一种鱼类肿瘤坏死因子家族蛋白的重组蛋白及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学领域，具体的说是一种鱼类（半滑舌鳎）肿瘤坏死因子家 族蛋白（CsTNF)的重组蛋白及其应用。
【背景技术】
[0002] 肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor, TNF)是一种重要的细胞因子，能调节脊 椎动物和无脊椎动物器官发育、组织修复、造血作用以及炎症反应等多个生理过程。肿瘤坏 死因子能够调控单核细胞、巨噬细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞和自然杀伤细胞的多种免疫 反应，诱导细胞增殖、凋亡和坏死。肿瘤坏死因子家族分为三类：TNF-a、TNF-和LT-0。 TNF-a是一个26kDa的膜蛋白，被金属蛋白酶水解后形成游离的约17kDa的激活蛋白。激 活形式的TNF-a与细胞表面的肿瘤坏死因子受体结合，发挥其免疫调控作用。目前，肿瘤 坏死因子已在多种鱼类中发现，但是其功能和应用性研究尚缺乏。
【发明内容】
[0003] 本发明目的在于提供一种鱼类肿瘤坏死因子家族蛋白（TNF-a型）的重组蛋白及 其应用。
[0004] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
[0005] -种鱼类肿瘤坏死因子家族蛋白的重组蛋白，鱼类肿瘤坏死因子家族蛋白CsTNF 重组蛋白为半滑舌鳎的肿瘤坏死因子家族蛋白CsTNF重组蛋白，其是以半滑舌鳎cDNA为模 板，用引物TNFFl和TNFRl进行PCR扩增肿瘤坏死因子家族蛋白CsTNF基因，扩增产物经 诱导表达、纯化即为重组蛋白，所述TNFFl为5' -GATATCATGAGGCAACATAATAGCTCACCT-3' ； TNFRl 为 5' -GATATCCAAGGCGAACACGCCGAAG-3'。
[0006] -种鱼类肿瘤坏死因子家族蛋白的重组蛋白的应用，所述半滑舌鳎的肿瘤坏死因 子家族蛋白CsTNF重组蛋白可应用于制备抑制细菌或病毒感染的制剂。
[0007] 所述抗感染的细菌为荧光假单胞菌；病毒为细胞肿大病毒。
[0008] 本发明具有如下优点：本发明的肿瘤坏死因子家族蛋白属于TNF-a型，能够显著 提高鱼类的抗细菌和抗病毒能力。
【附图说明】
[0009] 图1为本发明实施例提供的纯化的重组肿瘤坏死因子家族蛋白（命名为rCsTNF) 电泳图。泳道1，分子量标准；泳道2,肿瘤坏死因子家族蛋白rCsTNF。
【具体实施方式】
[0010] 下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而 非以任何形式对本发明进行限制。
[0011] 在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法：
[0012] 1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化、DNA片段从凝胶中回收皆使用"天根生化科技 (北京）有限公司"的相应试剂盒。
[0013] 2?大肠杆菌用Hanahan方法（SambrookandRussell:MolecularCloning:A LaboratoryMannual.ColdSpringHarborLaboratoryPress2001)〇
[0014] 3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于"纽英伦生物技术有限公司"，北京。
[0015] 实施例1
[0016] 肿瘤坏死因子家族蛋白重组蛋白rCsTNF的制备
[0017] 1)表达肿瘤坏死因子家族蛋白重组蛋白rCsTNF的质粒pCsTNF的构建：
[0018] 本发明的肿瘤坏死因子家族蛋白CsTNF属于TNF-a型，其序列已公布（GenBank accession number XP_008330028. I)：
