一种新型工程化高密度血管的肝组织支架构建方法

本发明涉及再生医学和组织工程，尤其涉及一种新型工程化高密度血管的肝组织支架构建方法。

背景技术：

1、我国每年约有150万患者等待器官移植，但其中只有不到1％能够找到合适的供体。体外构建类人体组织和器官的活性体被认为是缓解器官供体长期短缺问题的有效途径，同时也能为药物筛选和疾病机理研究提供更为精准的体外模型。

2、组织工程学的主要目的是通过体外构建高度仿生的三维人造活性结构体来修复或替换患者的组织和器官。伴随着生物制造中3d打印技术的进步和创新，国内外研究者已实现了从功能性支架和组织到具有多层级结构、多成分、多生物功能复杂器官的体外构建，大大提升了人造结构体在形态、机械性能和生化功能等方面的仿生度。

3、工程化组织中高密度血管网络的构建是各类组织和器官生物制造中的重要共性基础问题。但是人造组织支架在体外培养过程中会因营养物质的递送和向内渗透不足等问题会造成细胞的活性降低或凋亡，进而影响内皮细胞的成血管功能和组织细胞的生物功能。因此，血管化问题被认为是组织工程和生物制造研究中亟待解决的重要共性基础问题之一，也是阻碍组织工程临床应用的首要挑战。实现工程化组织的高密度血管化，尤其是微血管网络的构建，对推动功能性仿生人造组织和器官的体外构建及其临床应用作用重大。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种新型工程化高密度血管的肝组织支架构建方法，构建了适合细胞生长的三维微环境，支架内更优的氧气扩散、更快营养物质摄取和更大的比表面积，有助于支架内血管的快速生成，实现组织支架的功能构建，为组织支架快速的血管化和功能重构提供了新的技术路径。

2、为实现上述目的，本发明提供了一种新型工程化高密度血管的肝组织支架构建方法，包括以下步骤：

3、s1、通过调整gyroid的几何参数相对密度和晶胞单元，构建gyroid结构的三维支架模型，利用多物理场模型进行模拟，筛选性能最优的gyroid支架；

4、s2、利用comsol multiphysics5.4对步骤s1构建的gyroid支架模型进行求解，并且利用时间步迭代计算模型载细胞支架氧气扩散、氧气消耗和细胞增殖过程随时间的变化；

5、s3、通过与lattice结构的支架进行对照，证明gyroid支架对细胞生长和组织功能建立的潜力；

6、s4、对gyroid支架进行精密制备；

7、s5、对gyroid支架效果进行评估。

8、优选的，在步骤s1中，多物理场模型中氧气扩散表现为氧气的浓度在时间和空间上的变化，将整个载细胞支架的培养空间分为两个区域，a区域表示含氧气的培养液的均匀介质区，b表示载细胞支架的多孔介质区；在区域a和b内发生氧气的扩散传质，在细胞存在的区域b内发生氧气消耗，细胞增殖引起的细胞密度变化在区域b发生；

9、s11、基于菲克第二定律描述多孔支架中氧气浓度的变化，描述氧气在培养基区域a中的扩散，如下所示：

10、

11、其中，ca为培养基区域a中的氧气浓度，da为培养基区域a中的氧气扩散系数；为矢量微分算子，用于描述变量的大小和方法，代表物质的梯度；

12、s12、氧气消耗发生在载细胞的多孔支架b区域，利用米氏动力学方程描述支架内细胞消耗氧气的过程，如下所示：

13、

14、其中，r0为氧气消耗速率；ρc代表支架中单位体积的细胞密度；cb代表载细胞多孔支架区域的氧气浓度；v0max代表支架中细胞最大氧气消耗速率；km代表michaelis-menten常数，对应与氧气消耗速率降至最大值一半的氧气浓度；

15、s13、使用michaelis-menten动力学描述细胞增长速率，如下所示：

16、

17、其中，kmax为最大增殖速率；kn为michaelis-menten常数，即增殖速率为最大增殖速率一半时氧气的浓度；cb(t)为多孔支架中的氧气浓度。

18、优选的，在步骤s2中，对载细胞支架模型进行求解时，模型的边界条件为无通量边界条件。

19、优选的，在步骤s4中，gyroid支架制备包括：水凝胶前驱体制备和生物墨水制备；

20、s41、水凝胶前驱体制备；

21、水凝胶前驱体基材由10wt％gelma水凝胶构成，其中加入17mm的lap光引发和1mm的cur-na光散射抑制剂，将材料依次加入到pbs缓冲液中，直至完全溶解，调整溶液的ph值至7.4；

22、s42、生物墨水制备；

23、生物墨水包括：hepg2细胞，huvec细胞，hepa1-6细胞，c166细胞；其中，加入0.1wt％的黄胶原，防止打印过程中的细胞沉降。

24、因此，本发明采用上述一种新型工程化高密度血管的肝组织支架构建方法，构建了更适合细胞生长的三维微环境，支架内更优的氧气扩散、更快营养物质摄取和更大的比表面积，能有助于支架内血管的快速生成，实现组织支架的功能构建，显著提高了氧气扩散效率，支架内更少的缺氧细胞减低了缺氧标志物hif1-α的表达；通过细胞增殖实验，展示了更优的氧气扩散的生物支架可以显著提高支架内缺氧耐受较差的huvec细胞存活率；通过血管化实验验证了gyroid支架促进支架能快速、高效的支撑内皮细胞的血管网络形成；gyroid支架血管的快速形成，有效的增强的肝功能的特异性基因和功能性蛋白的表达；将预血管化支架植入动物皮下，gyroid支架支持有效的血管形成进而促进肿瘤组织高效形成，同时gyroid支架中成熟和功能化的血管比例占比更大。

技术特征：

1.一种新型工程化高密度血管的肝组织支架构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种新型工程化高密度血管的肝组织支架构建方法，其特征在于：在步骤s1中，多物理场模型中氧气扩散表现为氧气的浓度在时间和空间上的变化，将整个载细胞支架的培养空间分为两个区域，a区域表示含氧气的培养液的均匀介质区，b表示载细胞支架的多孔介质区；在区域a和b内发生氧气的扩散传质，在细胞存在的区域b内发生氧气消耗，细胞增殖引起的细胞密度变化在区域b发生；

3.根据权利要求1所述的一种新型工程化高密度血管的肝组织支架构建方法，其特征在于：在步骤s2中，对载细胞支架模型进行求解时，模型的边界条件为无通量边界条件。

4.根据权利要求1所述的一种新型工程化高密度血管的肝组织支架构建方法，其特征在于，在步骤s4中，gyroid支架制备包括：水凝胶前驱体制备和生物墨水制备；

技术总结
本发明公开了一种新型工程化高密度血管的肝组织支架构建方法，属于再生医学和组织工程技术领域。该方法包括以下步骤：构建Gyroid结构的三维支架模型并筛选出性能最优的Gyroid支架；对所构建的Gyroid支架模型进行求解；证明Gyroid支架对细胞生长和组织功能建立的潜力；对Gyroid支架进行精密制备；对Gyroid支架效果进行评估。本发明采用上述的一种新型工程化高密度血管的肝组织支架构建方法，构建了适合细胞生长的三维微环境，支架内更优的氧气扩散、更快营养物质摄取和更大的比表面积，有助于支架内血管的快速生成，实现组织支架的功能构建，为组织支架快速的血管化和功能重构提供了新的技术路径。

技术研发人员：王文鑫,贺宁,袁丹丹,韩晓筱,王维,容鹏飞,李娜
受保护的技术使用者：湖南大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/12