或生物标记物。微生物可以是致病的或非致病的，并且可 以是食物传播的。所述病原体也可以是临床的病原体。食物传播的病原体 的实例包括，但不限于沙门氏菌属物种(^/附0^//" W.)，李斯特氏菌属物
种(Z^ en'a w.)，弯曲杆菌属物种(Ow^y/okzcfe w.)，葡萄球菌属物种 (&a/ /^/ococcM w.)，弧菌属物种(7/6n'o ^.)，耶尔森氏菌属物禾中0"^'<3 W.)，梭菌属物种(C7o^Wwm w.)，芽孢杆菌属物种CBa"7/M w.)，脂肪酸 芽孢杆菌属物种(J"cyc/o6ac/〃^ ^.)，乳杆菌属物种(丄ac/o&"7/ws ^.)，气 单胞菌属物种G4eramo"o^; .)，志贺氏菌属物禾中(幼/ge〃a ^.)，链球菌属物 禾中(5^印tococcw w)，大肠杆菌(E co/z')，贾第虫属物种(G/ara^a平义内 阿米巴属物禾中(五"tomoeki^p.义隐孢子虫属物禾中(Co^^w; on'力'wm w.义 异尖属物种"mk仏^.义二叶槽绦虫属物种(￡^/^/o6oAn'Mm w.义侏 形吸虫属物种(A^"op/^""H; .义真圆线虫属物种(五MWra"gy/WeH; J， 棘阿米巴属物种(Jca" /2"moe6a w. A和蛔虫属物种(爿"an、 ^; .)和肠 细菌。病毒实例包括，但不限于Norovirus，轮状病毒(Rotavirus),肝炎病 毒，疱疹病毒和HIV病毒，细小病毒和其它病毒病原体。蛋白质可以是毒 素，诸如，但不限于黄曲霉毒素，肠毒素，鱼肉中毒，有壳的水生动物毒 素，鲭亚目鱼中毒，河豚毒，双吡咯烷类生物碱，蘑菇毒素，植物凝集素 和木藜卢毒素类。
本发明的系统和方法特别适合于具有复杂组成的复合样品，诸如但不 限于食品、临床的和环境的样品。这些样品的多种和多样化的组成可能干 扰许多已知检测技术中的检测。
本发明的基本的结构和概念从两种充分表征的系统，即荧光相关光谱 学(FCS)和流式细胞术(FC)中来源和改进。包括激光/光学/电子装置，分析自动控制的系统和方法，特别适合于对被污 染的食品、临床和环境样品中的病原体和非病原体进行检测，鉴定和计数。 可以用本发明检测的其它微生物包括临床的病原体，原生动物和病毒。
在本发明中，将液体样品混悬液中的目标分析物(诸如上面列举的细胞 和微生物)与适合的试剂混合以形成样品混合物。试剂包含适当的荧光配 体，其通过将所述配体与荧光颗粒，染料和荧光珠缀合而形成。所述配体 特异性地结合目标分析物。当暴露于具有适合激发波长的激发光时，荧光 配体发出荧光。如果所述样品混悬液包含目标分析物，目标分析物与荧光 配体结合。与荧光配体结合的目标分析物通过激发体积(也称作被照射的体 积，扫描体积或检测体积)并产生可检测的荧光信号。所述系统对荧光信号 的数量进行计数或测量对应于分析物的数量的荧光信号的量。可以使用各 种信号分析工具来测量荧光信号并使它们与分析物的量相关或鉴定目标 分析物的阳性或阴性存在。所述系统检测，鉴定目标分析物，并作为在样 品的激发体积中的荧光颗粒的数量或荧光的用数字表示的测量的函数对 目标分析物进行计数。
配体可以是任何类型的分子，其可以识别并结合互补的
(complimentary)目标分子。所述配体可以结合细胞的特异性成分或目标 蛋白质的目标表位来形成分子复合物。在优选的实施方案中，配体是多克 隆或单克隆抗体(或其混合物)，其特异性结合于抗原诸如细胞中的细胞成 分或在目标蛋白质上的表位。细胞成分通常是大分子，其可以是蛋白质， 糖，核酸(DNA或RNA)或糖蛋白。细胞成分优选地是在细胞或微生物上 的表面分子。适合于本发明的表面细胞成分的实例是膜结合的蛋白质。细 胞成分还可以是细胞内分子。在另一个实施方案中，所述配体结合于细胞 或微生物中的特异性核酸序列。核酸可以是DNA或RNA。在该实施方案 中，所述配体可以是互补的核酸序列或另一种分子。
任选地，所述目标分析物在与荧光配体试剂混合前可以是分离的，捕 获的和/或浓縮的。在优选的实施方案中，该步骤可以用免疫磁性分离技术 获得，其将在下面详细讨论。所述捕获/分离/浓縮步骤可以与混合步骤同 时进行。
广泛种类的样品适合于本发明。这些样品的实例包括，但不限于(a)
13潜在地包含污染病原体(例如，沙门氏菌属物种，李斯特氏菌属物种，致病 性大肠杆菌，弯曲杆菌属物种，葡萄球菌属物种，弧菌属物种，脂肪族芽
孢杆菌属物种，钩端螺旋体物种(丄印to^/ra w)，内阿米巴属物种，Noro
病毒，肠原性病毒等和毒素蛋白质(肉毒杆菌毒素，肠毒素，黄曲霉毒素等))
的食品；(b)潜在地包含致病性微生物和病毒或有害化学品(诸如除草剂，杀 虫剂，工业污染物)的环境样品(例如，来自河流，湖泊，池塘，下水道，水 库等)；和(c)潜在地包含临床病原体(包括，但不限于致病性细菌和病毒) 的和生物标记物蛋白质的临床样品；和待测试的对于特异性细胞(例如，癌 细胞，巨噬细胞，红血细胞，血小板，淋巴细胞，干细胞等)的临床样品。 临床样品包括，但不限于血液，血浆和其它体液诸如汗、唾液、脑液、脊 髓液，滑液，羊水等。
本发明还可以用于检测具有最少扩增的特异性核酸序列。例如，可以 通过使用磁珠来检测特异性目标序列，所述磁珠具有连接于所述珠表面的 核酸序列的互补序列。这些表面序列具有这样的荧光染料，所述荧光染料 与所述序列相关联，但是其荧光通过将所述序列成环的物理机制或通过其 它酶促方式而被猝灭。在结合于样品中的目标序列后，这些序列将被暴露 并且荧光染料将被释放进行荧光发射。检测寡核苷酸序列的其它各种方法 可以与本发明合并来进行检测和诊断。
仪器设计
本发明公开内容描述了用于快速检测广泛种类的分析物的新的系统 和方法。所述方法可以由被具体地设计用于该系统和方法的仪器进行。所 述仪器的设计容许许多不同形式的实施方案，在附图中显示和本文中详细 描述的是其具体的实施方案，要理解的是本公开内容将被视为本发明原理 的举例说明而不意欲将本发明限制到举例说明的具体的实施方案。
本发明的示范性仪器，也被称作病原体鉴定和检测的实时分析 (R.A.RI.D.)系统，被显示于图1A和B。这种示范性系统IO包括激发光源 12来提供激发光14来激发被置于杯20中的样品混合物17。杯固定器30 固定杯20。样品混合物17包含可以或可以不包含目标分析物的样品混悬 液，并且通过将待测试的液体样品混悬液与以前所述的荧光配体混合而形成。任选地，所述目标分析物在与荧光配体混合前可以是分离的，捕获的 和/或浓縮的。
在优选的实施方案中，杯20是具有圆底的圆柱形杯。杯20可以由适 合于杯的任何已知透明材料制作，其包括，但不限于玻璃或其它硬塑料诸
如聚碳酸酯，聚苯乙烯等。优选地，杯20由聚苯乙烯制成。与玻璃相比， 用聚苯乙烯制作的杯20具有更少的散射光作用。此外，其对于外力，比
玻璃具有更好的抗性，因此确保了操作该仪器的那些人员的安全。此外， 对每个聚苯乙烯杯的灭菌的费用比玻璃或其它材料要便宜。杯20的体积
容量优选地在毫升范围内，并且更优选地从约1到约4ml，并且最优选地 是约4 ml。液体样品混合物17优选地被置于杯20中并将其加帽以确保在 杯20中的内容物不会溢出杯20。
还可以使用其它不同的杯的形状和设计以用于改善的结果和用于其 它目的。例如，在本发明中挖空的形状是有利的(见图2A)。挖空的杯以这 种方式进行设计，其在外杯套24中包含内套22，在杯20的中心具有空 心18，以这种方式减少了在杯中包含的液体的体积。换言之，液体样品 17将被包含在杯20的内套22和外套24之间，其中中央挖空。这种设计 的优势是减少了需要的样品混合物的体积，其接着将通过增加分析物的浓 度来提高测量的灵敏度。在另一个实例中，还可以使用具有薄的矩形形状 的杯(图2B)。将杯设计成具有浅水平深度的矩形形状，其在杯20中形成 薄膜样空间。所述薄膜样特征使小体积的样品(少于IOO微升)均匀地分布。 杯的深度需要进行实验确定从而不仅确保所有的样品在不捕获空气的情 况下可以均匀地分散，还将激发光的焦点置于样品内的正确的位置中。通 过用传感器系统诸如CCD或PMT扫描杯的表面来检测分析物。当CCD 扫描通过杯的平表面时，其在样品中的几个不同位置对检测体积进行快相 图像俘获。将收集的图像处理成荧光信号。PMT还可以通过逐行运动扫描 通过杯的表面，并且荧光信号可以直接从样品中获得。