[0020] 肿瘤坏死因子家族蛋白CsTNF由242个氨基酸组成，含有一个肿瘤坏死因子TNF 结构域，由81-242氨基酸残基组成。以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物TNFFl和TNFRl 进行PCR扩增肿瘤坏死因子家族蛋白CsTNF基因。PCR条件为：94°C 60s预变性模板 DNA,然后 94°C 40s，60°C 60s，72°C 6〇8,30个循环后再在72°(：延伸反应7 - 1〇111111。 PCR产物用天根的相应试剂盒纯化。将表达载体pET259(构建过程参见Hu YH，Zheng ffff, Sun L. Identification and molecular analysis of a ferritin subunit from red drum(Sciaenops ocellatus) ? Fish Shellfish Immunol 2010 ;28:678 - 86)用限制性内切 酶EcoRV酶切后回收5. 3kb片段，将其与上述纯化的PCR产物用T4DNA连接酶连接，连接液 转化入大肠杆菌DH5 a，在含卡那霉素（lOOug/ml)的LB培养基上培养18 - 24小时，筛选 转化子提取质粒，命名为pCsTNF。通过DNA测序分析证明了 pCsTNF为含有上述TNF结构域 的肿瘤坏死因子家族蛋白CsTNF序列的表达质粒。
[0021] 所述LB组成成分按重量百分比计：1.0%蛋白胨，0.5%酵母粉，1.0%氯化 钠，97. 5 % 蒸馏水。所述 TNFFl 为 5' -GATATCATGAGGCAACATAATAGCTCACCT-3' JNFRl 为 5' -GATATCCAAGGCGAACACGCCGAAG-3'。
[0022] 2)肿瘤坏死因子家族蛋白CsTNF重组蛋白的诱导表达和纯化
[0023] 将上述的质粒pCsTNF用常规方法转化大肠杆菌BL21(DE3)(购自于"天根生化科 技有限公司"，北京），在含有卡那霉素（50ug/ml)的LB固体培养基上培养18 - 24小时，挑 取转化子，将其命名为BL21/pCsTNF。将BL21/pCsTNF于含有卡那霉素（50ug/ml)的LB液 体培养基中过夜培养；取Iml过夜后的培养液，加入100mL新鲜的含有卡那霉素（50ug/ml) 的LB液体培养基中，于37°C下转速200rpm摇动培养至0D_为0. 6,加入终浓度为ImM的 IPTG，18°C继续以转速160rpm摇动培养12h，而后以5000g，4°C离心10min，收集菌液，加入 5ml裂解液，在室温于摇床上缓慢摇动1-2小时，直至菌悬液变澄清为止。将菌液以10000g， 4°C离心30min，回收上清。将上清中的蛋白用亲和层析柱His Trap HP Columns (购于美 国GEHealthcare公司）回收纯化。将纯化的蛋白经SDS-PAGE电泳检测（8v/cm电压下电 泳25 - 30min，随后15v/cm电压下电泳2 - 2. 5h)，测定其分子量大小（参见图1)。发现 它的蛋白质质量与肿瘤坏死因子家族蛋白CsTNF相同。
[0024] 所述裂解液为终浓度的IOmMNaH2P04、IOmMTris和8M尿素，pH8.0。
[0025] 实施例2
[0026] 肿瘤坏死因子家族蛋白CsTNF的抗菌作用
[0027] 将上述实施例1纯化的肿瘤坏死因子家族蛋白CsTNF蛋白在PBS中稀释至IOOug/ ml，即为CsTNF稀释液。在LB培养基中培养焚光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens) (保存于CGMCC，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为CGMCC No. 2329， 保藏单位地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2008年1月9 日）至OD 6。。为0.8,然后离心（5000g，4°C，10min)，收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度 为2X10 7cfu/ml，即为细菌悬液。将细菌悬液与CsTNF稀释液或PBS(对照）等体积（1 :1) 混合。将20条半滑舌鳎（重约13. 6g)随机分为2组，每组10条。将这2组分别命名为A 和B。将A组的每条鱼分别注射IOOul细菌+CsTNF稀释液，将B组（对照组）的每条鱼分 别注射IOOul细菌+PBS。在注射后第24h和48h，取A和B组鱼脾脏组织，在2ml PBS中匀 浆，将IOOul匀浆液涂布于LB平板。将平板置于28°C培养48h，计算出现的菌落数。结果 表明在24h和48h，A组鱼脾脏的细菌数（分别为1066和2133)显著（P〈0. 01)低于B组鱼 脾脏的细菌数（分别为3133和5133)
