专利名称：端酯基硅胶高效疏水色谱填料及合成方法
技术领域：
本发明涉及一类硅胶基质有机化合物及其合成方法，特别是一类端酯基高效疏水作用色谱的填料及其合成方法。
疏水相互作用色谱(Hydrophobic Interaction Chromatography，简称疏水色谱)是七十年代发展起来的分离纯化蛋白质的一种液相色谱方法。它具有不用有毒和昂贵的有机溶剂作流动相、纯化后的蛋白质活性损失小和分离选择性能好等优点，从而得到了迅速的发展。现在已成为生物工程产品后处理、蛋白质药物分离纯化中的一个重要手段。
早期的疏水色谱填料是利用琼脂糖、葡聚糖等为基质在其表面键合上一个有机基团制得的。后来又有将苯基和丁基等烃基键合到亲水性聚合物基质上以得到半刚性的疏水色谱填料。后者分离性能较好，但是机械性能差，不耐高压，不能用于高效液相色谱，因此分离速度慢。目前最好的疏水色谱柱是由日本的TOYO SOTA公司生产的，在亲水聚合物基质上键合苯基得到的商品名为TSK pheny1-5pw型疏水色谱填料。但是，使用该柱子每次进样后都要用NaOH溶液再生，过程复杂。而且，因疏水性太强，某些蛋白不出峰，耐压性能也较差。
八十年代中期出现了以硅胶为基质的高效疏水色谱填料(High perform-ance Hydrophobic Interaction Chromatography，HPHIC简称高效疏水色谱)一般是应用硅胶表面的硅羟基的反应活性键合上合适的配基而制得。其中报道最多、效果较好的是聚乙二醇类配基的疏水色谱填料，其配基是-(CH2CH2O)n-R(R＝H、甲基、乙基、苯基)。这类填料机械性能好、耐高压、可用于高效液相色谱，但是耐高浓度盐酸胍溶液的性能差，分离度一般。因此在生物工程产品的后处理中受到限制。
本发明是在采用多种合成方法合成的多种不同结构的硅胶基质化合物的基础上，从中筛选出了可用作高效疏水色谱填料的化合物品种和合成方法，以满足生物工程产品的后处理和科研工作的需要。这类化合物，用作液相色谱填料时，耐高压、耐盐酸胍、分离性能好、易再生，蛋白质活性回收率高、疏水性适当，适用于生物工程产品的后处理，性能优于现有的产品。
本发明的目的是采用一种新的合成方法和工艺，合成了一类新型硅胶基质的化合物。这类化合物可以用于高效液相色谱中，作为分离蛋白质的高效疏水色谱填料。
本发明的目的是这样实现的本发明是在硅胶基质上，采用多步键合的方法得到一类端基为酯基的硅胶基质化合物。其结构为硅胶≡
。该类物质是性能良好的高效疏水色谱填料。
本发明的合成方法是，大孔硅胶先经酸洗处理，然后与γ-缩水甘油醚基丙基-三甲氧基硅烷反应，制得含环氧基的硅胶。环氧基硅胶再与一个两头端基分别为羟基和酯基的化合物反应，以得到带端酯基的产物;也可以让含环氧基硅胶先与一个二元醇反应，然后再让此产物进一步与酸酐或酰氯反应，得到本发明的端酯基硅胶基质高效疏水色谱填料。
本发明的具体合成步骤如下1、硅胶的酸洗处理及活化向大孔硅胶(孔径30nm～100nm)中加入适量的硝酸或盐酸溶液，在超声振荡器中超声，同时抽真空1～5分钟，以尽可能地除去硅胶细孔内存留的气体，尽可能使吸附在硅胶表面上的气体被反应的溶液置换。回流2～5小时，以最大限度地除去残留在硅胶表面的各种杂质并使硅醚键破坏变成硅醇基，用玻璃砂芯漏斗过滤，用蒸馏水洗至PH值不变，在130～200℃下烘干，将活性好的硅胶放在干燥器内保存。
2、环氧基硅胶的制备向酸洗处理过的活性硅胶中加入适量的3-15%的γ-缩水甘油醚基丙基-三甲氧基硅烷水溶液，在超声和抽气处理后，调PH值为4～7，在80～110℃的热浴中加热搅拌0.5～1小时。然后用砂芯漏斗过滤，用水洗，再用甲醇洗，放在真空干燥器中干燥48小时。
该反应为
3、端酯基硅胶基质高效疏水色谱填料的制备(Ⅰ)第二步制得的环氧基硅胶与羧酸的二元醇酯(
)在三氟化硼催化下，在无活泼氢溶剂的溶液中反应。反应物先作超声抽真空处理，在80～120℃油浴中加热搅拌0.5～1小时，反应完成后加入适量2～6mol/L NaOH溶液破坏三氟化硼，然后过滤，用水、甲醇洗涤，抽干。所得产物是本发明的一类硅胶基质的酯基化合物，即酯基高效疏水色谱填料。
其中R＝烷基，苯基，