除了处理高度浓縮的微升等级的样品体积的能力之外，这种设计还在 减少噪声信号上具有优势。在本发明的系统中，由于本发明圆柱形杯的表 面曲率，当激发和发射光进行直线垂直运动时，激发和发射光可以被偏转 或散射。结果，真正的发射光的强度可以被减少，不需要的信号可以被光学传感器检测到。然而，具有平表面的新设计的杯使激发和发射光垂直地 传递到杯的表面平面，使在杯的表面产生的光的偏转或散射最少化。在噪 声信号千扰减少的情况下，对于真正信号的检测灵敏度可以实质上被提 高。此外，通过将扫描路径控制为单向的，这些类型的扫描系统(逐行扫 描或其它线扫描方式)确保能够检测在样品中不同位置的信号。其可以防 止相同的检测体积被重复扫描，这可能是没有应用正确的直线垂直运动速 度时，与圆柱形杯扫描系统相关的固有缺陷。
杯20的形状的其它变化包括，但不限于杯底部的形状(例如，用平 底取代圆底)，直径和其它外部和内部的改进。还可能需要其它的材料改 进来适应在仪器设计和功能上的变化。对于仪器的自动控制和高通量的设
计，可以使用96孔或384孔板变体或用于圆盘传送带系统的多管或杯筒 设计。矩形杯变化的另一个实例是那些杯可以被一起堆放在多个杯固定器 上，并且激光束可以在杯的一侧聚焦。
可以使用任何激发光源来提供激发光14，条件是所述光源可以产生具 有这样的波长的光，所述波长是激发配体的荧光标记所需要的。优选地， 光源12是激光器，并且更优选地是发光二极管(LED)激光器。在不损害 激发荧光颗粒的能力的前提下，与使用卤素气体(例如氩气)的激光装置相 比，LED激光器由于其小型化的尺寸，低发热，易于安装和设置，易于 用其它波长的激光取代，低成本和长寿命而被优选。光源12的实例是具 有7 mW或30 mW功率的单模630 nm波长的激光器。还可以使用激光源 的备选的选择，诸如氩气激光或倍频NdYAG激光器来提高焦点的精确 度。此外，当双光子激发系统应用于增加目标检测的特异性时，可以使用 可调的激光源，诸如可调的钛蓝宝石激光器。
激发光源12可以参照杯20以任何角度放置。在优选的实施方案中， 激光光源12基本上位于垂直于杯20的位置，但不与杯20排列在一起， 如在图1A和1B中所显示的那样。在另一个实施方案中，激发光源12基 本上位于垂直杯20的位置，并与其排列在一起，如在图4A和4B中所显 示的那样。
在其中激发光源12不与杯20排列在一起的实施方案中，将激发光 14通过分色镜(也称作二向色滤色片)35偏转到杯20中的样品混合物17上。如果光源12与杯20排列在一起，不需要分色镜35。第一显微镜物 镜(也称作物镜)25将激发光14聚焦，在杯20的样品混合物17的内部位 置形成焦点。物镜的倍数优选地从约10X到约40X。在优选的实施方案中， 第一显微透镜25将焦点设置在杯20的中心。
在杯20中的样品混合物17的选定体积暴露于激发光14。选定的体积 可以是杯20中样品混合物17的部分体积或杯20中样品混合物17的全部 体积，这可以根据杯20的形状和设计而定。例如，在杯20的设计为薄的 矩形形状时，可以选择样品混合物17的整个体积。在本发明中，重要的 是，选定的体积暴露于激发光14不超过1次，从而避免对分析物的计数 超过1次。
选择用于被暴露于激发光14的样品17的体积可以通过数种方式之一 来获得。例如，通过一个或多个步进电机50移动所述杯从而提供杯20在 一个或多个方向上的移动，这可以是垂直的，水平(侧面)的，旋转的等或 其组合。杯20的运动方向还可以根据杯20的设计而定。在一个实施方案 中，将步进电机置于仪器内部并控制杯固定器30的直线垂直运动。这种 运动对于扫描大体积的样品混合物17并避免重复扫描相同体积是必要的。 这种特征容许当目标分析物在给定样品中以小量存在时对其进行检测。在 其中将矩形杯与作为光学传感器的CCD —起使用的实施方案中，选定的 扭积可以由CCD位置来确定，这决定被CCD覆盖的杯的面积。
这种选定的体积被称作激发体积，扫描体积或被照射的体积，这是样 品混合物17中被暴露于激发光14的体积。
在如在目前的示范性系统中显示的优选的实施方案中，使在杯20中 的选定体积的样品混合物17暴露于激发光14的扫描的方式是通过连接于 杯固定器30的动力装置50给在杯固定器30中固定的杯20提供旋转的和 缓慢的垂直倒转运动。所述动力装置50由动力控制器55控制。两种运动 的速度由一个或两个动力控制器55来控制。在一个优选的实施方案中， 两个动力装置50和两个动力控制器55被安装在仪器内部。 一个动力装置 负责直线运动，另一个动力装置负责旋转运动。直线/旋转运动的速度，扫 描的起始点，扫描的延续时间和扫描距离都可以通过运动控制软件进行调 节。在一个实施方案中，直线速度是约0.8英寸/秒，旋转速度是约300 rpm，扫描距离是约0.28英寸。运动的速度和扫描距离可以基于样品体积和目标
分析物的浓度来调节。动力装置50导致的杯20的运动导致配体-分析物复 合物以随机轨迹通过扫描的或被照射的体积。杯20的运动容许大体积样 品混合物17的扫描并避免重复扫描相同的体积。具体而言，直线和旋转 运动一起容许当目标分析物在给定样品混悬液中以小量存在时，对其的检
杯固定器30和动力50的组件可以连接于金属棒支架(直线传动装 置)58，所述金属棒支架沿着在金属棒支架58上的运动轨迹(未显示)垂直 地移动杯20。主要的控制器可以通过适合的缆诸如RS232缆连接于计算 机的串行端口。
当结合荧光配体的分析物以被照射的体积暴露时，来自配体的荧光团 以对于荧光团类型独特的波长发射能量。如果目标分析物存在于结合样品 混合物17中的荧光配体的样品混悬液中，并且通过分色镜35，如果存在 的话，以通过第二显微镜透镜58来聚焦发射光45的话，那么发射光45 从样品混合物17中发射。发射滤色片70选择性地仅通过在峰波长附近的 特定范围的波长(例如640 nm滤色片)，并且滤过的发射荧光的光46被检 测器60所采样。在其中存在分色镜35的实施方案中，所述分色镜可以充 当发射的荧光45的滤色片并且发射滤色片70是任选的。二向色滤色片35 和发射滤色片57 二者通过仅滤过单或多光子激发的具体波长的光来作用 使来自激发光和散射光的干扰最小化。
滤过的发射荧光46通过被设置在狭缝夹75上的狭缝(未显示)。在
一个实施方案中，两个光学狭缝片的组合直接位于检测器60的前面。一 个是垂直狭缝，另一个是由涂布的黑金属制成的水平狭缝，尽管可以使用 避免光反射和散射的任何材料。在中间存在间隔的情况下，将所述两个片 一起放置来形成正方形的针孔。针孔的重要功能是增加在真实的信号和背 景噪声中的对比。针孔倾向于增加真实的信号与背景噪声的对比水平，尤 其是当真实的信号和背景噪声的亮度彼此没有实质上的不同的时候，这偶 然发生在许多生物样品中。在优选的实施方案中，使用0.005, 0.01,0.015, 0.02,0.025,0.05英寸的垂直和水平狭缝。不同的狭缝大小的应用取决于信 号的对比水平。对比越弱，越推荐使用较小的针孔。对于与荧光染料、荧光概球体和荧光纳米球体缀合的抗体而言，0.025英寸的狭缝的片适合于
正确检测。在另一个实施方案中，狭缝夹75具有两个钮，容许调节狭缝(或
针孔)的垂直和水平位置。
接着，被滤过的发射光46以一定釆样速率(诸如20-100K Hz)由检 测器60采样，产生多信号峰，其可以作为荧光强度对时间的函数F(t)用图 表示。检测器60是光学传感器。在优选的实施方案中，所述检测器60是 光电倍增管(PMT)，诸如来自Hamamatsu, Japan的HC 120 PMT。在另一 个实施方案中，检测器60是雪崩光电二极管(ADP)，其具有比PMT更高 的量子功效。在另一个实施方案中，检测器60是电荷耦合器件(CCD)。光 学传感器的选择不仅取决于其灵敏度，还需要考虑杯20的设计和传感器 与数据获得硬件的相容性。
检测器60通过适合的缆62 (诸如BNC缆)连接于A/D转换器65。 所述A/D转换器65将来自检测器60的类似信号转换为数字信号。将数 字化信号称为原始数据。将A/D转换器65通过适合的缆(未显示)(诸如 100针I/O缆等)连接于被置于主机(未显示)中的数据获得卡(未显示)。
数字化信号可以通过一个或多个不同的信号模式识别模型，诸如但不 限于功率谱密度函数(PSD)，信号峰计数方法，加权信号方法来进行分析。 在信号振幅，脉冲宽度和振幅中的变化通过信号方法进行评价，并确定目 标分析物是否存在于样品中。测试结果可以定量或定性地显示。
