细胞计数方法、用于细胞计数的机器学习模型的构建方法、计算机程序及记录介质与流程

本发明涉及一种分析拍摄细胞块的图像并对构成细胞块的细胞的数量自动计数的技术。

背景技术：

1、在病理医学及细胞培养的技术领域中，常将拍摄由多个细胞构成的细胞块而得到的图像中存在的细胞的个数用作判断细胞或组织的状态、例如发育状况的数值标准。通过目视来对多个细胞进行计数，对于作业者而言负担很大。鉴于此情况，提出了分析图像并对细胞数量自动计数的技术。

2、例如，在专利文献1所记载的技术中，根据用对细胞核染色的染色方法对试样染色并用显微镜拍摄而得到的图像的明暗来掌握观察对象的形状。并且，在检测到小核的情况下，根据距主核的距离进行对应关联，在此基础上对核进行计数，从而求出细胞数。另外，例如在专利文献2所记载的技术中，为了区分相互接近且边界不清楚的细胞，能够使用附有荧光标签的试样的图像。具体而言，根据包含关注像素的区域内的多个像素的像素值来计算关注像素的得分，根据该得分求出各个细胞的位置或个数。

3、现有技术文件

4、专利文献1：日本特开2001-269195号公报

5、专利文献2：国际公开第2005/057496号

技术实现思路

1、发明要解决的问题

2、若作为观察对象的细胞块具有立体结构，且多个细胞在图像的纵深方向上重叠，则难以如上述现有技术那样利用基于图像的亮度值的方法来对各个细胞分别计数。例如，在受精卵(胚胎)的观察中，大量细胞堆积呈球形，且每个细胞都几近透明。因此，根据通过接收透射光或反射光拍摄到的单一的显微镜图像的亮度值来区分这些细胞，并分别进行计数是非常困难的。

3、鉴于此情况，需要建立一种能够更高精度地求出构成具有三维结构的细胞块的细胞的数量的技术。另外，在上述现有技术中，对细胞染色或对细胞赋予荧光标识，不能应用于活细胞的计数。因此，更优选使用不依赖于这种侵入式的拍摄方法的图像也能够进行计数。

4、用于解决问题的手段

5、本发明是鉴于上述课题而完成的，其目的在于，提供一种能够根据拍摄细胞块而得到的图像对细胞数量进行自动且高精度地计数的技术。

6、本发明一种方式是一种细胞计数方法，对构成细胞块的细胞的个数进行计数，为了达到上述目的，包括：图像堆栈获取工序，获取图像堆栈，所述图像堆栈包括以互不相同的焦深对所述细胞块进行明视场拍摄而得到的多个图像；热图制作工序，使用机器学习模型，制作与所述多个图像的每一个对应的多个热图；峰值检测工序，从各个所述热图中检测出峰值；对应关联工序，将检测出的所述峰值中的、属于互不相同的所述热图且在沿图平面的方向上的距离和所述焦深方向上的距离分别小于规定值的峰值彼此相互对应关联；以及计数工序，将已对应关联的多个所述峰值视作一个峰值来计数所述峰值的数量。此处，所述机器学习模型通过以监督图像和正确图像的组为监督数据的机器学习构建而成，所述监督图像是细胞的明视场图像，所述正确图像是赋予了权重的热图，所述权重在该监督图像内聚焦的细胞的轮廓的内侧大于其外侧，且越靠近细胞中心部越大。

7、在如此构成的发明中，根据通过以互不相同的焦深对细胞块进行多次明视场拍摄而得到的所谓多聚焦图像来对细胞数量进行计数。在对由接近透明的细胞构成的细胞块进行明视野拍摄时，有望通过变换焦深并进行拍摄，不仅能够拍摄到呈现在细胞块表面的细胞，还能够对其背后的细胞以聚焦于多个图像中的任意一个的状态进行拍摄。因此，如果从各图像中提取分别聚焦的细胞，则认为它们涵盖了构成细胞块的全部细胞。

8、但是，根据拍摄光学系统的景深、拍摄时的焦深的变化间距、细胞的大小等关系，存在一个细胞在多个图像中聚焦的可能性。因此，仅仅对从各图像中检测出的细胞进行计数中，重复计数的情况得不到正确的计数结果。本发明通过下述结构来解决该问题。

9、第一，通过从机器学习模型输出的热图中检测峰值的方法来确定各图像中的细胞。在热图中，赋予离细胞中心越近越大的权重，峰值位置与细胞的中心位置对应。第二，对于从各图像检测出的峰值中相互距离较近的峰值，将它们视作一个峰值来计数峰值的数量。

