专利名称：分析细胞结构及其组分的方法
技术领域：
本发明涉及分析包括病毒形态的细胞结构的方法。
背景技术：
过去已经做了许多努力来分类和分析包括病毒和其他组分的细 K)胞结构。使用可获得的影像技术已经发展了各种影像分析方法来描 述、分段和分类病毒。例如，已经使用了冷冻电镜术，但细胞和病 毒颗粒的结构没有很好地显示。还难以客观地、可重复地且可靠地 描述细胞组分以准确确定细胞组分的成熟期。这部分解释了为什么 在先的分析方法还不是非常有效，需要更有效的方法来分析细胞和 15 病毒颗粒结构。
发明内容
本发明方法提供了上述问题的解决方案。更具体地说，本发明 方法用于分析细胞结构及其组分。细胞结构可以提供为含有多种病 20毒颗粒。可以使用电子显微术拍摄第一病毒颗粒的第一影像和第二 病毒颗粒的第二影像。第一病毒颗粒特征为处于第一成熟期，且第 二病毒颗粒特征为处于第二成熟期。基于来自影像的像素数据或其 他信息，将第一影像和第二影像分别转换为第一和第二灰度曲线。 第一和第二灰度曲线分别保存为第一和第二模板。然后鉴定了第三
25影像中的第三病毒颗粒。第三影像被转换为第三灰度曲线。第三灰 度与第一和第二模板比较，以确定第三病毒颗粒的成熟期。
图1是含有病毒颗粒的细胞核的示意图； 图2A是第一成熟期中病毒颗粒的显微影像； 图2B是图2A中所示病毒颗粒的灰度曲线的示意图； 5 图3A是第二成熟期中病毒颗粒的显微影像；
图3B是图3A中所示病毒颗粒的灰度曲线的示意图4A是第三成熟期中病毒颗粒的显微影像；
图4B是图4A中所示病毒颗粒的灰度曲线的示意10
具体实施例方式
参考图1-4，本发明方法涉及用于分析包括例如病毒颗粒组分的
细胞结构的步骤。病毒颗粒的分析仅用作本发明方法的示例性实 例，且本发明方法不限于病毒颗粒。可以使用该方法分析结构(如 细胞)中的任何适当组分。本发明的重要特征在于不同的病毒颗粒
15 生成独特的曲线图或灰度曲线。而且，不同的病毒颗粒可以处于不
同的成熟期，以使本发明不仅可用于确定病毒颗粒的类型，还可以 确定特定病毒颗粒的成熟期。
通常，可首先通过适当技术(例如透射电子显微术(TEM))拍摄 细胞结构14的影像12。该影像可以包括处于不同成熟期的病毒颗粒 2016。例如，病毒颗粒可以被分类为三个或更多的成熟期，包括图2A 所示的空或非常不成熟的病毒颗粒、图3A所示的过渡病毒颗粒和图 4A所示的更成熟的病毒颗粒。
病毒颗粒16通常是线性变形的，使病毒颗粒看起来略象椭圆形 而非圆形。为能够做出准确的半径密度曲线，希望病毒颗粒为半径 25对称的。因此，当进行本发明的分析时，必须反转所述变形以获得 更好的结果。这可以通过调整病毒颗粒的椭圆形来完成，该病毒颗 粒被假定为大致圆形的。椭圆形的主曲率半径和取向可用以确定变 形并实现反转的变形。然后将旧椭圆形影像中各象素位置转换为新
影像以形成照片，其中病毒颗粒结构是圆形的。所有的病毒颗粒结 构优选受该变形调节。如下所述，半径对称的病毒颗粒结构可转换 为灰度曲线。可通过计算从病毒颗粒结构的中心出发至外围或外壳 的各距离处的平均灰度来描述所述结构。当测量颗粒半径和病毒颗 5粒壁的厚度时，至圆形结构的转换是特别有用的。
更具体地，图2A显示了细胞核中相对未成熟或空病毒颗粒22
的影像，而图2B显示了其在图25中相应的灰度曲线。还可能开发 数学算法来描述病毒颗粒结构，而不依赖灰度曲线。病毒DNA可插 入病毒颗粒22，其可最终发展为具有密集DNA核心的成熟病毒颗 io粒，如图4A所示和以下描述。