作为时间的函数的给出光电流的信号的时间示踪被储存在计算机中 并通过软件进行分析，所述软件是对于本发明的仪器所具体开发的。所述 软件考虑了低通过滤过方案来避免不需要的电子和机械噪声信号。所述软 件还可以使用数种方法来分析信号。低和中等频率的信号可以通过，例如 功率谱密度函数(PSD)来进行分析。所意欲的目标信号大部分属于这种频 率范围。此外，另一种方法确定信号峰的数量。当信号峰的振幅大于背景 噪声的振幅时，将信号峰计算在内。将背景的平均振幅和变化作为阈值振 幅来确定阳性峰。用于所述软件的算法的实例示范性地显示于图3中
与来自背景的那些相比，来自结合荧光配体的目标分析物的信号在脉 冲宽度上更宽，而在振幅上更高。对软件进行设计来通过其脉冲长度和振 幅将真实的信号和噪声区分开。当考虑它们的脉冲宽度和振幅时，真实的信号比背景信号更有影响。在一个优选的实施方案中，进行多重水平的数 据分析来确保实时地以给定的灵敏度精确和一致的检测目标分析物。在一 个优选的实施方案中，通过下列分析方法来分析原始数据，它们是1)通 过使用功率谱密度(PSD)函数进行低频和中频信号的幅值分析，2)对振幅大
于平均背景值的信号峰的数量进行计数，和3)脉冲或振幅加权方法。每种
分析方法的简要描述见下。
在本发明中，原始数据是由结合荧光试剂的目标分析物，未结合的荧 光试剂，光反射或散射光噪声和电子/机械信号干扰和其它产生的荧光信号 的混合物。因此，需要这样的数据分析方法，其能够从所有其它的噪声信
号中区分所需的荧光信号。PSD函数是这样的分析方法的其中之一。PSD 函数将原始的荧光信号解构成特定信号模式的分段信号块。每个信号块由 从原始信号获得的类似的振幅和频率模式组成。那些振幅和频率数据与信 号模式块组合在一起来产生另一种水平的在低，中和高信号频率范围被标 记和指定的信号模式。在最终形式的PSD信号中的低和中频率范围大部分
是真实的信号，其中大部分的噪声信号被排除在外。因此，通过使用PSD 函数，产生自目标分析物的荧光信号可以从噪声信号中区分出来。PSD函 数的这种优点容许当目标生物存在于给定样品中时，在噪声信号干扰最少 的情况下，评价在信号的振幅/频率中的变化。PSD实际上是众所周知的 算法系统。但是，按照特定仪器和试剂系统应用这种PSD可以是定制的， 因此在数据分析程序中具有独特的特征。
消除不需要的噪声信号的另一种方式是使用低通滤色片。所述低通滤 色片阻挡大量的以高频发生的噪声信号，但是通过较低频率的信号进行分 析。存在两种类型的低通滤色片；模拟电路类型和数字电路类型。尽管优 选数字电路类型低通滤色片，两种类型都与本发明的系统相容。
接着，通过对具有比截止振幅更大的振幅的所有的信号峰进行计数来 对滤过的原始数据进行信号计数分析，所述截止振幅被作为阈值。为了获 得正确的阈值，分析包括大量的噪声信号的没有滤过的数据。将未滤过的 数据的平均值和变化(标准偏差)设置为阈值。用于所述分析的变化的程度 取决于根据不同的信号强度所使用的试剂类型。例如，平均值加变化的1.5 倍的阈值用于分析从荧光染料颗粒试剂系统中收集的数据，将平均值加3倍变化用作阈值来分析来自荧光微球体试剂系统的数据。
当目标分析物以非常低的浓度存在于样品中时，从峰计数方法得出的 结果似乎没有明显地与背景具有不同。计数方法不能从需要的或真实的信 号中识别背景信号。更合适的，对振幅大于阈值的任何峰进行计数。结果， 当目标分析物诸如微生物在给定样品中以极小量存在时，计数结果倾向于 是不准确的。在这些情形中，设计加权方法来进一步抑制噪声信号的干扰 并提高检测系统的灵敏度。加权方法使用信号峰的振幅和脉冲宽度。振幅 取决于强度，并且脉冲宽度通过测量信号峰在阈值振幅以上起落的延续的 时间来确定。在这种分析中，比阈值大的个体信号峰与其本身的脉冲宽度 或振幅相乘。接着合计所有的值，这被作为加权值。
该方法基于由目前的荧光试剂产生的信号的独特特征。由于在检测体 积中的不同大小和停留时间，由与本发明的荧光试剂结合的目标分析物产 生的信号与来自未结合的荧光试剂以及其它的噪声的信号相比，具有更长 的延续时间和更大的振幅。考虑到该事实，预期我们需要的或真实的信号 的加权值基本上大于背景信号的加权值。因此，即使当目标分析物在样品 中的含量极少时，需要的信号与背景(来自未结合的荧光试剂)信号的差异 也变得清楚。计数方法与加权分析的组合应用获得了本发明的系统的巨大 的灵敏度。
在显示于图1A和1B和图4A和4B的本发明的优选的实施方案中， 将所有的光学装置排列在金属稳定器78上。在仪器中的所有的组分可以 用不透光的铝容器覆盖以防止散射光的干扰进入光学传感器60。在另一 个实施方案中，狭缝夹75具有两个调节狭缝或针孔的垂直和水平位置的 小钮。所有的内部组件可以用不透光的容器进行覆盖，所述不透光的容器 用不透声的材料隔离以减少机械噪声。
在显示于图4A和4B的另一个实施方案中，构型类似于在图1A和 1B中显示的实施方案的构造，除了第一显微透镜25和激发光源12被再 次定位，从而使第一显微透镜25和光源12 二者目前都位于杯20的约90° 的位置，其中光源12直接位于显微镜透镜25的后面，从而使所有的这些 组件(光源12、第一显微透镜25和杯20)基本上排列在直线上并且来自光 源12的激发光14通过第一显微透镜25被聚焦到置于杯20中的样品混合
21物17中。分色镜35被移去因为不再需要它来将激发光14从光源12偏 转到样品混合物17中。
在另一个实施方案中，样品混合物17的被照射的体积可以通过杯20 的特殊运动被最大化。被照射的体积越大，可以被包括在扫描中的目标分 析物分子的数量越多，导致了目标分析物中更低的检测限制和量化所述分 析物的更高的精确度和一致性。在一个实施方案中，特殊运动包括旋转杯 20，同时让其重复垂直运动。所述运动由两个单独的步进电机驱动，其由 两个单独的可编程的动力控制器所协调。 一个步进电机负责旋转，而另一 个步进电机负责垂直运动。在显示于图5和6中的另一个实施方案中，垂 直和旋转运动都由连接于传动装置90的一个电机50所驱动。杯固定器30 将杯20(未在图6中显示)垂直地固定并位于螺旋杆80的顶部。所述杆80 上刻有啮合有传动装置90的螺旋槽84。当电机50和连接的传动装置前部 90旋转时，传动装置前部90沿着螺旋槽84移动并垂直地驱动杆80，同 时杆80旋转。通过转换传动装置旋转的方向来逆转垂直运动的方向。在 该实施方案中的一个电机的动力系统比两个电机的系统在更低的生产费 用，更小的机械大小，更容易进行部件的装配和替换，更小的机械振动和 噪声，和较不复杂的运动控制软件的设计上具有优势。
当检测时间变得更长时，如果存在于样品混合物17中的话，颗粒的 沉淀可以发生在杯20的底部，这可以削弱本发明系统的检测精确度，一 致性和灵敏度。为了防止在样品混合物17中的颗粒的沉淀，还可以考虑 结合使用如在图5中显示的杯20来进行杯20的侧面位移或运动，所述 杯20装备有回流制动器94从而使在将样品混合物17过滤到杯20中时， 在样品混合物17和回流制动器94之间有极少或没有空气被捕获。空气98 仅出现在与样品混合物17分离的回流制动器94上面。当不具有回流制动 器的杯被置于侧面并进行快速直线运动时，当在杯20中在样品混合物17 的上面有空气被捕获时，可导致液体的涡旋流。在该实施方案中被插入杯 20中的回流制动器94防止了空气在杯20中被捕获在样品混合物17上面 并防止了涡旋流和随后的任何颗粒在样品混合物17中的沉淀。还可以使 用在图5中显示的杯20以不同于侧面运动的其它运动防止沉淀。
本发明的一个优势是在检测细胞，蛋白质和代谢物中以及量化这些生物分析物中的高水平的灵活性。如前面所讨论，杯20可以以薄的矩形体
形状存在(图2B)。这种矩形杯适合于上述生物分析物。使用圆柱形杯以及
旋转和垂直运动可以导致相同目标的重复测量，这是因为其中不存在被标 记的分析物的信息。光检测扫描方法可以通过减少重复的测量增加检测的
精确度。可以获得两种类型的扫描， 一种具有PMT传感器(或类似传感 器系统)，另一种具有电荷耦合器件(CCD)。两种类型的扫描需要使用薄的 正方形或矩形杯取代圆柱形杯。与圆柱形杯相比，薄的矩形杯容纳更少的 体积(与毫升范围相比，微升范围)，并因此通过降低体积来增加液体样品 的表观浓度。此外，薄的矩形杯可以在广泛的区域内传播液体样品，这导 致具有均一浓度的目标分析物的更均一的分布。
