用于带电粒子显微术的样本的制备

用于带电粒子显微术的样本的制备
【专利摘要】一种制备用于在带电粒子显微镜中进行研究的样本的方法，包括如下步骤：?提供具有基本上彼此平行的相反面的基本上平坦的样本保持器，该样本保持器包括至少一个孔径，该至少一个孔径连接所述面并且已经跨该至少一个孔径安装了膜片，该膜片包括至少一个穿孔；?使含水液体的薄膜跨越在所述穿孔上，该液体包括悬浮在其中的至少一个研究样品，尤其包括下述步骤：?在所述跨越步骤之前，在远离所述样本保持器的一侧处，放置吸水材料的吸水薄片以紧密接触所述膜片的第一表面；?通过所述孔径沉积所述含水液体并且将所述含水液体沉积到所述膜片的第二表面上，所述第二表面与所述第一表面相反；?随后从所述膜片去除所述吸水薄片。
【专利说明】
用于带电粒子显微术的样本的制备
技术领域
[0001]本发明涉及制备用于在带电粒子显微镜中进行研究的样本的方法，其包括如下步骤:
-提供具有基本上彼此平行的相反面的基本上平坦的样本保持器，所述样本保持器包括至少一个孔径，所述至少一个孔径连接所述面并且已经跨所述至少一个孔径安装了膜片，该膜片包括至少一个穿孔；
-使含水液体的薄膜跨越在所述穿孔上，该液体包括悬浮在其中的至少一个研究样品O
[0002 ]本发明也涉及在带电粒子显微镜(CPM)中检查样本的方法，该显微镜包括:
-支撑设备，用于支撑样本被安装在其上的样本保持器；
-带电粒子源，用于产生带电粒子射束；
-照明器，用于引导所述射束以便照射样本；
-检测器，用于检测响应于所述照射从样本放射出的输出辐射通量。
[0003]—般而言，在制备之后和在CPM中检查之前，如上文提及类型的样本将被固化/迅速冷冻/玻璃化，例如通过把它投入到制冷剂浴槽(bath)中，以及然后将其从浴槽中移除并且在运输/储存期间将其维持在制冷温度下。
[0004]如遍及此本文所使用的，随后的术语应该被解释为符合下述说明:
-基本上平坦的样本保持器可以包括多于一个的所描述的孔径;特别地，它可以是包含这样的孔径的矩阵布置的网格状的结构。类似地，跨越在给定孔径上的膜片可以包含多于一个的所描述的穿孔;特别地，它可以包括这样的穿孔的(随机的或规则的)分布。这些穿孔本身可以被有意地创建(例如使用钻孔技术、刺孔技术、穿刺技术或刻蚀技术)或它们可以天然地存在于该膜片中。在当前情境中，样本保持器可以被看作用来支撑在其上安装(伸展)的薄的膜片的“脚手架”。如这里所描述的预先制造的、一次性的、网格状的样本保持器是商业可得的，例如以所谓的“TEM网格”或“自动网格”的形式。类似地，经穿孔的膜片也是商业可得的，例如以所谓的“有孔碳”或Quantifoir膜片的形式。
-词组“含水液体”意图涵盖纯的液态水，而且还涵盖水基溶液或悬浮液。该术语因此包括电解液，此外还包括生物学液体，诸如例如细胞质、血楽、淋巴液或羊水。这种含水液体薄膜在表面张力效应的帮助下本质上跨越在所述(多个)穿孔上。
-术语“制冷剂”应该被解释为指的是在制冷温度下(即在_150°C下或低于-150°C)的液体。
-在当前情况下的“样本”可以被看作是(固化的/玻璃化的)含水液体的所述跨越的薄膜，包括它的悬浮的(多个)研究样品。在实践中，对这样的样本实行的CPM研究将通常倾向于集中于所述(多个)样品，而不是集中于样品所密封于其中的(固化的)液体。
【背景技术】
[0005]带电粒子显微术是众所周知的并且是用于对微观对象成像(特别是以电子显微术的形式)的越来越重要的技术。历史上，电子显微镜的基本类别已经经历演变成为许多众所周知的装置种类，诸如透射电子显微镜(TEM)、扫描电子显微镜(SEM)和扫描透射电子显微镜(STEM)，并且也演变成为各种子类，诸如所谓的“双射束”工具(例如FIB-SEM)，其额外地采用“加工”聚焦离子射束(FIB)，以允许支持性活动，诸如例如离子射束研磨或离子射束诱发沉积(IBID)。更具体地:
-在SEM中，通过扫描电子射束对样本的照射促成来自样本的“辅助”辐射的放射，其例如是以二次电子、反向散射电子、X射线和光致发光(红外光子、可见光子和/或紫外光子)的形式;放射出的辐射的通量的一个或多个分量然后被检测到并且被用于图像累积目的。