;R1＝苯基，烷基，取代苯基R和R1两个基团的结构决定了填料的疏水性，对色谱的选择性和分离度也起着至关重要的作用。
4、端酯基硅胶基质高效疏水色谱填料的制备(Ⅱ)硅胶基质酯基化合物还可以用另一种方法合成。
第二步制得的环氧基硅胶先与α、ω二元醇或聚二元醇反应，得到一个含端羟基的硅胶基质化合物，此化合物在三级胺等无活泼氢的碱性有机物催化下，与酸酐或酰氯反应，得到端酯基的硅胶基质化合物，即本发明的酯基高效疏水色谱填料。
(A)环氧基硅胶与二元醇的反应。
环氧基硅胶与二元醇或聚二元醇的反应条件及后处理皆同第3步。
(m＝1，2，3，n＝1～40)(B)酯基高效疏水色谱填料的制备上述环氧基硅胶与二元醇或聚二元醇的反应产物，在三级胺或其他无活泼氢的碱性有机物催化下，与酸酐或酰氯反应得到硅胶基质酯基化合物，即酯基高效疏水色谱填料。酸酐和酰氯作反应试剂时不同之处是，酸酐要加热到60～120℃，酰氯不必加热。三级胺或其他无活泼氢的碱性有机物可以接受反应放出的质子，促进反应。反应可以用苯等惰性试剂作溶剂，有些三级胺本身也可兼作溶剂。反应混合物应经超声，抽真空处理。反应完成后过滤出产物，顺次用甲醇、水、甲醇洗涤，抽干，真空干燥。产品应保存在阴凉、干燥处。
其中R1＝苯基，取代苯基，烷基R1的结构对填料的疏水性、选择性、耐腐蚀性都有影响。
本发明的优点是采用新合成路线和工艺方法，合成了一类新型化合物-硅胶基质酯基化合物。这类化合物可用作高效疏水色谱填料，而且性能优良。
由于本合成路线中反应物之一是含大量小孔的固体硅胶，反应在固-液两相界面进行。为了促使小孔内的气体排出，使反应液与硅胶所有表面充分和均匀接触，所以每步合成反应中，都有超声和同时抽真空的处理步骤。
本发明的端酯基硅胶基质化合物，由于在端基上接了一个酯基，与原来端羟基、端甲基、端苯基填料相比，疏水性有所改变。在分离性能、耐盐酸胍溶液的腐蚀性方面得到了改善。克服了端羟基疏水色谱填料不耐盐酸胍溶液的弊病，改善了分离性能并提高了峰容量。对照
图1和图2，可看到本产品的填料明显优于原有端羟基的疏水色谱填料。
本发明的填料机械性能好，耐压＞60MPa，可用于高效液相色谱，大大提高了分离和分析速度。蛋白活性回收率高，4℃时，溶菌酶和α淀粉酶的活性回收率＞90%。分离重现性好，可广泛应用于蛋白、酶和生物工程产品的分离中(图1，图3～图6)。
填料使用寿命长，在PH＝7情况下使用1500小时后的填料，经清洗后，分离性能未见改变。
填料很容易再生，只要用10倍以上体积的稀盐溶液(即疏水色谱中的B洗脱液)洗涤即可再生完全。不象某些商品柱那样要在每次进样后用NaOH溶液再生。
在某些商品柱上有些蛋白不出峰。而本发明的填料无此不良现象。
生物工程产品的盐酸胍溶液粗品可以直接上样。在一步分离中达到了纯化，除去盐酸胍的目的，完成了过去需要几步完成的工作。
图1 蛋白质和酶在酯基高效疏水色谱填料上的分离图1、色谱柱4.1×100mm不锈钢柱，硅胶孔径50nm，2、洗脱液A、3mol/L(NH4)2SO4+0.01mol/LKH2PO4，PH7;B、0.01mol/LKH2PO4，PH7;3、流速1ml/min;4、梯度时间0～100%B 20分;紫外检测波长280nm;5、蛋白样品细胞色素C(1)，肌红蛋白(2)，伴清蛋白(3)，溶菌酶(4)，α淀粉酶(5)，铁蛋白(6)，胰岛素(7)。
图2 蛋白质和酶在端羟基高效疏水色谱填料上的分离1 色谱柱4×150mm不锈钢柱2 填料结构为
3 色谱条件同图14 蛋白样品细胞色素C(1)，肌红蛋白(2)，伴清蛋白(3)，溶菌酶(4)，α淀粉酶(5)，胰岛素(6)图3 酶和蛋白在酯基聚乙二醇间隔臂型高效疏水色谱柱上的分离图。
1 色谱柱4.1×150mm不锈钢柱，硅胶孔径30nm。
2 色谱条件及蛋白样品同图1图4 酶和蛋白在端酯基聚丁二醇间隔臂型高效疏水色谱柱上的分离图1 色谱柱4×100mm不锈钢柱;