10、若仅确定各图像中细胞所占的区域，则在从焦深不同的多个图像检测出的细胞区域相互重叠的情况下，难以判断它们对应于同一细胞还是对应于不同的细胞。另一方面，为了求出细胞的数量，正确确定图像中细胞所占的区域并非必须条件。相反，确定细胞中心位置的方法是合适的。这是因为，根据检测出的细胞中心间的距离，能够判断它们是否来自同一细胞。

11、具体而言，如果在某种程度上了解了细胞的大小，则能够推定能够取得它们的中心的距离的下限。因此，将在与由多个图像检测出的细胞中心对应的峰值中的、位于比这样推定的下限更近的位置上的峰值视作来自同一细胞的峰值。另一方面，可认为孤立的峰值分别对应一个细胞。如此，只要将位于比一定距离更近的位置上的多个峰值整体视作一个峰值，就能够通过峰值数来表示细胞的数量。由此，避免了重复计数同一细胞的情况。

12、另外，各个细胞的检测通过下述方法进行，即，以包括聚焦的细胞的图像为监督图像来构建机器学习模型，并利用该机器学习模型来推定细胞的中心位置。例如，如果将未使用染色细胞核等侵入式方法的细胞的图像用作监督图像来执行机器学习，则对于作为计数对象的细胞块，也能够使用非侵入式拍摄的图像。

13、另外，本发明另一方式是一种用于细胞计数的机器学习模型的构建方法，包括：监督图像获取工序，获取多个细胞块的明视场图像即监督图像；正确图像制作工序，针对所述监督图像的每一个，制作作为赋予了权重的模拟的热图的正确图像，所述权重在该监督图像内聚焦的细胞的轮廓的内侧大于其外侧，且越靠近细胞中心越大；机器学习模型构建工序，以所述监督图像和所述正确图像的组为监督数据进行机器学习，构建机器学习模型。在如此构成的发明中，为了执行上述细胞计数方法，能够有效地构建适合的机器学习模型。

14、另外，本发明的另一方式是用于使计算机执行上述细胞计数方法或用于细胞计数的机器学习模型的构建方法的各工序的计算机程序。另外，本发明的另一方式是非临时性地存储了上述计算机程序的计算机可读取的记录介质。在如此构成的发明中，作为本发明的执行主体，例如，能够使用现有的计算机装置。

15、发明的效果

16、如上所述，根据本发明，能够根据多聚焦图像堆栈的各图像，制作赋予了越靠近细胞中心越大的权重的热图。将该峰值作为细胞的中心处理，且将峰值间的距离小于规定值的多个峰值视作来自同一细胞的峰值来进行计数。因此，即使是具有三维结构的细胞块，也能够自动且高精度地计数构成其的细胞的数量。

17、参考附图并阅读下面的详细说明，本发明的上述和其他目的以及新特征将会更加完整和清楚。但附图仅用于解说，并不限定本发明的范围。

技术特征：

1.一种细胞计数方法，对构成细胞块的细胞的个数进行计数，包括：

2.根据权利要求1所述的细胞计数方法，其中，

3.根据权利要求2所述的细胞计数方法，其中，

4.根据权利要求1至3中任一项所述的细胞计数方法，其中，

5.一种计算机程序，用于使计算机执行权利要求1至4中任一项所述的细胞计数方法的各个工序。

6.一种用于细胞计数的机器学习模型的构建方法，包括：

7.根据权利要求6所述的用于细胞计数的机器学习模型的构建方法，其中，

8.根据权利要求6或7所述的用于细胞计数的机器学习模型的构建方法，其中，

9.根据权利要求6至8中任一项所述的用于细胞计数的机器学习模型的构建方法，其中，

10.根据权利要求6至9中任一项所述的用于细胞计数的机器学习模型的构建方法，其中，

11.一种计算机程序，用于使计算机执行权利要求6至10中任一项所述的用于细胞计数的机器学习模型的构建方法的各工序。

12.一种计算机可读取的记录介质，非临时性记录权利要求5或11所述的计算机程序。

技术总结
本发明的细胞计数方法包括：图像堆栈获取工序，获取图像堆栈，图像堆栈包括以互不相同的焦深对细胞块进行明视场拍摄而得到的多个图像；热图制作工序，使用机器学习模型，制作与多个图像的每一个对应的多个热图；峰值检测工序，从各个热图中检测出峰值；对应关联工序，将检测出的峰值中的、属于互不相同的热图且在沿图平面的方向上的距离和焦深方向上的距离的每一个均小于规定值的各个峰值相互对应关联；计数工序，将已对应关联的多个峰值视作一个峰值来计数峰值的数量。机器学习模型通过以监督图像和正确图像为监督数据的机器学习构建而成，所述监督图像是细胞的明视场图像，所述正确图像是赋予了越靠近细胞中心部越大的权重的热图。

技术研发人员：时末尚悟,冈本悟史
受保护的技术使用者：株式会社斯库林集团
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16