-在TEM中，用于照射样本的电子射束被选择为具有足够高的能量以穿透样本(为了这个目的，该样本通常将比在SEM样本的情况下更薄)；从样本放射出的透射电子的通量然后可以被用于创建图像。当这样的TEM以扫描模式操作(因此变成STEM)时，讨论中的图像将在照射电子射束的扫描(例如光栅或蛇形)运动期间被累积。
[0006]能够例如从以下维基百科链接收集关于在这里阐明的主题中的一些的更多信息: http://en.wikipedia.0rg/wiki/Electron_microscope
http://en.wikipedia.0rg/wiki/Scanning_electron_microscope
http://en.wikipedia.0rg/wiki/Transmiss1n_electron_microscopy
http://en.wikipedia.0rg/wiki/Scanning_transmiss1n_eIectron_microscopyo
[0007]作为对使用电子作为照射射束的替代方案，带电粒子显微术也可以使用其他种类的带电粒子来实行。在这个方面，词组“带电粒子”应当被宽泛地理解为涵盖例如电子、正离子(例如Ga或He离子)、负离子、质子和正电子。关于基于离子的显微术，一些进一步的信息可以例如从诸如以下的来源收集:
http://en.wikipedia.0rg/wiki/Scanning_Helium_1n_Microscope-ff.H.Escovitz, T.R.Fox和R.Lev1-Setti, Scanning Transmiss1n 1nMicroscope with a Field 1n Source, Proc.Nat.Acad.Sc1.USA 72(5)，1826-1828页(1975)。
[0008]应该注意的是，除了成像，带电粒子显微镜也可以具有其他功能，诸如实行光谱术、检查衍射图、实行(局部化)表面改性(例如，研磨、刻蚀、沉积)等。
[0009]在所有情况下，带电粒子显微镜(CPM)将包括至少如下部件:
-辐射源，诸如肖特基电子源或离子枪。
-照明器，其用来操纵来自源的“原始”辐射射束并且对其实行某些操作，诸如聚焦、像差减轻、(用孔径)修剪、滤波等。它将通常包括一个或多个(带电粒子)透镜，并且也可以包括其他类型的(粒子_)光学部件。如果期望，照明器可以被提供有偏转器系统，其可以被调用以促使它的输出射束跨正被调查的样本实行扫描运动。
-支撑设备，在该支撑设备上可以保持和定位(例如，倾斜，旋转)调查中的样本保持器/样本。如果期望，这个支撑设备可以被移动以便实现射束相对于样本的扫描运动。一般而言，这样的支撑设备将被连接到定位系统，诸如例如机械载台。
-检测器，其本质上可以是单一的或者复合的/分布式的，并且根据正在被检测的辐射(响应于样本的照射)，该检测器可以采取许多不同的形式。示例包括光电倍增器(包括固态光电倍增器，SSPM)、光电二极管、CMOS检测器、CXD检测器、光伏电池等，它们例如可以连同闪烁体薄膜一起使用，举例来说。对于X射线检测，典型地利用例如所谓的硅漂移检测器(SDD)或硅锂(Si(Li))检测器。典型地，CPM将包括各种类型的若干个检测器。
[0010]在透射类型显微镜(诸如例如(S)TEM)的情况下，CPM也将包括:
-成像系统，其实质上取得传输经过样本(平面)的带电粒子并且将它们引导(聚焦)到分析装置上，该分析装置诸如是检测/成像设备、光谱学装置(诸如ELLS模块;ELLS=电子能量损失光谱学)等。正如上文提及的照明器那样，成像系统也可以实行其他功能，诸如像差减轻、修剪、滤波等，以及它将通常包括一个或多个带电粒子透镜和/或其他类型的粒子光学部件。
[0011]在下文中，本发明有时可以(作为示例)在电子显微术的具体情境下被阐述。然而，这样的简化仅意图用于清楚/说明性的目的，以及并不应该被解释为限制性的。