病毒颗粒22的半径26为从中心28放射外延至病毒颗粒的外壳 壁30的中央。由于病毒颗粒22实际上不含病毒组分，所以中心位 置几乎为白色，其显示为在图25左侧曲线24的高灰度值。外壳30 较黑暗，使曲线24在图25右侧具有逐渐降低的灰度值，因为外壳 15区域相应于图25的右侧。
图3A显示了并非完全成熟的病毒颗粒34的影像32。病毒颗粒 34含有辅助包装病毒DNA入病毒颗粒的其他病毒蛋白。病毒颗粒壁 可以包括蛋白层，以便可以确定病毒颗粒的尺寸和所述层的厚度。 图3B显示了图38中相应的灰度曲线36。病毒颗粒34的半径48为 20 从中心50延伸至病毒颗粒的外壳52的中央。黑或暗环40显示为曲 线36中的局域最小值4么而白环44显示为曲线36中的局域最大值 45。可通过分析灰度曲线的第二衍生物来确定环的开始和结束以及 夕卜壳壁。
类似地，图4A显示了更成熟的病毒颗粒56的影像54，且图4B 25显示了图60中相应的灰度曲线58c病毒颗粒56的半径62为从中心 64延伸至病毒颗粒56的外壳壁66的中央。白环68显示为曲线58 中的局域最大值70。
本发明方法的重要特征在于其可能生成基于灰度曲线的模板， 以客观地描述病毒颗粒。还可使用数学方法生成模板。例如，模板
可基于处于相同成熟期的许多病毒颗粒特征的平均值。然后，模板 可存入数据库，并以后在分析和鉴定含有病毒颗粒的新影像时进行 检索。当拍摄了数百个影像时，模板可用以计算处于各种成熟期的
病毒颗粒数目。以该方式，可以通过拍摄其他TEM影像来定量细胞 5中的病毒繁殖。
更具体说，过渡病毒颗粒的模板灰度曲线可以被生成并用以鉴 定电子显微照片中的这些颗粒。为产生模板灰度曲线，必须知道病 毒颗粒的中心点以及大致尺寸。病毒颗粒的像素中的大致尺寸(半 径)可通过了解影像的放大和病毒颗粒的实际尺寸来推断，或者其 io 可以标于影像中。目标中心点可手工标示或通过模板配合发现。优 选地，中心点在变形调节后自动选取为椭圆形的中心。如上所述， 灰度曲线可视为曲线，其中曲线中的峰代表明亮的半径区，而谷代 表黑暗的半径区。
当测量应用至细胞质病毒颗粒形式时，某些半径特征(例如病 is毒颗粒外壳)的宽度可给出有关病毒颗粒包皮程度的信息。直接从 影像或曲线测量该厚度的问题是难以测定病毒颗粒开始和结束的位 置。关于曲线的梯度信息可用以解决该问题。第一梯度测量灰度如 何沿曲线改变。如果灰度沿曲线从暗移至明亮则梯度将为正值，如 果灰度从明亮移至黑暗则梯度为负值。当根本无变化或者当曲线具
20有局域最大值或最小值时，梯度将为0。因此，外壳厚度可以描述为
梯度中局部最小值至局部最大值之间像素的数目。这是测量外壳开 始和结束位置的客观方式。为发现这些极点，计算了第二梯度(梯
度曲线的梯度)，因为局部最大值或最小值在梯度曲线中将是O。
以该方式为许多病毒颗粒生成灰度曲线。可通过与标准Gauss 25函数的析积而平滑所生成的灰度曲线。病毒颗粒壁或病毒颗粒外壳 的曲线行为可描述为相对于表示总体病毒颗粒结构的线性行为的 谷。
函数的衍生物达到局部最小值，其中向下曲线是最深的，其表 示病毒颗粒壁的起始。当向上曲线最深时存在局部最大值，其表示病毒颗粒壁的结束或外部。这些局部极值的位置发现为曲线的第二 衍生物的零交叉，极值间距离作为病毒颗粒壁的宽度测量。
如上所述，病毒颗粒的半径计算为病毒颗粒中心与病毒颗粒壁
中央之间的距离。病毒颗粒壁中央可以描述为Gauss平滑曲线中的
5最小值，其是平滑曲线的第一梯度的零交叉。
另一重要特征在于影像可以稍后再次拍摄，且病毒颗粒成熟期 的新数据可与不同成熟期的多数病毒颗粒的早期数据相比较。当病 毒颗粒已经经受活性化学物质(例如适当的药物)时，这对更好理 解所述物质如何影像病毒颗粒中的病毒繁殖是特别有益的。例如， 10 现有物质或新物质可用以测定病毒繁殖的哪个部分或哪个成熟期由 所述物质影响或停止。例如，如果病毒经过六个成熟期且在第四成 熟期没有病毒，则可以得出药物防止病毒成熟跨越第四成熟期的结 论。该方法还可用以确定哪个成熟期是新药应该被设计以影响的成 熟期。
