一种抑制菜豆细菌性萎蔫病菌生长的化合物的制作方法
【技术领域】
[0001] 在本发明涉及化合物的新用途，阐明药物化学结构与细菌的生物活性之间的关 系，更具体的说，是探索化合物对菜豆细菌性萎蔫病菌的抑菌和杀菌活性。
【背景技术】
[0002] 菜豆萎蔫病自HedgeS1922年首次在美国南达科他州发现报道以来，已成为菜豆 最重要的细菌病害之一，有些年份损失几乎达100%。此病主要发生在北美和澳大利亚，在美 国，主要发生在东北部各州，而在澳大利亚则主要发生在其南部及维多利亚州；在欧洲，土 耳其发生严重，其余地区损失较小。菜豆萎蔫病亦在非洲南部发生，在拉丁美洲引起丁发草 萎蔫病。
[0003] 据Kennedy和Alcornl980年报道，1976年美国仅俄克拉河马州，由于菜豆萎蔫病 使菜豆产量损失达20万吨；发病严重时，菜豆可减产达90%。1975年在美国的衣阿华州3 个县首次发现菜豆萎蔫病菌引起大豆褐斑病，至1983年迅速蔓延到该州的16个县；现在加 拿大，前苏联(特别是远东地区）均有发生。
[0004] 据报道，1975年美国大豆产量损失达13%。1982年衣阿华州感病大豆田达84%，其 中 1978~1981 年大豆产量损失达 0~18. 8%.分别为 7. 8%(1978)，12. 5%(1979)，4. 3%(1981)。 据记载，有些品种种子感病率达30%。Wood等1990报道，澳大利亚昆士兰1984年发现一种 新病害即斑豆和绿豆萎蔫病，叶片侵染率达5~90%。
[0005]Chavarro等1985年首次报道，在拉丁美洲哥伦比亚发现了丁发草萎蔫病，菜豆萎 蔫病菌侵染丁发草及菜豆种子分别达88. 8%和52. 5%，种子发芽率严重下降。
[0006] 菜豆萎蔫病菌为短小杆菌，直至略弯或楔形，单个或V、Y、栅栏状排列；在酵母膏 葡萄糖琼脂培养基上，菌落光滑，完整，低隆不粘，黄色、桔黄色、粉红色或紫色。
[0007] 菜豆萎蔫病菌主要在种子和病茎上越冬。病菌在菜豆和大豆的种子表面和内部存 活，存活期可达20年以上，在实验室条件下可达24年；据记载，在菜豆与甜菜轮作的情况 下，病原菌在土壤中至少存活2个冬季。菜豆萎蔫病是一个典型的维管束病害，主要靠种子 传播。种子子叶带菌传给叶片或直接进入维管束组织，引起系统发病。病菌再侵染主要通 过伤口，萎蔫的发生率随茎和叶片组织的伤口增加而增加。在一定条件下，南方根结线虫提 供病原侵入的伤口。灌溉水有利局部传播，如美国仅中西部地区及灌溉的高原地区发生普 遍。砂性土壤比粘性土壤发病重；低温、下雨和大风有利于病害发生和流行。
【发明内容】
[0008] 本发明采用体外抗菌试验，研究化合物对菜豆细菌性萎蔫病菌的生物活性。
[0009] 本发明的具体技术方案如下： 本发明的创新点是发现化合物对菜豆细菌性萎蔫病菌有良好的抑菌和杀菌活性，并测 量得到其最小抑菌浓度MIC值和最小杀菌浓度MBC值，属于首次公开。
[0010] 所述化合物结构特征如下式所示：
【具体实施方式】
[0011] 下面结合具体实施实例，进一步详细地说明本发明。应理解下面实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明范围。
[0012] 实施实例1 测量最小抑菌浓度MIC值。
[0013] (1)营养肉汤的配制：取营养肉汤30g加1000 mL蒸馏水即得。使用前121°C高压 蒸汽灭菌20min待用。
[0014] (2)营养琼脂固体培养基的配制：取营养琼脂45g加1000 mL蒸馏水即得。使用前 121°C高压蒸汽灭菌20min待用。
[0015] (3)菌株的培养：操作于超净工作台上进行。吸取已灭菌的液体培养基10mL，放在 已灭菌的试管中，然后用接菌环挑取一个菌落，加到液体培养基中，放于培养箱内培养，细 菌培养24h，培养温度为28°C。
[0016] (4)菌液配制及计数：将培养后的菌液，釆用10倍稀释法用液体培养基稀释，并 用血球计数板在显微镜上初步观察计数，然后将菌液用液体培养基稀释，作为加入供试品 中的菌液。细菌采用平板计数法进行计数，将以上菌液用无菌生理盐水再稀释100倍，取 50 y L，均匀涂于已铺有固体培养基的平皿中，培养24h，培养温度为28°C。培养后，单个活 细菌生长形成一个菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数。