[0012]在CPM中样本的某些类型的检查可能对于它们的制备、运输和操作提出显著的挑战。特别地，需要在含水液体(诸如水、电解液、细胞液、血浆等)的主体中储存和研究的生物样品(诸如细胞、细胞组分、单细胞有机体等)可能是难以处理的，因为:
-引入到CPM的(准)真空环境中的含水液体将开始释气/沸腾，因此倾向于使样本降解。
-为了防止这种情况，在被引入到所述真空中之前，该样本典型地被冷冻/固化。
-然而，为了防止由(锋利的)冰晶的形成而引起的对样本的损害，这样的冷冻通常必须被非常迅速地实行，其目的是实现没有显著冰结晶情况下的样本玻璃化(固化成非晶体的、玻璃状的相)O典型地通过迅速地将样本投入到制冷剂浴槽中来实现这样的玻璃化。
-为了促进可接受的玻璃化，该样本应该优选地具有相对大的表面积-体积比。此外，如果该样本随后要在透射类型CPM(诸如(S)TEM)中进行检查，那么照射的带电粒子射束必须能够穿透该样本，并且进入样本的成像系统下游。这些需求要求样本是相对薄的并且被安装在样本保持器上，该样本保持器并不明显地妨碍(挡住)所述射束的标称路径一一这本质上要求样本是通过/沿着它的边沿可支撑的。
[0013]为了满足这些要求，这个类型的含水样本典型地被制备为薄的薄膜，其跨越在薄的膜片中的小穿孔(开口)上或在薄的膜片中的小穿孔(开口)内，有些类似于肥皂薄膜将其自身跨越在气泡吹制器的环上的方式。实现这样的跨越的一个已知的方式是用一些含水液体润湿样本保持器(例如通过将其浸没在这样的液体的盘子中或者用移液管将该液体滴到其上)并且然后紧密地对着样本保持器的面短暂地按压一片吸水纸。这样的吸水用来从样本保持器去除过量的液体，其目的是在去除吸水纸时在样本保持器上留下液体的更均匀的层。例如，这个类型的方法在出版物“Single Cell Analysis: Technologies andApplicat1ns”(由Dar1 Anselmetti编辑，Wiley VCH出版社，2009年，ISBN 978-3-527-31864-3，特别是在§ 3.2 的第 44 和 45 页:https://books.google.nl/books7isbn =3527626654)中进行了阐述。
[0014]尽管到目前为止在先前段落中阐述的技术已经产生了可容许的结果，但本发明人已经进行了广泛的工作来对常规方法做出改进。这个努力的结果是本发明的主题。

【发明内容】

[0015]本发明的目标是提供一种样本制备的改进方法。特别地，本发明的目标是这个改进方法应该比已知方法更通用和更有效，并且其应该产生比现有技术的方法质量更好的样本。
[0016]按照如在上文的开头段落中阐述的方法实现这些和其他目标，该方法的特征在于下述步骤:
-在所述跨越步骤之前，在远离所述样本保持器的一侧处，放置吸水材料的吸水薄片以紧密接触所述膜片的第一表面；
-通过所述孔径沉积所述含水液体并且将所述含水液体沉积到所述膜片的第二表面上，所述第二表面与所述第一表面相反；
-随后从所述膜片去除所述吸水薄片。
[0017]该方法尤其在以下方面区别于现有技术:
-在沉积步骤之前(而不是在沉积步骤之后)吸水薄片被应用到样本保持器；
-沉积步骤从膜片的与应用吸水薄片的侧面(第一表面)相反的侧面(第二表面)发生； -沉积步骤通过孔径(网格)而发生，以使得其可以被看作“后侧沉积”而不是“前侧沉积”。
[0018]将在下文更详细地讨论这些(和其他)差别。
[0019]在导致本发明的试验中，发明人进行了一些重要的观察，如下:
-对已经接收到含水液体的沉积物的膜片进行吸水纸的后应用可能引起存在于该液体中的易碎样品(诸如生物细胞)的机械损坏。
-在后沉积吸水之后在样本保持器上留下的液体层在厚度上是相对不规则的，这导致存在于膜片穿孔中的这个层的部分(即将在CPM中经受随后的研究的跨越的薄膜)的相对不良的厚度均匀性。
-(在应用吸水纸之前)在样本保持器上液体的“覆盖”沉积是相对低效的过程，因为大部分液体将下沉到膜片中的穿孔之外而不是下沉到膜片的穿孔之内。如果在含水液体中漂浮的样品的浓度是相对低的，那么这样的低效可能导致有价值/稀有的样品的损失。
