一种从钝顶螺旋藻制备高纯度叶绿三酸的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及光动力学疗法天然光敏剂技术领域，尤其涉及一种第二代光敏剂叶绿三酸Chlorin e6的高效高纯度制备方法。
【背景技术】
[0002]叶绿三酸Chlorin e6及其衍生物属于光动力学疗法的第二代光敏剂。Chlorine6是源自叶绿素的天然分子，具有光激发三线态寿命长，在可见光的红区具有较高的摩尔吸光系数，与其他卟啉类光敏剂相比价格低廉，其研究应用处于临床试验阶段。
[0003]Chlorin e6 一般通过叶绿素a碱性水解转化获得，商品化的Chlorin e6的制备方法中涉及叶绿素的柱层析法分离提纯，叶绿素a的得率较低，获得的Chlorin e6纯度一般93%?98%。
[0004]本发明不需要采用柱层析法分离提纯叶绿素或叶绿三酸，无柱层析损失，叶绿素a利用效率高，最终获得的叶绿三酸Chlorin e6产率高。
[0005]钝顶螺旋藻是蓝藻的一种，本发明以钝顶螺旋藻为原料，制备的Chlorin e6不含叶绿素a以外的其它叶绿素转化的叶绿酸，HPLC纯度大于99.5%。
【发明内容】
[0006]本发明针对商品化叶绿三酸Chlorin e6产率和纯度较低的问题，提出了一种高效高纯度Chlorin e6的制备方法。
[0007]本发明采取的技术方案是:
[0008]本发明高纯度叶绿三酸Chlorin e6制备方法的具体步骤如下:
[0009]⑴以培养至对数生长期末期的钝顶螺旋藻为原料，离心收集藻体。
[0010]⑵藻体用乙醇萃取数次，萃取液合并。
[0011]⑶萃取液中加入适量石油醚(沸程60?90°C )混匀，再加入萃取液1/5?1/3体积的水，旋荡后进行反萃取，石油醚重复萃取数次，含色素的石油醚相用水一乙醇溶液(体积比1:1)洗涤数次。
[0012]⑷石油醚萃取液中加入lmol/L NaOH的95%乙醇溶液，搅拌反应0.5?6h。
[0013](5)往上述混合液中加入去离子水，旋荡后静置分离，上层石油醚相含有类胡萝卜素呈橙黄色，下层蓝绿色的水一乙醇溶液用石油醚洗涤数次，至洗涤液无色。
[0014](6)滴加5mol/L盐酸中和，离心分离沉淀，沉淀用去离子水洗涤数次。
[0015](7)沉淀用少量去离子水分散悬浮，_80°C速冻后冷冻干燥，获得叶绿三酸Chlorine6固体粉末。
[0016]⑶在上述步骤(6)中，5mol/L盐酸中和后，加入二氯甲烷溶剂萃取，萃取液用去离子水洗涤数次。
[0017](9)采用旋转蒸发的方法回收二氯甲烷，得到密实的叶绿三酸Chlorin e6固体。
[0018]本发明制备的Chlorin e6不含叶绿素a以外的其它叶绿素转化的叶绿酸，HPLC纯度大于99.5% ο
【附图说明】
[0019]图1为实施例4所得叶绿三酸Chlorin e6的结构图。
[0020]图2为实施例4碱催化反应后石油醚相类胡萝卜素溶液的吸收光谱。
[0021]图3为实施例4碱催化反应后水-乙醇相含镁叶绿三酸钠盐的吸收光谱。
[0022]图4为实施例4所得产品叶绿三酸钠盐乙醇溶液的吸收光谱。
[0023]图5为实施例4所得产品叶绿三酸乙醇溶液的吸收光谱图。
[0024]图6为实施例4所得产品的基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALD1-T0F)质谱图。基质中的三氟乙酸使得叶绿三酸带正电，分子离子峰([M+H]+)的质荷比m/z为597.541，与叶氯三酸的理论分子量596.67 一致。
【具体实施方式】
[0025]下面的实施例是对本发明的进一步描述。
[0026]实施例1
[0027]本发明的高纯度叶绿三酸Chlorin e6的制备方法的具体步骤如下:
[0028]取生长至对数生长期后期的钝顶螺旋藻藻液1L，离心分离藻体，弃去上清液，沉淀富集在I个离心管中，然后用50mL乙醇萃取三次，萃取液合并。
[0029]萃取液中加入20mL石油醚(沸程60?90°C )混匀，再加入萃取液1/3体积的水，旋荡后进行反萃取，石油醚重复萃取两次，含色素的石油醚相用20mL水一乙醇溶液(体积比1:1)洗涤两次。
[0030]石油醚萃取液中加入lmol/L NaOH的95%乙醇溶液10mL，搅拌反应0.5h。
[0031]往上述混合液中加入1mL水，旋荡后静置分离，上层石油醚相含有类胡萝卜素呈橙黄色，下层蓝绿色的水一乙醇溶液用石油醚洗涤两次。
[0032]滴加5mol/L盐酸中和至pH约为5，离心分离沉淀，沉淀用去离子水洗涤两次。
[0033]沉淀用少量去离子水分散悬浮，_80°C速冻后冷冻干燥，获得叶绿三酸Chlorin e6固体粉末。
[0034]实施例2
[0035]本发明的高纯度叶绿三酸Chlorin e6的制备方法的具体步骤如下:
[0036]取生长至对数生长期后期的钝顶螺旋藻藻液1L，离心分离藻体，弃去上清液，沉淀富集在I个离心管中，然后用40mL乙醇萃取三次，萃取液合并。
[0037]萃取液中加入15mL石油醚(沸程60?90°C )混匀，再加入萃取液1/3体积的水，旋荡后进行反萃取，石油醚重复萃取两次，含色素的石油醚相用0.5mol/L NaOH的水一乙醇溶液(体积比1:1) 15mL快速洗涤两次。
[0038]石油醚萃取液中加入lmol/L NaOH的95%乙醇溶液10mL，搅拌反应2h。
[0039]往上述混合液中加入1mL水，旋荡后静置分离，上层石油醚相含有类胡萝卜素呈橙黄色，下层蓝绿色的水一乙醇溶液用石油醚洗涤两次。
[0040]滴加5mol/L盐酸中和至pH约为5，离心分离沉淀，沉淀用去离子水洗涤两次。
[0041]沉淀用少量去离子水分散悬浮，_80°C速冻后冷冻干燥，获得叶绿三酸Chlorin e6固体粉末。
[0042]实施例3
[0043]本发明的高纯度叶绿三酸Chlorin e6的制备方法的具体步骤如下:
[0044]取生长至对数生长期后期的钝顶螺旋藻藻液1L，离心分离藻体，弃去上清液，沉淀富集在I个离心管中，然后用50mL乙醇萃取三次，萃取液合并。
[0045]萃取液中加入20mL石油醚(沸程60?90°C )混匀，再加入萃取液1/3体积的水，旋荡后进行反萃取，石油醚重复萃取两次，含色素的石油醚相用20mL水一乙醇溶液(体积比1:1)洗涤两次。
[0046]石油醚萃取液中加入lmol/L NaOH的95%乙醇溶液10mL，搅拌反应3h。
[0047]往上述混合液中加入1mL水，旋荡后静置分离，上层石油醚相含有类胡萝卜素呈橙黄色，下层蓝绿色的水一乙醇溶液用石油醚洗涤两次。
[0048]滴加5mol/L盐酸中和至pH约为5，加入二氯甲烧溶剂萃取，萃取液用去离子水洗涤数次。
[0049]采用旋转蒸发的方法回收二氯甲烷，得到密实的叶绿三酸Chlorin e6固体。
[0050]实施例4
[0051]本发明的高纯度叶绿三酸Chlorin e6的制备方法的具体步骤如下:
[0052]取生长至对数生长期后期的钝顶螺旋藻藻液1L，离心分离藻体，弃去上清液，沉淀富集在I个离心管中，然后用40mL乙醇萃取三次，萃取液合并。
[0053]萃取液中加入15mL石油醚(沸程60?90°C )混匀，再加入萃取液1/3体积的水，旋荡后进行反萃取，石油醚重复萃取两次，含色素的石油醚相用0.5mol/L NaOH的水一乙醇溶液(体积比1:1) 15mL快速洗涤两次。
[0054]石油醚萃取液中加入lmol/L NaOH的95%乙醇溶液10mL，搅拌反应6h。
[0055]往上述混合液中加入1mL水，旋荡后静置分离，上层石油醚相含有类胡萝卜素呈橙黄色，下层蓝绿色的水一乙醇溶液用石油醚洗涤两次。