[0017] 计算公式为：菌液浓度=nX20X 100cfu/mL (5)药品溶液的配制：称取化合物，加入灭菌生理盐水，摇勾，得均匀溶液，备用。存放 于4°C冰箱保存待用。
[0018] (6)最小抑菌浓度（MIC)与最小杀菌浓度（MBC)的测定：采用微量肉汤稀释法测定 最小抑菌浓度MIC (Minimal Inhibitory Concentration)。MIC为最小抑菌浓度，即药物 与一定浓度的菌液作用后，能够抑制可见菌生长的最低浓度。
[0019] 采用二倍稀释法将药液用无菌生理盐水将药液稀释系列浓度，0.5、1、2、4、8、16、 32、64、128和256 ^/1^，在96孔板上1~10行，每孔加100^不同浓度的药液和100 1^ 菌液，使最终菌液浓度为1~5X105cfu/mL，第11行以无菌生理盐水加菌液作为阳性对照，第 12行以不加菌液的无菌生理盐水为阴性对照，混匀后于28°C培养24h，以肉眼观察药物最 低浓度管中无细菌生长者为该试验药物的MIC，每个实验重复三次。
[0020] 测得最小抑菌浓度MIC值为4 y g/mL。
[0021] 实施实例2 测量最小杀菌浓度MBC值。
[0022] (1)营养肉汤的配制：取营养肉汤30g加1000 mL蒸馏水即得。使用前121°C高压 蒸汽灭菌20min待用。
[0023] (2)营养琼脂固体培养基的配制：取营养琼脂45g加1000 mL蒸馏水即得。使用前 121°C高压蒸汽灭菌20min待用。
[0024] (3)菌株的培养：操作于超净工作台上进行。吸取已灭菌的液体培养基10mL，放在 已灭菌的试管中，然后用接菌环挑取一个菌落，加到液体培养基中，放于培养箱内培养，细 菌培养24h，培养温度为28°C。
[0025] (4)菌液配制及计数：将培养后的菌液，釆用10倍稀释法用液体培养基稀释，并 用血球计数板在显微镜上初步观察计数，然后将菌液用液体培养基稀释，作为加入供试品 中的菌液。细菌采用平板计数法进行计数，将以上菌液用无菌生理盐水再稀释100倍，取 50yL，均匀涂于已铺有固体培养基的平皿中，培养24h，培养温度为28°C。培养后，单个活 细菌生长形成一个菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数；计算公式为：菌液浓 度=nX20X100cfu/mL。
[0026] (5)药品溶液的配制：称取化合物，加入灭菌生理盐水，摇勾，得均匀溶液，备用。存 放于4°C冰箱保存待用。
[0027] (6)最小抑菌浓度（MIC)与最小杀菌浓度（MBC)的测定：采用微量肉汤稀释法测定 最小杀菌浓度MBC (Minimal Bactericidal Concentration)。在MIC基础上，从每管吸取 10yL溶液，点于固体培养基上，继续按MIC培养条件下培养，以完全杀灭细菌的最低浓度 为最小杀菌浓度(菌落数小于等于5)。
[0028] 采用二倍稀释法将药液用无菌生理盐水将药液稀释系列浓度，0.5、1、2、4、8、16、 32、64、128和256 ^/1^，在96孔板上1~10行，每孔加100^不同浓度的药液和100 1^ 菌液，使最终菌液浓度为l~5X105cfu/mL，第11行以无菌生理盐水加菌液作为阳性对照， 第12行以不加菌液的无菌生理盐水为阴性对照，混匀后于28°C培养24h，以肉眼观察药物 最低浓度管中无细菌生长者为该试验药物的MIC。将上述未见生长细菌的各孔中的肉汤取 10yL接种于营养琼脂平板上，做好标记，于28°C培养24h，以仍无细菌生长的管内药物浓 度记为该药的MBC，每个实验重复三次。
[0029] 测得最小杀菌浓度MBC值为8 y g/mL。
【主权项】
1. 一种抑制菜豆细菌性萎蔫病菌生长的化合物，其特征在于： (1) 结构特征如下式所示：(2) 其可作为菜豆细菌性萎蔫病菌的抑制剂和杀菌剂； (3) 其对菜豆细菌性萎蔫病菌的最小抑菌浓度MIC值为4 μ g/mL ; (4) 其对菜豆细菌性萎蔫病菌的最小杀菌浓度MBC值为8 μ g/mL。
【专利摘要】本发明发现对菜豆细菌性萎蔫病菌具有抑菌和杀菌活性的化合物。其菜豆细菌性萎蔫病菌的最小抑菌浓度MIC值为4μg/mL，最小杀菌浓度MBC值为8μg/mL。
【IPC分类】A01N43/86, A01P1/00, C07D413/04
【公开号】CN105175403
【申请号】
【发明人】不公告发明人
【申请人】许自协
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年10月31日