[0020]相比之下，根据本发明的吸水薄片(例如包括纸或布)的预先沉积应用减轻了上文提及的机械损坏问题。此外，因为本发明性的方法从膜片的一侧实行沉积并且从另一侧吸水，膜片中的(多个)穿孔被更均匀地填满液体，这导致了更均匀的跨越的薄膜的创建。本发明人已经观察到，含水液体在穿孔内一接触到预先放置的吸水薄片，它就在吸水薄片上形成液体的薄的表面薄膜，表面薄膜被观察到具有高亲水性以及因此用来把液体从膜片的沉积侧“吸引”到穿孔中。
[0021]在本发明的特定实施例中，以下内容适用:
-所述膜片包括多个穿孔，并且跨多个所述孔径安装所述膜片以使得所述多个孔径中的每个孔径内出现至少一个穿孔；
-所述沉积步骤是局部化的，并且被限制到样本保持器的特定区域，该区域包括所述多个孔径的子集。
[0022]本发明的重大优点是其允许含水液体在样本保持器上的局部化沉积，这与现有技术中出现的“覆盖”或“全局”沉积相对比。为了促进这点的讨论，将考虑包括由细线“护壁”限定的孔径(单元)的矩阵布置的网格状的样本保持器的(非限制性)示例，在该网格的一侦U/面(“前侧”)上已经将一个穿孔的膜片进行伸展，由此至少一个(和典型地若干个)穿孔存在于任意给定的孔径的界限内。因为本发明性的方法通过网格的孔径实行“后侧”液体沉积，每个孔径的护壁充当液体的侧向流动屏障，缩减它到相邻孔径中的蔓延。因此，如果从相对窄的、定义明确的源(参见下文的讨论)沉积该液体，那么人们可以将沉积限制于样本保持器的给定的“区域”，该区域(根据选择)包括样本保持器中的孔径中的一个或多个(但不是全部)。与现有技术情况下的“覆盖”沉积相比，这允许使用相当少的含水液体来制备样本。此外，它开辟了用于如在下个段落中阐述的实施例的方式。
[0023]在刚才所描述的实施例的特殊情况下，本发明性的方法的特征在于，在去除所述吸水薄片之前，在样本保持器的至少两个不同区域中实行所述沉积步骤，由此:
-通过所述区域中的第一区域中的第一孔径来沉积第一含水液体；
-通过所述区域中的第二区域中的第二孔径来沉积不同于所述第一含水液体的第二含水液体。
[0024]在先前段落中描述的侧向限制(由此样本保持器中的孔径的护壁用来将沉积的液体限制到给定区域)允许在样本保持器上创建多个(互相排斥的和/或部分重叠的)区域，每个区域包括不同的含水液体。按照这种方式，多个样本可以被沉积在单个样本保持器上一一这因此极大地简化了样本处理，因为针对要被调查的每个不同类型的样本来装载/卸载单独的样本保持器以及在位置上校准单独的样本保持器不再是必需的，由此精简操作、节约时间并且减少污染风险和所需的样本储存空间。这在比较性样本研究中是特别地(但不是独有地)有利的，例如，在比较性样本研究中，给定类型的研究样品(例如特定类型的病毒)已经受到不同的影响(例如暴露于不同类型的抗病毒物质、辐射、生长条件等等)并且人们希望比较这些在样品上所已经具有的效应。在当前实施例中，这样的样本可以被沉积在单个样本保持器上的不同的坐标位置(具有不同的坐标位置的区域)处，以及人们可以容易地从一个坐标位置移动到另一个坐标位置来比较观察结果，无须不断地切换到不同的样本保持器(并且等待装载不同的样本保持器)。
[0025]在本发明的特定实施例中，使用从包括非接触式分配器和触发式(touch-off)分配器的组中选择的分配设备来实行所述沉积步骤。这样的分配器具有如果期望则允许含水液体的(非常)局部化的沉积的优点，但是它们也可以被用来在相对大的区域上沉积液体，例如通过采用它们的分配“头”相对于样本保持器的扫描运动。据此应该注意的是:
-在当前情境中非接触式分配器的示例是喷墨类型的分配器，其可以被用来在目标位置处可控制地射出小液滴的良好瞄准(we 11 -aimed )的串列。另一个示例是所谓的“连续流分配器”(或“体积分配器”)，其(从非常狭窄的喷嘴)产生液体的连续细流，而不是离散一阵的小液滴。
-在触发式分配器的情况下，通过使用粘滞性/粘附力/表面张力效应，在针的末端处的液体小液滴接触到样本保持器(并且“被擦掉”到达样本保持器上)，以将小液滴从源转移(“拉”)到目的地。
[0026]当人们希望将不同的含水液体沉积到样本保持器的不同区域上(参见上文)时，那么人们可以例如:
-针对每种不同的液体使用不同的分配器;或者
-针对各种不同液体将相同的分配头/喷嘴/毛细管/针与不同的储液器/储存容器一起使用，或者利用液体的连续的/连贯的主体之间的适当的“分离物”(诸如例如少量(“栓”)的二甲亚砜(DMSO))来逐次地通过单个供应线/管供应不同的液体。
[0027]技术人员将充分地能够根据给定情况的要求来选择/适配特定的分配技术。
[0028]在本发明的另一个实施例中，至少所述分配步骤是在具有至少95%的相对湿度(RH)的空间(外壳/腔/室)中实行的。相对高的空气湿度有助于防止在样本制备期间(在玻璃化之前)使样本干燥，特别是在样本保持器的不同区域被提供有不同的含水液体的情况下一一这典型地比沉积仅一种类型的含水液体消耗更多时间。可以例如使用加湿器来实现/维持这样相对高的RH水平(其可以优选地超过95%)。
[0029]在本发明的特定实施例中，在所述沉积步骤之前该吸水薄片被预先润湿。上文已经陈述过的是，当吸水薄片被润湿时，它的亲水性帮助通过穿孔从沉积侧(“背侧”)吸引沉积的含水液体。代替等待吸水薄片变得被沉积的含水液体自身所润湿，人们可以通过在沉积步骤之前预先润湿吸水薄片来“发起(kick start)”这个过程。这样的预先润湿可以在针对膜片放置吸水薄片之前或之后发生；在后者的情况下，人们可以例如使用喷雾器来润湿吸水薄片的远离膜片的暴露的表面。可以用纯净水或用对随后将被沉积的含水液体不具有有害作用的水基溶液/悬浮液来发生预先润湿;在那个方面，如果期望，可以用与随后将被沉积的含水液体相同类型的含水液体来实行预先润湿。以这个方式预先润湿吸水薄片也有助于在样本保持器附近维持升高的RH(参见先前的段落)。
[0030]在已经完成本发明性方法中的沉积步骤时，可以从样本保持器去除(例如剥落或滑落)吸水薄片，在膜片的(多个)穿孔中留下含水液体的薄的薄膜。典型地，样本保持器(+其上的(多个)含水液体样本)然后将通过将其沉浸到制冷剂(诸如(例如在-160 °C到-183 °C的范围内的温度下的)液态乙烷)中而被投入冷却。这样的投入冷却过程的描述例如被包含在欧洲专利申请EP 13186632 (FNL1320K其通过引用结合于本文中)中。一旦样本保持器已经以这种方式被投入冷却，其应该在制冷温度下进行储存/运输来维持其上的样本处于玻璃化状态。适合于在这个情境中使用的所谓的冷冻转移保持器的描述例如包含在欧洲专利申请EP 14197422 (FNL1423K其通过引用结合于本文中)中。
[0031]作为一般性事务，技术人员将理解根据本发明制备的样本原则上也可以在除了CPM之外的装置中(例如在(例如用于晶体学研究的)X射线衍射仪中)进行调查。
【附图说明】
[0032]现在将基于示范性实施例和随附的示意性附图来更详细地阐明本发明，在附图中:
图1呈递了样本保持器的特定实施例的多方面的平面视图(顶部)、横向截面视图(中部)和放大的详细视图(底部)，该样本保持器可用来承受包括含水液体薄膜的样本，并且可以使用根据本发明的方法来制备该样本保持器。
[0033]图2A-2E示出了在根据本发明的方法的实施例的各种步骤的执行期间的诸如图1中所描绘的样本保持器。
[0034]图3呈递了适合于与本发明一起使用的带电粒子显微镜的立面视图。
[0035]在这些附图中，在有关之处，可以使用对应的参考符号来指示对应的部分。应该注意的是，一般而言，附图并非是按比例的。
【具体实施方式】
[0036]实施例1
图1(其并不一定是按比例的)呈递了样本保持器S的特定实施例的多方面的各种视图，该样本保持器S可以连同本发明一起使用。这个特定类型的样本保持器S包括经常被称为“网格”或“自动网格”的部分。它包括铜(Cu)线(或其他金属线)的圆环2 Ia，(典型地)该环的直径是大约3mm以及该线的直径为大约50-100μπι左右。位于/附在环21a内的是直线部分21b，其被布置为形成正交网格图案，从而限定了(基本上为方形的)孔径(开口/孔/窗口)23的矩阵状的阵列。图1的中间部分示出了该图的上部部分沿着直径A-A’获得的横向截面视图。该横向截面视图示出了样本保持器S具有基本上平坦的(平面的/盘状的)形式，具有基本上彼此平行的相反的“正”面(Sf)和“背”面(Sb)。任意给定的孔径23“连接”这些面Sb、Sf，因为其充当它们之间的连接通道。