[0056]滴加5mol/L盐酸中和至pH约为5，加入二氯甲烧溶剂萃取，萃取液用去离子水洗涤数次。
[0057]采用旋转蒸发的方法回收二氯甲烷，得到密实的叶绿三酸Chlorin e6固体。
[0058]尽管已经示出了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以根据上述说明对这些实施例进行改进或变换，而这些改进或变换都应属于本发明所述权利要求的保护范围。
【主权项】
1.一种制备叶绿三酸的方法，其特征在于，具体步骤如下: (1)以钝顶螺旋藻为原料，离心收集藻体，藻体用乙醇萃取数次，每次萃取10?30min，萃取液合并； (2)萃取液中加入石油醚混匀，再加入萃取液1/5?1/3体积的水，旋荡后进行反萃取，上层含色素的石油醚相用水一乙醇溶液洗涤数次； (3)石油醚萃取液中加入lmol/LNaOH的95%乙醇溶液，搅拌反应0.5?6h ; (4)往上述混合液中加入去离子水，旋荡后静置分离，上层石油醚相含有类胡萝卜素呈橙黄色，下层蓝绿色的水一乙醇溶液用石油醚洗涤数次，至洗涤液无色； (5)滴加5mol/L盐酸中和至微酸性，离心分离沉淀，沉淀用去离子水洗涤数次； (6)沉淀用去离子水分散悬浮，_80°C速冻后冷冻干燥，获得叶绿三酸Chlorine6固体粉末。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(5)中用5mol/L盐酸中和至微酸性后，加入二氯甲烷溶剂萃取，萃取液用去离子水洗涤数次。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤￠)中还包括采用旋转蒸发的方法回收二氯甲烷，得到密实的叶绿三酸Chlorin e6固体。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于:所述钝顶螺旋藻为培养至对数生长期末期的钝顶螺旋藻。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于:所述石油醚的沸程为60?90°C。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(2)中水一乙醇溶液的水与乙醇的体积比约为1:1。7.如权利要求1和2所述的方法，其特征在于:所述微酸性是指pH值的范围约为5?6o8.如权利要求1-7所述的方法，其特征在于:获得叶绿三酸Chlorine6固体粉末不含叶绿素a以外的其它叶绿素转化的叶绿酸，纯度大于99.5%。
【专利摘要】本发明公开了一种从新鲜钝顶螺旋藻制备高纯度叶绿三酸Chlorin？e6的方法，所述方法的步骤如下：(1)以乙醇为溶剂从钝顶螺旋藻中萃取色素，萃取液中加入适量石油醚混匀，再加水分相，旋荡后进行反萃取，用石油醚重复萃取数次；(2)石油醚相用水－乙醇溶液洗涤数次；(3)石油醚萃取液中加入NaOH的95％乙醇溶液，搅拌反应；(4)往上述混合液中加水，旋荡后静置分离，下层水－乙醇溶液用石油醚洗涤数次；(5)滴加盐酸中和至微酸性，离心分离沉淀或用二氯甲烷萃取，沉淀用少量去离子水分散悬浮后冷冻干燥，或二氯甲烷溶液旋转蒸发回收溶剂，即可获得高纯度的叶绿三酸Chlorin？e6固体。本发明制备的Chlorin？e6不含其它叶绿酸，HPLC纯度大于99.5％。
【IPC分类】C07D487/22
【公开号】CN105175425
【申请号】
【发明人】于道永, 李泉, 李富强, 吴晨露, 张宏玉, 葛保胜, 黄方
【申请人】中国石油大学(华东)
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年10月10日