[0028] 这些结果表明，本发明的肿瘤坏死因子家族蛋白CsTNF能够显著增强鱼类抵抗细 菌侵染。
[0029] 所述PBS组成成分按重量百分比计：0. 8 %NaCl, 0. 02 %KC1, 0. 358 % Na2HPO4. 12H20, 0? 024%NaH2PO4,余量为水。
[0030] 实施例3
[0031] 肿瘤坏死因子家族蛋白CsTNF的抗病毒作用
[0032] 将细胞肿大病毒RBIV-Cl (具体制备方法见Zhang M, Xiao Z, Hu Y, Sun L. Characterization of a megalocytivirus from cultured rock bream, Oplegnathus fasciatus(Temminck&Schlege) ,in China. Aquae Res. 2012 ;43:55664)于 PBS 中稀释至 106copies/ml，即为病毒悬液。将上述实施例1纯化的CsTNF蛋白在PBS中稀释至IOOug/ ml，即为CsTNF稀释液。将病毒悬液与CsTNF稀释液或PBS (对照）等体积（1 :1)混合。将 20条半滑舌鳎（重约13. 6g)随机分为2组，每组10条。将这2组分别命名为C和D。将C 组的每条鱼分别注射IOOul病毒+CsTNF稀释液，将D组（对照组）的每条鱼分别注射IOOul 病毒+PBS。在注射后第6天和9天，取鱼脾脏组织。利用DNA提取试剂盒（购于天根生化 科技（北京）有限公司"）从组织中提取DNA，用绝对定量PCR法检测组织中病毒含量（具 体方法见上述参考文献）。结果表明，在第6天和9天，C组鱼脾脏的病毒数（分别为345 和117)显著（P〈0. 01)低于D组鱼脾脏的病毒数（分别为I. 2x IO5和8. 9x 10 5)。
[0033] 这些结果表明，肿瘤坏死因子家族蛋白CsTNF能够显著增强鱼类抵抗病毒的侵 染。
【主权项】
1. 一种鱼类肿瘤坏死因子家族蛋白的重组蛋白，其特征在于：鱼类肿瘤坏死因子家族 蛋白CsTNF重组蛋白为半滑舌鳎的肿瘤坏死因子家族蛋白CsTNF重组蛋白，其是以半滑舌 鳎cDNA为模板，用引物TNFFl和TNFRl进行PCR扩增肿瘤坏死因子家族蛋白CsTNF基因， 扩增产物经诱导表达、纯化即为重组蛋白，所述TNFFl为5'-GATATCATGAGGCAACATAATAGCTC ACCT-3'JNFRl为 5' -GATATCCAAGGCGAACACGCCGAAG-3'。2. -种权利要求1所述的鱼类肿瘤坏死因子家族蛋白的重组蛋白的应用，其特征在 于：所述半滑舌鳎的肿瘤坏死因子家族蛋白CsTNF重组蛋白可应用于制备抑制细菌或病毒 感染的制剂。3. 权利要求2所述的鱼类肿瘤坏死因子家族蛋白CsTNF重组蛋白的应用，其特征在于： 所述抗感染的细菌为荧光假单胞菌；病毒为细胞肿大病毒。
【专利摘要】本发明涉及分子生物学领域，具体的说是一种鱼类(半滑舌鳎)肿瘤坏死因子家族蛋白(CsTNF)的重组蛋白及其应用。鱼类肿瘤坏死因子家族蛋白CsTNF重组蛋白为半滑舌鳎的肿瘤坏死因子家族蛋白CsTNF重组蛋白，其是以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物TNFF1和TNFR1进行PCR扩增肿瘤坏死因子家族蛋白CsTNF基因，扩增产物经诱导表达、纯化即为重组蛋白，该肿瘤坏死因子家族蛋白能够显著提高鱼类的抗细菌或抗病毒能力。CGMCC NO.232920080109
【IPC分类】C07K14/525, A61P31/04, A61P31/20, A61K38/19
【公开号】CN105175529
【申请号】
【发明人】李墨非, 孙黎
【申请人】中国科学院海洋研究所
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年7月16日