[0037]如这里所描绘的，膜片25已经被安装(铺设、伸展)在正面Sf上(并且，可选地例如使用粘合剂或通过熔化接合而贴附到线21b)。例如，这个膜片25可以包括诸如尼龙或石墨烯之类的含碳材料，以及将典型地具有(在Z方向上)范围从大约0.3nm到几百nm的厚度。膜片25包含穿孔27的分布，该穿孔27在该附图的底部处的详细视图中是清晰可见的。这些穿孔27典型地具有大约2μπι左右的(平行于XY平面的)直径/宽度。注意，膜片25具有:
-第一表面SI，其背向网格21a、21b;
-第二表面S2，其面向网格21a、21b。
[0038]本质上，网格结构21a、21b充当膜片25的脚手架，并且膜片25进而充当穿孔27的支撑结构(以使得其有时被称为“有孔的碳支撑物”)。在穿孔27内(以(包括悬浮在其中的一个或多个研究样品的)含水液体的薄的薄膜29的形式)提供和支撑最终的“样本”，该薄的薄膜29跨越在每个给定的穿孔27上，(尤其)依靠表面张力效应保持在原位。
[0039]应该注意的是，如在图1(网格21a、21b+穿孔的膜片25、27)中描绘的以及如上文所描述的样本保持器S是商业可得的，例如是从诸如美国加利福尼亚州雷丁市的Ted Pella有限公司之类的公司商业可得的。也可能购买(各种)预先制造好的有孔碳薄膜(其与经穿孔的膜片25、27相对应)，例如从诸如德国耶拿市的Quantifoil Micro Tools GmbH之类的公司购买。应该注意的是，原则上，供本发明中使用的样保持器S基本上要求仅一个孔径23和仅一个穿孔27;然而，多个这些结构23、27当然是被本发明所允许的，并且一般是有利的，因为其典型地允许更多样本材料存在于样本保持器S的给定区域上。
[0040]实施例2
图2A-2E示出了在根据本发明的方法的实施例的各种步骤的执行期间的诸如图1中所描绘的样本保持器S ο特别地，描绘了以下内容:
-图2A:在将含水液体沉积在膜片25上之前，将吸水材料(例如Whatman Paper I号)的吸水薄片31放置为与膜片25的第一表面SI紧密接触(该表面SI远离网格线21b)。根据期望，这个吸水薄片31可以是干的或预先润湿的。
[0041 ]-图2B:使用分配装置33(诸如喷墨类型的喷嘴)，使含水液体35的液滴的流/串列局部地沉积到膜片25的第二表面S2上，形成液体“池” 37。这从保持器S的背侧Sb通过孔径23而发生。网格线21b沿着孔径23的周界在侧面包含池37，从而限制在XY平面中的展开。典型地，大约20纳公升左右的剂量(例如)可以以这种方式被沉积在孔径23中。
[0042]-图2C:这里，在不同的孔径23’处正在重复在图2B中实行的程序。如这里所示出的，这将是用从不同的分配设备33’沉积的不同的含水液体35’来完成的；然而，如上文所解释的，如果期望，也可能使用与图2B中相同的设备33。注意，最初出现在孔径23(图2B)中的池37已经开始渗透入吸水薄片31中，形成吸水斑块39。如果期望，可以在其他孔径处重复诸如在图2B和2C中示出的程序。此外，如果期望，在给定的孔径中实行沉积后，在其他孔径中的先前的沉积可以在移到下一个主要步骤(吸水薄片去除)之前被“结束(top up)” ；概括地说，如果期望，在一个或多个孔径中的沉积程序可以是多步骤过程。
[0043]-图2D:沉积步骤已经被完成，并且吸水薄片31已经从膜片25被去除(例如，剥落、滑落、剥去)。注意，吸水斑块39’已经作为从孔径23’对池37’进行吸水的结果而被形成。
[0044]-图2E:在去除吸水薄片31后，含水液体35、35’的(各自的)薄的薄膜29、29 ’已经(分别地)被留在孔径23、23’内的穿孔27、27’中。
[0045]在去除吸水薄片31后，样本保持器S可以被投入到制冷剂的玻璃化浴槽中。
[0046]实施例3