2 色谱条件及蛋白样品同图1图5 基因工程人干扰素γ的色谱图1 色谱柱4×150mm不锈钢柱2 填料为酯基聚乙二醇配基疏水色谱填料3 样品基因工程干扰素γ的7M盐酸胍粗品图6 基因工程白细胞介质素2的色谱图1 色谱柱及填料同图52 样品基因工程的白细胞介质素2的7M盐酸胍溶液例(一)苯甲酸聚乙二醇酯基高效疏水色谱填料的制备1、硅胶的酸洗10克大孔硅胶中加入100ml 6mol/L盐酸，在超声振荡器中振荡同时抽真空处理2～5分钟，然后回流4小时，用玻璃砂芯漏斗过滤，用蒸馏水洗至PH值不变，在130～180℃下烘干，放在干燥器内保存2、环氧基硅胶的制备10克酸洗处理过的硅胶中，加入70ml 5～10%的γ-缩水甘油醚基丙基-三甲氧基硅烷水溶液，调PH值到5.8，在超声振荡器上超声的同时抽真空2～5分钟，在80～110℃油浴中加热并搅拌0.5到1小时，然后过滤。先用水洗，再用甲醇洗;放在真空干燥器中干燥待用。
3、环氧基硅胶与苯甲酸聚乙二醇酯的反应10克环氧基硅胶中加入60ml 2～5%的1.4-二氧六环的聚乙醇400苯甲酸酯溶液，再加入三氟化硼乙醚溶液5ml。超声抽真空处理，然后在80～110℃加热搅拌0.5～1小时。反应完成后加入4mol/L NaH 10ml，搅拌2分钟。过滤，依次用甲醇、水、甲醇洗涤。抽干溶剂，真空干燥，即得本发明新型高效疏水色谱填料。
例(二)苯甲酸聚丁二醇酯基高效疏水色谱填料的制备1 硅胶的酸洗和环氧基硅胶的制备同例(一)2 环氧基硅胶中加入60ml 2～5%聚丁二醇(M≈800)的1，4-二氧六环溶液，再加入5ml三氟化硼乙醚溶液。超声、抽真空二分钟。在80～110℃加热搅拌0.5～1小时。反应完后，加入4mol/L NaOH 10ml，搅拌2分钟。过滤，依次用甲醇、水、甲醇洗涤。抽干溶剂，真空干燥。
3、苯甲酸聚丁二醇酯基高效疏水色谱填料的制备10克上述第2步的产物中加入60ml无水三乙胺，2克苯甲酸酐、超声、抽真空二分钟。回流0.5～1小时。过滤，依次用甲醇、水、甲醇洗涤。抽干溶剂，真空干燥。
例(三)乙酸酯基聚乙二醇800间隔臂高效疏水色谱填料的制备1 硅胶的酸洗和环氧基硅胶的制备同例(一)2 环氧基硅胶与聚乙二醇800的反应10克环氧基硅胶中加入60ml 2～5%聚乙二醇800的1，4-二氧六环溶液，再加入5ml三氟化硼乙醚溶液。超声、抽真空二分钟。在80～110℃加热搅拌0.5～1小时。反应完后加入4mol/L NaOH 10ml，搅2分钟。过滤，依次用甲醇、水、甲醇洗涤。抽干溶剂，真空干燥。
3、乙酸酯基聚乙二醇800间隔臂高效疏水色谱填料的制备10克上述产物，加入60ml吡啶，滴加2～5ml乙酰氯，滴完后，超声二分钟。在室温下放置1～3小时，过滤，依次用甲醇、水、甲醇洗，抽干溶剂，真空干燥，得产品。
权利要求
1.端酯基硅胶基质高效疏水色谱填料，其特征是该填料为硅胶上键合了一个端基为酯基的有机配体作为高效疏水色谱填料，其化学结构通式为
其中R=烷基，苯基，-[CH2(CH2)mO]n-，-(CH2CHO)n-，(m=1，2，3，n=1～40)；R1=苯基，烷基，取代苯基。
2.端酯基硅胶基质高效疏水色谱填料的合成方法，其特征是一个含端羟基有机基团的硅胶基质化合物与有机酸酐或酰氯反应得到端酯基硅胶基质高效疏水色谱填料，其特征还有含端基为环氧基的有机基团的硅胶与含端羟基的二元醇的酯类化合物
反应得到端酯基硅胶基质高效疏水色谱填料。
3.根据权利要求2所述的端酯基硅胶基质高效疏水色谱填料的合成方法，其特征是酰氯为反应试剂时在三级胺吡啶等无活泼氢的碱性有机物存在下，常温下反应，而酸酐为反应试剂时要加热到60～120℃反应0.5～2小时。
4.根据权利要求2所述的端酯基硅胶基质高效疏水色谱填料的合成方法，其特征是含环氧基的硅胶与二元醇的酯类化合物的反应，需在三氟化硼催化下，在无活泼氢的溶剂中80～120℃反应0.5～2小时。
5.根据权利要求2所述的端酯基硅胶基质高效疏水色谱填料的合成方法，其特征是各步反应中的反应物用抽真空和超声处理1～5分钟。
全文摘要
本发明公开一类硅胶基质有机化合物及其合成方法，特别是一类端酯基高效疏水色谱填料及其合成方法。本发明的高效疏水色谱填料的结构为硅胶
文档编号G07F7/08GK1092426SQ93103028
公开日1994年9月21日 申请日期1993年3月12日 优先权日1993年3月12日
发明者常建华, 耿信笃 申请人:西北大学