当用薄的矩形杯取代圆柱形杯并使用PMT来扫描发射荧光信号时， 还需要替换系统的一些组分。例如，用具有轨道的侧面运动来取代旋转运 动，并使所述杯固定器适应于矩形形状，而不是圆柱形杯。荧光信号的PMT 扫描也必须被改进。如在图7中所显示，在该实施方案中的PMT通过轨 道系统和步进电机驱动的逐行扫描薄的矩形杯的表面(步骤l)来产生来自 PMT的信号流(步骤2)。可以通过这种PMT扫描来获得两个具体的功能。 首先，基于荧光发射数据，PMT可以指示目标信号的存在。软件设计可以 基于以侧面和上下运动的PMT扫描速度来计算目标信号的位置。这也减 少了不止一次对相同的目标进行计数的可能性，因此增加了检测灵敏度和 精确度。第二，来自PMT的信号流数据可以从两维信号阵列被重新构建 成如在图7的步骤3中显示的目标形状的图像。即使PMT在步骤2中产 生电信号流，在给定的目标分析物诸如细胞上的PMT的取样时间可以提 供有价值的信息。例如，与被扫描的杯的运动速度的运算规则计算组合， PMT的电信号流可以在样品的给定区域中产生目标分析物(例如，细胞)的 位置图谱并产生本身在图7的步骤4中显示的目标分析物的外围图像。结 果，数据分析可以提供目标分析物的大小和定位。此外，在目标的类型是 细胞的情形中，电信号的振幅给出荧光的强度并且其传递细胞上的荧光的 分布信息。
如在前面所讨论，CCD光学传感器还可以与在图2B中所显示的薄 的矩形杯设计结合使用。与PMT作为传感器相比，CCD的优势是如果给定区域足够小到照相机能够进行处理的程度，则CCD不需要扫描，因为 其在所述区域采取荧光信号的快照俘获。当来自目标源的光或荧光发射激
活CCD象素时，来自CCD的每个象素的信号产生关于所述分析物的定位
和大小的信息。这样的光发射的不同强度还可以产生目标分析物分布的图
像。CCD的另一个优势是在检测已经以二维存在的信号中，其可以提供目 标分析物的定位，并消除相同目标的重复测量。
所述CCD可以以数种方式之一进行设置和操作。例如，如果样品大 小(矩形表面大小)对于图像的CCD容量足够小，那么其可以位于固定的位 置并且不一定进行扫描以获得需要的数据结果。当使用者需要测量大体积 的样品，或细胞或目标的尺寸太小，因此需要增加分辨率时，扫描方法可 以与CCD —起使用。在该情形中，如在PMT扫描方法的情形中，CCD 照相机扫描矩形杯的表面。在必要的扫描后，个体扫描图像可以被重构以 产生需要的数据。例如，如在图8中所显示，杯表面的区域可以被分成数 个子区(例如，4X4或12X12)，并且CCD可以在每次读出一个子区(步骤 1-4)，并且接着将每个子区的图像合并以构建成被扫描区域的完整图片(步 骤5)。
试剂和方法
已经开发高质量的试剂和精确的方法来获得本发明的检测系统的最 佳灵敏度，特异性和一致性来检测和量化目标分析物，特别是生物分析物 诸如细胞，微生物，蛋白质和核酸或核酸序列，尤其是对于复杂样品诸如 食品，环境和临床样品，其中所述目标分析物在非常复杂的基质中，所述 基质具有非常复杂和高度变化的组合，这在许多情况下干扰检测方法。
通常，本发明的对于这些复杂的生物样品的检测方法由下列关键步骤 组成(1)捕获/分离/浓縮,(2)荧光标记,和(3)目标分析物的检测。
第一个步骤是通过使用适合的试剂和装置处理样品后，从原始样品中 捕获，分离和/或浓縮目标分析物。存在许多方法来捕获，分离和浓缩样品 中的分析物，并且所述方法是本领域那些技术人员已知的。这些方法的实 例包括，但不限于各种色谱技术(例如大小排阻色谱法，吸附色谱法，薄层 色谱法，pH梯度色谱法，盐梯度色谱法，高效液相色谱法，配体-结合色谱法等)，过滤，离心，电泳，等电聚焦，透析，低压升华干燥法，免疫分离 法，免疫磁性分离法等。在优选的实施方案中，将免疫磁性分离技术用在 该步骤中以符合下面标准从不纯的或复杂的生物样品中具体捕获目标分 析物并将分析物浓縮成小体积以易于处理。用试剂A和磁性回收器进行该 步骤。试剂A是包含与适合的配体缀合的磁性颗粒(例如微球体)的溶液， 所述配体能够与待检测的分析物结合以形成配体-磁性颗粒复合物。适合的 配体的实例包括，但不限于在液体介质中的多克隆/单克隆抗体，可溶性受 体或寡核苷酸探针，所述液体介质诸如具有防止微球体团聚的任选的去污 剂和封闭剂。尽管本文使用术语"免疫磁性分离"，其并不意味着所述配 体必须排它性地是免疫分子作为抗体。如早前讨论，所述配体还可以包括 其它适合的配体诸如但不限于可溶性受体和寡核苷酸探针。磁性微球体通 常是包封氧化铁的聚苯乙烯珠并且可具有不同的大小(例如，直径从
O.OlPm至lj 4.8Pm)和不同的表面性质。珠大小和表面性质的选择根据不同 的因子诸如分析物和待缀合在珠上的配体的类型。在本发明的一个实施方 案中，磁性微球体的大小在直径上是约0.86tai。用于将液体缀合到磁性微 球体上的方法是在文献中有充分记载，并且是本领域技术人员众所周知 的。磁性回收器物理地从样品的剩余物中分离配体-磁性颗粒复合物，所述 样品的剩余物可能包含干扰目标分析物的检测的不需要的物质。所述磁力 回收器可以根据具体应用被设计成具有不同磁力强度的各种形状。当样品 与试剂A混合时，在样品中的目标分析物形成分析物-配体-磁性颗粒复合 物。接着，将这种复合物用磁性回收器从样品中分离出来。总而言之，已 经开发或可以开发用于具体分析物的专用试剂和装置以容许进行与常规 方法相比，廉价、容易、较少出错和快速的样品制备。
第二个步骤是用荧光标记来自第一个步骤的分离的目标分析物。该过 程可以例如，通过将获自第一个步骤的分析物-配体-磁性颗粒复合物与包 含荧光颗粒(其可以是无机或有机的荧光团，所述荧光团包括但不限于荧光 染料和荧光珠，球体或其它类型的荧光分子)的试剂B—起温育以形成包 含分析物-配体-磁性颗粒复合物和配体-荧光颗粒复合物的样品混合物来 完成，所述试剂B通过将荧光颗粒与适合的配体诸如但不限于多克隆/单 克隆抗体或核酸探针进行缀合来形成。用于将配体与荧光颗粒缀合在一起的方法是文献中充分记载的并且是本领域那些技术人员公知的。在试剂B 中的这些配体-荧光颗粒复合物根据缀合于荧光颗粒的配体的类型，例如， 通过特异性抗原-抗体反应或核酸杂交，结合于在分析物-配体-磁性颗粒复 合物中的目标分析物从而形成荧光标记的分析物复合物。可以通过将试剂 A和试剂B同时加入在液体介质中的样品中，随后使所述混合物经受磁 力作用来将第一个步骤和第二个步骤合并在一个步骤中。
尽管当荧光颗粒制备自荧光染料时，配体-荧光颗粒复合物的大小保 证了与在所述磁性配体复合物的表面上的目标分析物的最大接近，来自该 复合物的荧光的低量子产率和快速衰减可以导致检测结果中的较差灵敏 度和不一致性。
荧光球体(微米或纳米等级的大小)是用在本发明的试剂B中的优选的
荧光颗粒。使用这种试剂来克服荧光染料颗粒所具有的如上提及的缺陷。 荧光球体具有比荧光染料颗粒更大的量子产率，因为大量的荧光团可以被 包封在聚苯乙烯珠中。因此，当结合与适合配体缀合的荧光微米/纳米球体 的目标分析物以被照射的体积被光源激发时，更强的荧光信号被发射。结 果，当在样品混合物中存在低水平的背景发射光时，信号与噪声比得到提 高，这可以通过系列的洗涤步骤来实现。
还可以将纳米等级大小的量子点(quantum dot)用作在试剂B中的荧 光颗粒。这种纳米颗粒具有比荧光微米/纳米球体更大的量子产率和长期的 光稳定性。此外，它们的斯托克司频移(StokesShift)(在激发和发射光谱最 大值之间的波长差异)离得很远，这对于荧光测量而言是有利的。例如， 量子点纳米球体之一在480 nm波长进行激发并且在640 nm波长发射信 号。量子点的这些性质使激发光对检测产生自目标分析物的真实的放射光 的干扰最小化，同时显著增加真实信号的强度。与纳米等级大小的优势结 合，使用与适合的配体缀合的量子点将实质上增加信号与噪声比，导致本 发明检测系统的提高的灵敏度。