图3是本发明可以被应用在其中的CPM的实施例的高度示意性描绘;更具体地，其示出了透射类型显微镜M的实施例，在这种情况下该透射类型显微镜M是TEM/STEM(尽管在本发明的情境中，其可以妥当地刚好是基于离子的显微镜，和/或非透射类型的显微镜，诸如例如是SEM)。在该附图中，在真空外壳E内，电子源4(诸如例如肖特基发射器)产生电子射束(B)，其穿越电子光学照明器6，该电子光学照明器6用来将电子引导/聚焦到研究对象S的选定部分上;尽管在(S)TEM中可以调查各种各样的不同类型的研究对象S，但在当前情境中将要假定的是，研究对象S是根据本发明来制备的样本保持器S(例如如在实施例2中所阐述的样本保持器(包括玻璃化的含水液体薄膜29))。这个照明器6具有电子光学轴B’，以及将通常包括各种静电/磁透镜、(扫描)偏转器D、校正器(诸如消象散器)等;典型地，其也可以包括聚光器系统(事实上，整个项目6有时被称为“聚光器系统”)。
[0047]该样本保持器S被保持在(杆状)支撑设备H上，该支撑设备H安置于连接到定位设备(载台、执行器)A的支架A’(诸如FEI CompuStage)中；这个支架A’可以典型地按照X、Y、Z进行移动/定位，并且经常也可以围绕X和/或Y(参见所描绘的笛卡尔坐标系)转动。这样的定位允许样本保持器S的不同部分被沿着轴B’行进的电子射束照射/成像/检查，并且也允许样本保持器S作为例如层析成像测量系列(正弦图采集)的部分而被倾斜;原则上，它也允许作为射束扫描的替代方式而实行扫描运动。
[0048]沿着轴B’行进的(聚焦)电子射束B将与样本保持器S上的薄膜29(悬浮在其中的样品)(参见图1、图2Ε)以这样的方式相互作用，以便引起从薄膜29放射出各种类型的“激发的”福射通量，其包括(例如)二次电子、反散射电子、X射线福射和光福射(阴极发光)。如果期望，可以使用检测器22来检测这些辐射类型中的一个或多个。然而，此外/替代地，人们可以研究穿越(穿过)薄膜29、从其中出现(放射出)并且(基本上，虽然通常有一些偏转/散射)继续沿着轴B’传播的电子。这样的透射电子通量进入成像系统(组合的物镜/投影透镜)24，其将通常包括各种静电透镜/磁透镜、偏转器、校正器(诸如消像散器)等。在正常(非扫描)TEM模式中，这个成像系统24可以将透射的电子通量聚焦到荧光屏幕26上，如果期望，该荧光屏幕26可以(如由箭头26’示意性指示的)被缩回/撤回以便使其离开轴B’的路线。薄膜29(悬浮在其中的样品)(的部分)的图像(或衍射图)将通过成像系统24形成在屏幕26上，并且这可以通过位于外壳E的壁的合适部分中的观察口 28观察到。用于屏幕26的缩回机制可以例如在本质上是机械的和/或电子的，以及并未在这里描绘出。
[0049]作为观察屏幕26上的图像的替代方式，人们可以改为利用从成像系统24出现的电子通量的焦深通常是非常大(例如大约Im)的事实。因此，各种其他类型的分析装置可以被用在屏幕26的下游，诸如:
-TEM相机30 ο在相机30处，电子通量可以形成静态图像(或衍射图)，其可以通过控制器C来处理并且显示在显示设备(诸如例如平板显示器)(未描绘出)上。当不需要时，相机30可以(如由箭头30’示意性地指示的)被缩回/撤回以便使其离开轴B’的路线。
-STEM记录器32ο来自记录器32的输出可以被记录为在薄膜29上的射束B的(X，Y)扫描位置的函数，以及可以构建图像，该图像是作为X、Y的函数的来自记录器32的输出的“图”。记录器32可以包括具有例如20mm直径的单个像素，这与有特性地存在于相机30中的像素矩阵形成对比。此外，记录器32将通常具有比相机30(例如每秒12幅图像)高得多的采集速率(例如每秒16个点)。再一次，当不需要时，记录器32可以(如由箭头32’示意性地指示的)被缩回/撤回以便使其离开轴B’的路线(但是例如在圆环形状的环形暗场记录器32的情况下这样的缩回将不是必要的;在这样的记录器中，在记录器未处于使用中时，中心孔将允许射束通过)。
-作为对使用相机30或记录器32进行成像的替代方式，人们也可以调用光谱学装置34，其例如可以是EELS模块。