15 还可能鉴定新的不同病毒形态并描述新病毒如何不同于早期鉴 定病毒形态。
本发明方法的另一特征在于可能使用生物技术方法(例如
siRNA)从病毒除去某些蛋白，然后客观地确定蛋白的除去如何影响 病毒形态及其相应的灰度曲线。例如，可设计药物以防止病毒颗粒 20中某些蛋白的生成，并可以研究这些防止对灰度曲线的影响。某些 蛋白的去除可防止病毒从一个成熟期发展至下一个成熟期。该方法 使确定哪个成熟期受特定蛋白去除的影响变为可能。
虽然已经根据优选组合物和实施方案描述了本发明，但应该理 解，可以对其做出某些替换或改变，且不脱离下述权力要求的精祌
25 和范围。
权利要求
1.一种分析细胞核的方法，该方法包括提供含有多种颗粒(16)的细胞(14)；拍摄第一颗粒(22)的第一影像(20)和第二颗粒(34)的第二影像(32)；鉴定所述第一颗粒为处于第一成熟期且所述第二颗粒为处于第二成熟期；转换所述第一影像(20)至第一灰度曲线(24)；转换所述第二影像(32)至第二灰度曲线(36)；保存所述第一灰度曲线(24)为第一模板；保存所述第二灰度曲线(36)为第二模板；鉴定第三影像中的第三颗粒；转换所述第三影像为第三灰度曲线；和比较所述第三灰度与所述第一和第二模板，以确定所述第三颗粒的成熟期。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中该方法进一步包括使所述 第三颗粒经受活性化学物质。
3. 根据权利要求1所述的方法，其中该方法进一步包括在生成 20所述第三影像之后的时间生成第三颗粒的第四影像。
4. 根据权利要求3所述的方法，其中该方法进一步包括确定所 述第三颗粒的成熟期。
5. 根据权利要求4所述的方法，其中该方法进一步包括确定所 述化学物质对基于确定成熟期的所述第三颗粒的影响。25
6.根据权利要求5所述的方法，其中该方法进一步包括将所述第四影像转换为第四灰度曲线以客观地确定所述化学物质对所述第 三颗粒的影响。2
7. 根据权利要求1所述的方法，其中该方法进一步包括转换椭 圆形病毒颗粒至圆形病毒颗粒。
8. 根据权利要求1所述的方法，其中该方法进一步包括通过形成所述灰度曲线(24， 36， 58)的衍生物来确定病毒颗粒壁的开始与5 结束o
9. 根据权利要求1所述的方法，其中该方法进一步包括通过形 成所述灰度曲线(24， 36， 58)的衍生物来确定蛋白层的开始与结束。
10. 根据权利要求1所述的方法，其中该方法进一步包括从所 述病毒颗粒(24)除去蛋白质并生成调整的灰度曲线。
全文摘要
提供了含有多种病毒颗粒(16)的细胞(14)。通过电子显微术拍摄第一病毒颗粒(22)的第一影像(20)和第二病毒颗粒(34)的第二影像(32)。第一病毒颗粒特征为处于第一成熟期，且第二病毒颗粒特征为处于第二成熟期。基于像素数据，将第一影像(20)和第二影像(32)分别转换为第一和第二灰度曲线(24，46)。然后第一和第二灰度曲线(24，36)分别保存为第一和第二模板。鉴定了第三影像中的第三病毒颗粒。将第三影像转换为第三灰度曲线。第三灰度与第一和第二模板比较，以确定第三病毒颗粒的成熟期。
文档编号G06F19/00GK101176098SQ200680012528
公开日2008年5月7日 申请日期2006年2月17日 优先权日2005年4月15日
发明者M·霍曼, 埃达玛丽斯·森托 申请人:智能病毒成像公司