在进行从荧光标记的目标分析物检测发射的荧光信号的第三个主要 步骤之前，在增加信号与噪声比上，洗涤是必要的。洗涤次数和数量必须 根据荧光颗粒的颗粒大小和样品类型通过实验进行确定。如在本发明中公 开的实施例中所显示，洗涤步骤可以是手动的，或可以通过高通量自动控制的系统进行，所述系统使用一致、精确和可靠的液体处理性能来进行正 确洗涤，这将导致本发明的检测系统的一致性和增加的灵敏度。现在，洗 涤的样品混合物已经准备好进行下一个步骤。
第三个和最后一个主要步骤是测量从在第二个步骤中制备的荧光标 记的目标分析物中发射的荧光信号。将洗涤的样品混合物置于被放置在如 上所述的本发明仪器的杯固定器30的杯20中。检测和测量滤过的发射荧
光46。荧光通过一系列如前所述的光学装置并被转化为电信号，所述电信 号通过数据分析软件实时进行分析。在一个实施方案中，根据在杯20中 的样品混合物的体积，将发射的荧光测量约30秒到约2分钟。在上述的 本发明中的仪器的操作简单地将杯20放置在杯固定器30中，随后点击起 始按钮来开始测量。当预先设定的测量时间终止时，动力控制/数据获得软 件自动终止操作，随后显,结果。在一个实施方案中，通过计算机运行软 件，所述计算机是与仪器分离的装置。在一个优选的实施方案中，软件可 以通过结合在所述仪器中的中央处理装置进行操作。在本发明的仪器及其 各种实施方案中的高灵敏度可以在2分钟内，在使用最少的体力劳动的情 况下提供精确的结果。
上述分析物检测方法可以被改进和定制从而适应于检测样品中各种 类型的各种分析物，这将在下面详细进行讨论。
在食品，临床和环境样品中的致病性微生物的检测
(A) IMS/荧光微球体方法
这种方法使用在试剂A中应用配体-磁性微球体的免疫磁性分离(IMS) 和在试剂B中应用荧光微球体的荧光标记的组合。在一个优选的实施方案 中，试剂A包含用在前描述的适合的配体包被的磁性微球体。磁性微球体 的大小的直径可以例如从0.86 um变化到4um。微球体的大小的选择根 据待测试的样品的性质。例如，如果样品具有高粘度和混浊度，对于目标 生物的高回收比率，优选更大的磁性微球体(例如，介于2.8至U4um)。另 一方面，如果样品是粘性较少和更澄清的溶液，对于正确回收，更小的微 球体诸如0.86um是充分的。
可以使用各种方法来制备试剂A和试剂B用于这种具体的或其它的应用。如下详细描述示范性的方法。
链霉抗生物素蛋白包被的微球体包封的磁珠通过链霉抗生物素蛋白/ 生物素结合缀合于生物素化的多克隆抗体。链霉抗生物素蛋白包被的磁性 微球体的等分试样与生物素化的多克隆抗体一起在室温温育约30分钟， 伴随轻柔的颠转旋转运动。将反应溶液置于磁珠回收器中达3分钟，随后
将溶液轻轻倒出并添加洗涤缓冲液(具有吐温-20的0.1 M磷酸缓冲盐溶液 (PBS),pH7.4)。重复该步骤2次。将得到的沉淀重悬并用储存缓冲液进行 储存。在该实例中的储存缓冲液由具有吐温-20， BSA的0.1M的磷酸缓冲 盐溶液(PBS)， pH 7.4和适合浓度的proclin组成。吐温-20和BSA通过 阻断微球体的非特异性结合来帮助防止微球体聚集。Procline是广谱的抗 菌剂并且可以根据试剂需要的保存限期以一定浓度添加。试剂在使用前进 行超声波处理。
试剂B包含用多克隆抗体包被的荧光微球体。该颗粒的大小范围在是 直径从约lum到约4um。所述激发波长(Ex)的范围可以是从约400 nm 到约700 nm，并且发射波长(Em)范围可以从400腿到约700 nm。 Ex/Em 波长范围的选择取决于安装在所用的仪器中的光学发射滤色片70。在该具 体的实例中，选择光学装置来检测640 nm(Em)荧光。样品混合物的条件 也可以在Ex/Em光谱方面影响荧光微球体的选择。例如，对于包含血液的 样品而言，优选具有超过540 nm (Em)的荧光微球体以避免从样品中的内
源荧光颗粒产生的自身荧光的干扰。
通过在微球体的表面上的羧基(-COOH)基团和抗体的胺基团之间的通
过酯中间体的共价结合，将多克隆抗体缀合于荧光微球体。这种反应通过 添加碳二酰亚胺来激活羧基基团进行介导。优选地，使用EDAC (乙基3-(3-二甲基氨基丙基碳二酰亚胺)来激活荧光微球体的表面上的羧基基团。将所 述多克隆抗体与COOH-激活的荧光微球体于室温一起温育达约30分钟， 随后在8000 rpm离心来洗涤任何未结合的抗体。重悬得到的沉淀并用10 mMTris, 0.05%牛血清白蛋白(BSA),和0.05%吐温-20来储存。在使用前将
所述试剂进行超声波处理。
将适当超声处理的试剂A和试剂B同时添加到用于测试的样品的等 分试样中以形成粗制的样品混合物，随后在室温进行约30分钟的温育，伴随轻柔的颠转(end-over)旋转运动。将所述粗制样品混合物置于磁珠回收 器中达约3分钟，随后将溶液轻轻倒出并加入洗涤缓冲液。将该洗涤步骤 重复2次。将沉淀重悬到缓冲液中以形成样品混合物，所述样品混合物可 以接着被转移到杯20中。上述程序也可以在杯20中发生。优选地，在被 置于仪器中的杯固定器30之前，将所述杯20用帽封闭。发射的荧光的测 量在室温进行约30秒。
(B) IMS/荧光染料方法
这种方法使用在试剂A中应用磁性微球体的免疫磁性分离(IMS)和在 试剂B中应用荧光染料的荧光标记的组合。试剂A是就在上述的免疫分 离IMS/荧光微球体方法的方法中所用的相同的试剂。试剂B是缀合于荧 光染料分子而不是荧光微球体的多克隆或单克隆抗体。在该实例中， AlexaFluorTM(Molecular Probes, Eugene, OR)是荧光染料颗粒。AlexaFluor 具有633/647 nm的Ex/Em范围。染料的选择基于我们的仪器的光学装置。 具有不同的Ex/Em范围的不同的AlexaFluoreTM还可以在改进光学滤色片 的情况下使用。
AlexaFluore 就在使用前，通过将二甲亚砜(DMSO)添加到染料中来 进行激活。在搅拌的情况下，将激活的染料缓慢加入溶解在碳酸氢钠缓冲 液中的抗体。将所述混合物在连续搅拌的情况下于室温温育1小时。将缀 合物通过离心和膜过滤的组合从未结合的游离染料中进行分离。将得到的 缀合物在4。C用包含叠氮化钠的PBS缓冲液进行储存。
在室温，将待测试的样品的等分试样与试剂A —起温育约20分钟。 将磁珠回收器应用于样品约3分钟来分离目标分析物，随后用新鲜的缓冲 液洗涤其2次。将所述溶液轻轻倒出，并将所述沉淀用洗涤缓冲液重悬。 加入试剂B并将其在室温温育约30分钟，伴随轻柔的颠转旋转。将在样 品中的磁性荧光标记的配体复合物置于磁珠回收器中约3分钟并将洗涤步 骤重复2次。将得到的沉淀重悬在缓冲液中并将其转移到杯20中。将杯 20置于仪器的杯固定器30中。在室温，在约30秒内进行发射光的测量。
C) IMS/荧光纳米球体方法
29IMS/纳米球体的方法使用三种不同的试剂的组合(试剂A，B,和C)。试 剂A是用在该部分前面描述的两种方法中的相同的试剂。试剂B包含生 物素化的多克隆/单克隆抗体。试剂B通过特异于抗原识别的抗体活性位 点结合于目标微生物的表面。在试剂B中的抗体还通过抗体的生物素化 的Fc部分和链霉抗生物素蛋白包被的纳米球体之间的相互作用结合于荧 光纳米球体。试剂C包含与链霉抗生物素蛋白缀合的荧光纳米球体。纳 米球体的大小范围从约20 nm到约200 nm。Ex/Em范围介于400 nm和700 nm之间。通过在微球体的表面上的羧基(COOH)基团和链霉抗生物素蛋白 的胺基团之间的通过酯中间体的共价结合，将链霉抗生物素蛋白缀合于荧 光纳米球体。这可以通过添加碳二酰亚胺来激活羧基基团，随后用链霉抗 生物素蛋白蛋白质进行温育来进行。未结合的链霉抗生物素蛋白通过透析 来去除。
在一个实施方案中，使用EDAC(乙基3-(3-二甲基氨基丙基碳二酰亚 胺)来激活在荧光纳米球体表面上的羧基基团。在室温，将所述链霉抗生物 素蛋白与激活的纳米球体一起温育约30分钟或更长，随后进行透析来去 除未结合的抗体。透析膜的分子量截留值在约300到约500 kDa的范围内。 所述缀合物用10 mM Tris， 0.05% BSA, 0.05%吐温-20进行储存。还可以 将试剂C应用于与链霉抗生物素蛋白缀合的量子点。量子点具有CdSe-ZnS 核心并且其大小范围在直径上从10nm到100nm。使用与光学装置相容的 具有Ex/Em范围的量子点。缀合方法类似于上述方法。