[0050]应该注意的是，项目30、32和34的顺序/位置不是严格的，并且许多可能的变化是可想到的。例如，光谱学装置34也可以被集成到成像系统24中。
[0051]注意，控制器(计算机处理器)C(其可以根据期望可以具有单一结构或复合结构)经由控制线(总线)C’被连接到各种图示的部件。该控制器C可以提供各种功能，诸如同步动作、提供设定点、处理信号、实行计算以及在显示设备(未描绘出)上显示消息/信息。技术人员将理解，外壳E的内部并不必须被保持在严格真空下;例如，在所谓的“环境TEM/STEM”中，在外壳E内有意引入/维持给定气体的本底大气。技术人员也将理解，在实践中，限制外壳E的体积可能是有利的，以使得在可能的情况下它本质上如下来紧抱轴B’:它采用小管(例如直径大约为Icm)的形式(所采用的电子射束穿过该小管)，但加宽以容纳诸如源4、支撑设备H、屏幕26、相机30、记录器32、光谱学装置34等等的结构。
【主权项】
1.一种制备用于在带电粒子显微镜中进行研究的样本的方法，包括如下步骤: -提供具有基本上彼此平行的相反面的基本上平坦的样本保持器，所述样本保持器包括至少一个孔径，所述至少一个孔径连接所述面并且已经跨所述至少一个孔径安装了膜片，该膜片包括至少一个穿孔； -使含水液体的薄膜跨越在所述穿孔上，该液体包括悬浮在其中的至少一个研究样品， 其特征在于下述步骤: -在所述跨越步骤之前，在远离所述样本保持器的一侧处，放置吸水材料的吸水薄片以紧密接触所述膜片的第一表面； -通过所述孔径沉积所述含水液体并且将所述含水液体沉积到所述膜片的第二表面上，所述第二表面与所述第一表面相反； -随后从所述膜片去除所述吸水薄片。2.根据权利要求1所述的方法，其中: -所述膜片包括多个穿孔，并且所述膜片被安装为跨越多个所述孔径以使得所述多个孔径中的每个孔径内出现至少一个穿孔； -所述沉积步骤是局部化的，并且被限制到样本保持器的特定区域，所述区域包括所述多个孔径的子集。3.根据权利要求2所述的方法，其中在去除所述吸水薄片之前，在样本保持器的至少两个不同区域中实行所述沉积步骤，由此: -通过所述区域中的第一区域中的第一孔径来沉积第一含水液体； -通过所述区域中的第二区域中的第二孔径来沉积不同于所述第一含水液体的第二含水液体。4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中使用从包括非接触式分配器和触发式分配器的组中选择的分配设备来实行所述沉积步骤。5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中至少所述分配步骤是在具有至少95%的相对湿度的空间中实行的。6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中在所述沉积步骤之前所述吸水薄片被预先润湿。7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中在去除所述吸水薄片之后，所述样本保持器被投入到低温制冷剂中。8.—种在带电粒子显微镜中检查样本的方法，所述显微镜包括: -支撑设备，用于支撑样本被安装在其上的样本保持器； -带电粒子源，用于产生带电粒子射束； -照明器，用于引导所述射束以便照射样本； -检测器装置，用于检测响应于所述照射从样本放射出的输出辐射通量； 所述方法的特征在于:在样本被放置在所述支撑设备上之前，使用如权利要求1-7中的任一项所要求保护的方法来制备所述样本。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述显微镜被提供有冷却设备，所述冷却设备用于当所述样本保持器处于所述支撑设备上时使所述样本保持器维持在制冷温度下。
【文档编号】H01J37/28GK105914122SQ201610103111
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年2月25日
【发明人】H-W.雷米格伊
【申请人】Fei 公司