将待测试的样品的等分试样在室温与试剂A和试剂B —起温育约30 分钟。将磁珠回收器应用于样品约3分钟以分离目标分析物，随后用新鲜 的缓冲液洗涤2次。将溶液轻轻倒出并将沉淀用新鲜缓冲液重悬。加入试 剂C并将其在室温，在约30分钟或更少的时间内温育，伴随轻柔的摇动。 将样品置于磁珠回收器约3分钟并重复洗涤步骤2次。将得到的沉淀重悬 在缓冲液中，并将其转移到杯20中。上述方法也可以发生在杯中。将杯 20置于在仪器中的杯固定器30中。在室温，在约30秒或更多的时间内进 行发射光的测量。
还可以将前述方法和试剂用在食品、临床和环境样品的致病性微生物 的多重检测中。在程序顺序上的改进如下。取代使用靶向一种分析物的单一类型的磁性微球体，将与不同的抗体或核酸探针缀合的磁性微球体的混 合物与待测试的样品一起温育来提取多重目标分析物。需要对在混合物中 的每种试剂的组成进行优化来确保每种目标分析物的高效回收。磁珠回收
(retrieving)和洗涤方法与上述相同。将洗涤的样品与缀合于不同抗体或 核酸探针的前述荧光试剂(荧光染料颗粒或微米或纳米球体)的混合物一起 温育。每种试剂具有独特的发射光谱，其容许鉴定样品中的不同的分析物。 为了从所述样品中分离多重发射荧光的光，需要将多重发射滤色片和多重 光子传感器安装在仪器中。
总的存活细胞计数或特异性生物的检测
开发下列方法来对在食品、临床或环境样品中发现的总的存活生物 (TVO)或特异性生物进行检测和计数。
为了对总的活生物进行检测和计数，在该方法中使用两种不同的试剂 (试剂A和B)。试剂A包含渗透所有的生物并对它们的核酸进行染色的 荧光染料。为此目的的适合的荧光染料的实例根据具体的应用包括，但不 限于SYTO荧光染料(Molecular Probes, Eugene, OR)和相当的染料。试剂B 包含仅标记死生物的核酸的荧光染料。为此目的的适合的荧光染料的实例 包括，但不限于SYTOX荧光染料(Molecular Probes, Eugene, OR)和相当的 染料。将样品的等分试样首先在室温与渗透所有的微生物的膜并对它们的 核酸进行染色的试剂A—起进行温育。在简短的洗涤步骤后，加入试剂B 并将其在室温温育，其特异性地对死生物的核酸进行染色。接着，将染色 的生物转移到杯20中。将杯20置于仪器中的杯固定器30中，优选地将 杯20用在杯20上的盖子进行封闭。或者，反应可以发生在杯20中，其 中转移到杯中的步骤成为不必要的。发射光的测量在室温发生约2分钟。 通过死生物对比活生物的群体分析，可以获得总的活生物的计数。
通过目标核酸序列检测特异性生物
这种检测特异性生物的方法使用包含磁性微球体的一种试剂，所述磁 性微球体与来自16SriDNA， 18SrDNA,或特异性基因的生物-特异性寡核苷 酸缀合。特异性的目标序列可以通过使用磁珠进行检测，所述磁珠具有连接于珠的表面的核酸的互补序列。这些表面序列具有与所述序列相关的荧 光染料，但是通过使序列成环的物理机制或通过其它的酶促方式其荧光被 猝灭。在结合于样品中的目标序列后，这些序列将被暴露，荧光染料将被 释放进行荧光发射。所述方法还可以用在微生物的多重检测中。与在微球 体表面上的特异性寡核苷酸缀合的不同荧光光谱的微球体与待测试的分
析物样品一起进行温育。每种标记的试剂具有不同的Em光谱。通过多重
传感器来检测信号，每种检测一种具体的波长。 蛋白质，生物标记物和代谢物的检测
为了检测蛋白质，生物标记物和代谢物，使用两种试剂(试剂A和B)。 试剂A与在免疫分离(IMS)/荧光微球体方法中所述的试剂A相同。试剂B 与在免疫分离(IMS)/荧光颗粒的方法中所述的试剂B相同。将试剂A和 所述样品混合和温育。在温育约10分钟后，用洗涤缓冲液(PBS-吐温20 (0.01%))洗涤样品一次，接着将其重悬于预加温(37"C)的反应缓冲液。加入 试剂B来制备样品。通过在测试管中上下吸取数次来重悬样品，所述样 品接着在颠转的情况下，在37'C被温育约30分钟。温育后，将每个测试 管施加于磁性回收器约3分钟并用洗涤缓冲液洗涤2次，接着重悬到终体 积1 ml的检测缓冲液。接着，测量其蛋白质浓度。
分析多个样品的高通量的自动控制系统
在本发明中的仪器的上述实施方案的任一个还可以包括高通量的自 动控制系统来处理和分析多个样品。高通量系统的实例包括，但不限于高 通量传动系统和高通量的自动控制多重系统。
在高通量的传动系统中，所述系统包括一个或多个齿条，每个齿条固 定包含样品混合物的多个杯或管。制备样品以与各种试剂反应的所有步 骤，包括液体转移，混合，涡旋，应用磁力，将杯从齿条上移到仪器中的 杯固定器上等，可以作为仪器的部分或作为与所述仪器组合进行工作的独 立的组件充分进行自动控制。
在高通量的多重系统中，将具有不同数量的孔(例如8-384)的深孔板用 作多重平台。对于操作所需要的所有的步骤，包括，例如液体操作，温育，混合，应用磁力等可以作为仪器的部分，或作为与所述仪器结合工作的独 立的组件充分地进行自动控制。
与目前可获得的分析物检测技术，尤其是对生物分析物诸如细胞，微 生物，蛋白质和核酸或核酸序列的检测技术相比，本发明具有许多优势。
实施例
实施例l.荧光微球体的检测
荧光峰的数量被计数并且与荧光微球体的浓度相关。所述微球体的直
径是约2.5 um并且其具有630/640 nmEx/Em光谱。接着，将在终体积为 4 ml的0.1 M PBS中的包含稀释的微球体的杯进行同时的垂直和旋转运 动。杯移动的垂直和旋转的速度分别是0.8英寸/sec和300 rpm。在100 kHz 的取样速率上，在2分钟的过程中获得数据。如在本申请前面所述对原始 数据进行分析和显示结果，其对荧光信号的数量进行计数，所述荧光信号 的脉冲宽度介于0.05-0.2毫秒之间并且脉冲振幅大于平均值背景加标准偏 差的3倍(平均值+3SD)。
将结果显示于图9中。在不同的日子进行5组不同的实验。针对荧光 珠的浓度对荧光信号计数进行绘图。如在图9中所显示，甚至当实验在不 同的时间和天数进行时，来自每个浓度的计数是非常一致的。所述数据不 仅显示在不同实验时间，方法和实验进行者之间的固有差异最小，而且它 们还证实本发明的仪器对荧光信号的检测能力是一致的和可靠的。在不同 实验上的这种一致性和可靠性还通过在荧光计数数量和珠数量之间的高 相关性来显示，如通过0.9626的高W值所指示。这显示本发明的系统能 够检测低到10荧光珠/ml以及从10/ml到10Vml的珠浓度的广泛范围。在 该浓度范围内， 一致性和高相关性容许评价消光系数来对在给定样品中的 珠的数量进行计数。
实施例2在磷酸盐缓冲液中通过使用与荧光染料缀合的多克隆抗体来检 测沙门氏菌
将鼠伤寒沙门氏菌(ATCCW4028)在37°C，在5 ml的LB培养基中培 养过夜。将培养物在PBS缓冲液，pH7.0中进行洗涤，并在8,000 Xg离心10分钟，进行2次。将细胞沉淀物重构成其在PBS中的原始浓度。过
夜培养物接近于5xl(^细胞/ml的标准浓度。用O.l MPBS缓冲液稀释过 夜培养物来制备在总体积为1 ml的PBST(O.l MPBS,0.01%吐温20)中从 0细胞/ml到10e细胞/ml范围的浓度。将每种稀释的培养物的一部分铺在 鼠伤寒沙门氏菌选择性琼脂上并在37'C过夜温育来证实实际上的菌落形 成单位(CFU)。
在每个样品中，加入100ul的(约105珠，直径0.86"111)的用针对沙门
氏菌的多克隆抗体包被的磁性微球体，随后将其置于室温30分钟，伴随 轻柔的摇动。将所述样品置于磁性回收器中约3分钟，将溶液轻轻倒出。 将该步骤重复2次。重悬最终的沉淀物，并将针对沙门氏菌的与Alexa Fluor 633偶联的多克隆抗体(9昭)在总体积为1 ml的PBST中，于室温温育30 分钟。在转移到杯中之前，样品进行如上所述的相同洗涤步骤。在室温， 在300 rpm的旋转速度和0.8英寸/sec的垂直速度上进行测量。在100 kHz 的取样速率上，在30秒过程内获得数据。如本申请前面所述来分析原始 数据。
将来自一种方法的结果描绘于图10中。对于每种样品，将其脉冲振 幅大于平均值背景+ SD的脉冲振幅的荧光信号计算在内。针对CFU/ml， 对每种浓度(从O/ml到106细胞/1111)的荧光信号计数的平均值进行绘图(图 12)。在不同的时间进行13组测定。超过10"细胞/ml的样品的信号计数明 显大于不包含细胞的对照的信号计数(ANOVApO.Ol)。这显示当沙门氏菌 物种以1(/细胞/ml或更大浓度存在于生物样品中时，本发明的系统能够在 数小时内，在不需富集的情况下检测所述沙门氏菌物种。在试剂系统和信 号分析程序得到进一步改善的情况下，灵敏度将增加到102-103细胞/1111浓 度的检测能力。
实施例3在绞细牛肉中，通过使用与荧光染料缀合的多克隆抗体来检测沙 门氏菌
通过使用Alexa Fluor缀合的多克隆抗体，在被穿刺(spiked)的绞细牛 肉中检测鼠伤寒沙门氏菌。将25g的绞细牛肉加入在无菌的细菌分离器袋 中的225 ml的PBST中。在室温，于280 rpm消化2分钟后，用在总体积为1 ml的PBST中的鼠伤寒沙门氏菌穿刺牛肉匀浆物的等分试样。将所述 样品与磁珠(约105珠，直径0.86um)—起在室温温育IO分钟，随后进行 洗涤步骤2次(每次洗涤2分钟)，所述磁珠用针对沙门氏菌物种的多克隆 抗体包被。用PBST重悬得到的沉淀并将其与缀合于AlexaFluor 633的针 对沙门氏菌的9昭多克隆抗体一起在室温温育30分钟。样品在被转移到 杯中之前，进行如上所述的相同的洗涤步骤。
在室温，在300 rpm的杯旋转速度和0.8英寸/sec的垂直速度进行测 量。在lOOkHz的取样速率，在2分钟的过程中获得数据。按照在本申请 中前面所述来分析原始数据。其对这样的荧光信号进行计数，所述荧光信 号的脉冲宽度在0.05-0.2毫秒之间，并且脉冲振幅大于平均值背景+ 3 SD 的脉冲振幅。将每个稀释的样品铺在抗生素选择的琼脂培养基上，于37 t:过夜来证实实际上的CFU/ml。整个过程消耗的时间少于1小时。
针对CFU/ml来对来自每个浓度(0/ml到107细胞/ml)的荧光信号计数 的平均值进行绘图(图11)。在不同的时间进行四组测试。观察到与前面在 磷酸盐缓冲液中检测沙门氏菌所显示的类似的介于荧光信号计数和 CFU/ml之间的相关性。超过104细胞/1111的样品的信号计数明显高于对照 的信号计数。并且，在1(^细胞/ml到1(f细胞/ml的浓度范围内显示介于 计数和CFU/ml之间的高度相关性(R、0.98)。该数据清楚地显示当沙门氏 菌物种以1(^细胞/ml或更大的浓度存在于绞细牛肉中时，我们的系统能够 在1小时内检测所述沙门氏菌物种。
实施例4.通过在磷酸缓冲液中使用荧光纳米球体来检测沙门氏菌
使用纳米等级大小的荧光珠以在磷酸盐缓冲液中检测鼠伤寒沙门氏 菌。使用与前面的实施例2中所述的方法类似的方法，除了使用纳米球体 的试剂。在每个样品中，将针对沙门氏菌的3吗的生物素化的多克隆抗体 与磁珠一起温育。进行与实施例2相同的温育和洗涤步骤。重悬最终的沉 淀，并将针对沙门氏菌的纳米球体缀合的多克隆抗体在室温，在总体积为 lml的PBST中的样品中进行温育。在被转移到杯中之前，将样品进行相 同的洗涤步骤。在室温，在杯的300 rpm的旋转速度和0.8英寸/sec的垂 直速度进行测量。在100 kHz的取样速率上获得数据，进行30秒。通过本发明的软件分析原始数据。
将来自功率谱密度(PSD)函数的结果显示在图12中。在图12中，将
低频信号的振幅针对CFU/ml进行绘图。其显示，在10Vml样品的振幅中 的增加与对照的增加相比，非常显著(ANOVApO.Ol， t-检验pO.01)。此夕卜， 在104细胞/1111样品中没有观察到假阴性(数据未显示)。结果不仅证实我们 的系统能够在一小时内，在不需富集的情况下，检测在生物样品中以104 细胞/ml和更大浓度存在的沙门氏菌物种，而且其还显示我们的系统通过 使用荧光纳米球体提高了检测能力。
实施例5.在纯培养物中通过使用荧光珠检测沙门氏菌物种.
将鼠伤寒沙门氏菌(ATCCW4028)在37°C，在5 ml的LB培养基中培 养过夜。将培养物在PBS缓冲液中进行洗涤，并在8,000 X g离心10分 钟，进行2次。将细胞沉淀物重构成其在PBS中的原始浓度。过夜培养物 接近于5xl(^细胞/ml的浓度。用O.l MPBS缓冲液稀释过夜培养物来制 备在总体积为1 ml的PBST (0.1 M PBS， 0.01%吐温20)中的从0细胞/ml 到1()S细胞/ml的浓度范围。
将在免疫分离(IMS)/荧光微球体方法中所述的每种100u 1的试剂A和 B同时加入等分的细菌样品中。将所述样品混合物在室温温育30分钟， 同时伴随轻柔的摇动以优化抗原-抗体反应。将所述样品管置于磁性回收器 中3分钟，并将溶液轻轻倒出。用lml的PBST重悬得到的沉淀(细菌-试 剂A， B复合物)并将其转移到杯中。
于室温，在300 rpm的旋转速度和0.8英寸/sec的垂直速度进行测量。 在100kHz的取样速率上获得数据，进行2分钟。通过在前面的部分中描 述的信号计数方法和加权信号方法来分析原始数据。图13显示来自信号 计数方法(上面的线)和加权计数方法(底线)的结果。将这样的荧光信号进行 计数方法和加权方法，所述荧光信号具有比平均值背景+3SD的振幅更大 的振幅和在0.05-0.2 ms范围内的脉冲宽度。如在图13中所显示，与对照(没 有细胞)相比，超过1(^细胞/ml的样品的信号计数和加权值明显更高。所 述结果显示本发明能够在一小时内，在不需富集的情况下，检测在磷酸盐 缓冲液中以104细胞/ml和更大浓度存在的沙门氏菌物种，实施例6.在食品样品(绞细牛肉和莴苣)中通过使用荧光珠来检测沙门氏 菌物种
对于在绞细牛肉样品中检测沙门氏菌而言，将io克的绞细牛肉转移 到具有280Pm孔大小的过滤的细菌分离器袋中，随后加入90 ml的磷酸盐 缓冲液。在细菌分离器中，以230rpm将样品匀浆2分钟，随后进行低速 离心以去除大的食物颗粒(500x g, 5分钟)。用UV光照射得到的中层液体 样品达40分钟以去除任何土著沙门氏菌或其它细菌。当接种在LB琼脂(无 抗生素)上时，没有细菌生长，这证实了这种肉汁样品中的无菌状态。尽管 这不一定意味着所有被照射的可能的土著沙门氏菌都不与抗体试剂反应， 如仍旧可以在完整的膜表面上具有表面抗原的那些，但是也没有指示土著 沙门氏菌存在于绞细牛肉样品中。用指定数量的鼠伤寒沙门氏菌穿刺无菌 的肉汁样品。使用与在前面实施例中所述的在纯培养物中使用荧光珠检测 沙门氏菌物种类似的方法(见实施例5)。
分析原始数据，并且显示这样的结果，其对这样的荧光信号的数量进 行计数，所述荧光信号的脉冲宽度介于0.05-0.2 ms之间，并且脉冲振幅大 于平均值背景+3SD的脉冲振幅。在图14A中，观察到与前面在磷酸盐缓 冲液中显示的类似的介于荧光信号计数和CFU/ml之间的相关性。与对照 相比，超过1(^细胞/ml的样品的信号计数明显更高。该数据清楚地显示我 们的系统在1小时内，能够检测绞细牛肉中以104细胞/1111或更大浓度存在 的沙门氏菌物种。
对于在莴苣样品中检测沙门氏菌而言，将10克的莴苣用沙门氏菌进 行穿刺，接着将其转移到具有280 pm孔大小的过滤的细菌分离器袋中， 随后加入50ml PBS。将所述样品以230 rpm在细菌分离器中匀浆2分钟。 用手施加轻柔的力量来挤压细菌分离器的袋以产生液体样品。由于莴苣样 品没有产生与肉样品一样多的食物颗粒，来自细菌分离器袋中的液体没有 通过离心进一步处理。使用与在前面实施例中所述的在纯培养物中使用荧 光珠检测沙门氏菌物种类似的方法(见实施例5)。分析原始数据，并且显 示这样的结果，其对这样的荧光信号的数量进行计数，所述荧光信号的脉 冲宽度介于0.05-0.2 ms之间，并且脉冲振幅大于平均值背景+ 3SD的脉冲
37振幅。如在图14B中显示，可在这种实际的食品样品中获得104细胞/1111 的低灵敏度水平。
实施例7.检测BSA
如本发明的实施例一样进行牛血清白蛋白(BSA， MW 68kD) (Ambion, TX)的检测以证实蛋白质分子的检测能力。将修饰的抗-BSA多克隆抗体 (Bi0meda)磁珠(Bang's Labs, IN)和一定量的使用的BSA (10 ng， 1 ng, 0.1 ng，阴性对照)混合在1.5ml的管中到200 pl的体积。在10分钟温育后， 用500 的PBST将珠的每个管洗涤1次，接着将其用PBST重悬到100 pl。将预加温(37"C)的PBS-T单独(阴性对照)或预加温(37"C)的包含荧光染 料标记的抗-BSA多克隆抗体(9昭)的PBS-T加入到每个管中至最终的测 试体积为200 )il。通过将珠上下吸移数次进行重悬，接着将测试管在37 。C温育30分钟，伴随旋转。温育后，将每个管施加于磁体(magnet)3分钟， 并用500 |il的PBST洗涤两次，接着将其重悬到lml PBST的最终体积。 分析原始数据并且显示这样的结果，其对这样的荧光信号的数量进行计 数，所述荧光信号的脉冲宽度介于0.05-0.2 ms之间，并且脉冲振幅大于平 均值背景+ 3SD的脉冲振幅。如在图15中所显示，在1 ml的最终体积中 102-104pg/ml的范围与荧光计数相关，证实了我们的系统在25分钟的检测 时间内的灵敏度和目前的0.1 ng/ml的检测局限(LOD)。
尽管已经举例说明和描述了具体的实施方案，在不背离本发明的精神 的前提下，可作出许多改进，并且保护的范围仅由后附的权利要求的范围 进行限制。参考文献
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权利要求
1. 一种用于实时，快速检测复合样品中的目标分析物的方法，其包括(a)在液体介质中提供具有第一体积的样品；(b)从所述样品中捕获和分离所述目标分析物；(c)将被捕获的和分离的目标分析物与用荧光标记物标记的配体混合以形成样品混合物，其中所述配体能够结合于所述目标分析物；(d)在一定的扫描时间段内，用激发光扫描一定体积的样品混合物，所述激发光具有能够激发所述荧光标记物从所述样品混合物中发射发射光的波长，其中所述扫描对于任何给定体积的样品混合物都不重复；(e)在所述扫描时间段内将所述发射光的强度记录为信号峰的量；和(f)从记录的信号峰来计算在扫描体积的样品中的目标分析物的数量。
2. 权利要求1的方法，其中扫描一定体积的样品混合物通过给所述样品混 合物同时提供以旋转速度进行的旋转运动和以垂直速度进行的垂直倒转 运动来完成，其中所述旋转速度大于所述垂直速度，并且被扫描的体积与 扫描的时间成比例。
3. 权利要求2的方法，其中扫描一定体积的样品混合物通过给所述样品混 合物提供侧面运动来完成。
4. 权利要求1的方法，其中用光学传感器来记录所述发射光的强度，所述 光学传感器选自由下列各项组成的组光电倍增管(PMT)，雪崩光电二极 管(ADP)和电荷耦合器件(CCD)。
5. 权利要求l的方法，其中所述激发光是由激光器产生的激光束。
6. 权利要求5的方法，其中所述激光器是发光二极管(LED)激光器。
7. 权利要求1的方法，其中所述目标分析物选自由下列各项组成的组细 胞，微生物，细胞器，病毒，蛋白质，核酸，核酸序列，朊病毒，和化学品, 代谢物，或生物标记物。
8. 权利要求l的方法，其中所述目标分析物是微生物并且所述方法在不经 过富集步骤的情况下检测非常少量的微生物。
9. 权利要求1的方法，其中所述目标分析物是核酸序列并且所述方法在不经过扩增步骤的情况下检测非常低水平的序列。
10. 权利要求l的方法，其中所述目标分析物是活细胞或死细胞的DNA 。
11. 权利要求1的方法，其中所述目标分析物是微生物。
12. 权利要求11的方法，其中所述微生物是致病性的。
13. 权利要求1的方法,其中所述目标分析物是食物传播的病原体。
14. 权利要求13的方法，其中所述食物传播的病原体选自由下列各项组成 的组沙门氏菌属物禾中GSa/mo"e//^/7.)，李斯特氏菌属物种(IiWen'a ^ .)， 弯曲杆菌属物种(Ozmpy/oZ^rfe ^.)，葡萄球菌属物种(Stop/^/ococcw x/ .)， 弧菌属物种(l^n'o平)，耶尔森氏菌属物种(l^w'm'a ^ .)，梭菌属物种 (CVo欣Wwm w.)，芽孢杆菌属物种CB"c"/w ，)，脂肪酸芽孢杆菌属物种 04//c_yc/o^c///j w.)，乳杆菌属物种(Z^ctok "7/w s; .)，气单胞菌属物种 04eramo"os s/ .)，志贺氏菌属物种0S7n'ge〃a取)，链球菌属物种OS^印tococcw W)，大肠杆菌(五.co//)，贾第虫属物种(G/aW^ ^J，内阿米巴属物种(五wtomoe^ w.入隐孢子虫属物禾中(CV^ to印wWww 入异尖属物种 "m's^^^.入二叶槽绦虫属物种(Z)^/^〃o6oAWwm^ .义侏形吸虫属物 禾中(A^"o/ /2>^&" j/ .A真圆线虫属物种(J^wsrra"gy/We;y J>，棘阿米巴属 物种"caW/zamoe6a w.义和蛔虫属物种(^scan's 禾Q肠细菌。
15. 权利要求l的方法，其中所述配体选自由下列各项组成的组单克隆 抗体，多克隆抗体，可溶性受体，寡核苷酸探针和核酸序列。
16. 权利要求12的方法，其中所述微生物是临床的病原体。
17. 权利要求7的方法，其中所述病毒选自由下列各项组成的组 Norovims，轮状病毒，肝炎病毒，疱疹病毒和HIV病毒和细小病毒。
18. 权利要求7的方法，其中所述蛋白质是毒素。
19. 权利要求18的方法，其中所述毒素选自由下列各项组成的组黄曲霉 毒素，肠毒素，鱼肉中毒，有壳的水生动物毒素，鲭亚目鱼中毒，河豚毒， 双吡咯烷类生物碱，蘑菇毒素，植物凝集素和木藜芦毒素类。
20. 权利要求7的方法，其中所述代谢物是蛋白质，脂质，糖或肽。
21. 权利要求l的方法，其中所述样品选自由下列各项组成的组食品样 品，临床的样品和环境样品。
22. 权利要求1的方法，其中所述检测选自由下列各项组成的组鉴定、 量化、计数及其组合。
23. 权利要求1的方法，其在捕获和分离所述分析物后还包括通过将所述 样品重构在第二体积中的浓縮步骤，其中所述第二体积少于所述第一体 积。
24. 权利要求1的方法，其中所述分析物的捕获和分离通过免疫磁性分离 法来完成，所述方法包括(a) 用配体涂布磁性颗粒来形成配体-磁性颗粒复合物，其中所述配体能够 结合于所述分析物；(b) 在液体介质中将所述配体-磁性颗粒复合物与所述样品混合来形成在 混悬液中的分析物-配体-磁性颗粒复合物；和(c) 使所述混悬液经受磁力以从液体介质中的样品中分离所述分析物-配 体-磁性颗粒复合物，随后去除具有所述样品的液体介质。
25. 权利要求24的方法，其中所述配体选自由下列各项组成的组单克隆 抗体，多克隆抗体，可溶性受体，寡核苷酸探针和核酸序列。
26. 权利要求25的方法，其中所述磁性颗粒是珠，微球体，或纳米球体。
27. 权利要求1的方法，其中所述步骤(b)和(c)同时进行。
28. 权利要求l的方法，其中所述荧光标记物选自由下列各项组成的组荧 光染料，荧光珠，荧光微球体，荧光纳米球体，和纳米量子点。
29. 权利要求l的方法，还包括在步骤(c)和步骤(d)之间的洗涤步骤。
30. 权利要求l的方法，其中所述目标分析物是细胞，并且所述方法检测 所述样品中的总的活细胞计数。
31. —种用于实时，快速检测液体样品中的目标分析物的系统，所述系统 包括固定所述液体样品的样品固定器；提供激发光束以激发所述样品中的荧光标记物发射发射光的光源； 将所述激发光束聚焦在所述样品中的物镜；容许在一定时间段内使一定体积的样品被暴露于所述激发光束并通 过所述激发光束进行扫描的构件，其中所述暴露和扫描对于任何给定体积 的样品混合物都不重复；在所述时间段内，记录所述发射光的强度的检测器；和 根据在所述时间段内所记载的发射光的强度来计算所述样品中的细 胞或微生物的数量的构件。
32.权利要求31的系统，其中容许在一定时间段内使一定体积的样品被暴 露并通过所述激发光束进行扫描的构件是同时给所述样品以旋转速度提 供旋转运动和以垂直速度提供垂直倒转运动的动力装置，其中所述旋转速 度大于所述垂直速度。
全文摘要
本发明涉及用于对广泛种类的分析物进行实时，快速检测，鉴定和计数的系统和方法，所述分析物包括，但不限于，细胞(真核，真细菌，古细菌)，微生物，细胞器，病毒，蛋白质(重组或天然蛋白质)，核酸，朊病毒，和任何化学品，代谢物或生物标记物。所述系统和方法，包括激光/光学/电子装置，分析软件，测试方法和试剂，和高通量自动控制，特别适合于对被污染的食品，临床样品和环境样品中的病原体和非病原体进行检测，鉴定和计数。可以用本发明检测的其它微生物包括临床病原体，原生动物和病毒。
文档编号G06K9/00GK101432739SQ200580032695
公开日2009年5月13日 申请日期2005年7月29日 优先权日2004年7月29日
发明者朴浩申, 赵益鲁, 金明立 申请人:金实验室公司