一种大麦花药诱导培养基配方的制作方法

文档序号：12084539阅读：574来源：国知局

本发明涉及一种大麦花药诱导培养基配方，具体涉及一种可以显著提高大麦花药出愈率的花药诱导培养基配方，属于农业高新技术领域。

背景技术：

大麦系禾本科大麦属的一年生草本植物，有30多个种，只有普通大麦（horderm vulgare L.）一个种具有栽培价值，包括二棱、多棱和中间型大麦3个亚种。大麦栽培历史悠久，是第一个被驯化的谷类作物，远在新石器时代中期就已经是黄河上游的栽培作物，经历了几千年的自然进化和人工改良，以其适应性广、抗逆性强（包括耐寒、耐旱、耐盐碱等）、用途广泛而在全世界种植。作为工农业生产的重要谷类作物，全球现种植大麦6100多万hm²，总产量约1.7亿吨，面积和总产仅次于小麦、水稻、玉米，为第四大谷物。许多发达国家对大麦生产特别重视，这是与其发展啤酒工业和畜牧业，以提高人民生活质量相适应的。世界大麦面积分布依次为欧洲占50%以上，亚洲占20%～25%，美洲10%～15%，非洲占6%左右，大洋洲占5%左右。

我国近20年来啤酒工业发展迅速，现已成为世界第一啤酒生产大国，由于我国优质啤酒专用大麦品种选育研究滞后于啤酒工业的迅速发展，以及啤麦生产方式及设备等因素，我国的啤酒原料因质量问题而主要依赖进口。我国成为啤酒大麦的第一进口国，目前我国进口啤麦占世界啤麦进口贸易量的一半以上，占我国啤麦需求的60%左右。世界啤麦生产国（澳大利亚、加拿大、欧盟）均瞄准了我国的啤麦市场，制定了各种对策，而世界啤麦价格也因我国的旺盛需求而居高不下。目前，国内大型啤酒、麦芽企业的原麦主要依赖进口，这一现状长期地、严重地制约着我国啤麦生产和啤酒工业的稳定发展。由于全球啤酒工业的发展和大麦原料的紧缺，再加国外水、旱和病虫害的影响，大麦进口极不稳定，国内企业易受国外价格的冲击，我国啤酒业今后将面临涨价的压力。因此，努力实现啤酒原料国产化，对于促进我国啤酒工业的稳定发展具有十分重要的意义。

同时，大麦是一个优良的饲料作物，饲用价植不亚于玉米。在全球对大麦的需求中，饲料大麦的市场份额占到70%左右。我国南方各省饲料严重紧缺，每年从北方调入上千万吨玉米与豆粕等原料来弥补缺口，或直接以稻谷替代。在我国饲料工业中，近几年大麦型配合饲料所必需的β-葡聚糖酶等饲料添加剂的研制与生产已取得成功的突破，大麦型配合饲料开始在我国南方进入快速发展阶段。选育优质、高产饲料专用大麦新品种和建立饲麦生产基地等产业化网络，利用南方大片冬闲地、海涂盐碱地大力发展饲麦生产，对于解决我国南方地区饲料的供需矛质，促进该地区畜牧渔业的发展将发挥重大作用。尽管目前我国的大麦生产处于低谷阶段，但是从国内对大麦的巨大需求和充分利用我国有限的土地资源这两个重要的国情分析，我国的大麦生产应该和必将会得到迅速发展，大麦仍然是我国最具有发展潜力的谷物。

我国大麦育种工作起步较晚，在过去几十年的育种改良过程中，育种目标从提高产量到提升品质，有了很大的改变。除了常规育种方法如引种、选择育种、有性杂交育种、杂种优势育种、物理及化学诱变育种外，大麦植物组织培养育种和生物技术育种也得到了很大拓展。花药培养是利用植物组织培养技术，把发育到一定阶段的花药。通过无菌操作接种在培养基上，在一系列条件诱导下改变花药的发育程序，进行有丝分裂，经过脱分化后形成细胞团，进而形成愈伤组织，经历再分化发育成完整的单倍体植株的过程。现在花药培养集成了杂交育种、诱变育种、细胞学、遗传学等各种生物科学的内容，是育种学发展的趋势之一，利用花药培养可以明显的加快育种进程、缩短育种年限。

大麦花药培养最早于1973年获得成功，随后人们在供体植株生长条件、花药预处理方法、培养基成分和培养条件等进行了一系列的研究，使培养效率有了较大的提高，我国研究者利用花药培养技术育成了品种“单二”和“花30”和一些高产优质新品系，但大麦的花药培养诱导单倍体的方法和培养基还不完善，限制了该技术在大麦遗传改良中的广泛应用。培养基是花药培养的物质基础，直接关系到培养物的生长与分化，培养基组分是影响花培成功的一个很重要的因素，多种禾本科作物花培实验表明：培养基各组分的合适用量，以及它们之间一定的组合关系，可显著影响花培效率，发现和优化组合花药培养有机附加物质，可进一步提高花药培养力。

在花药程序中，愈伤组织的诱导培养是大麦花药培养过程的第一步，也是重点和难点，而花药愈伤组织诱导的频率和质量直接决定着花药培养的成败。因此，组合和优化培养基组分，摸索出实用的花药诱导培养基配方是实现大麦花药诱导培养的关键。通过多年大麦花药培养的摸索和实践，我们进一步优化了基本培养基配方，并且不断尝试加入一些提高大麦花药诱导力的有机添加物并组合其种类搭配及浓度，最终摸索出了一种大麦花药高效诱导培养基配方，进一步提高了大麦花药培养的效率。我们的研究结果对大麦单倍体育种和大麦花药培养技术在遗传转化中的应用具有较大的实用价值。

技术实现要素：

本发明提供了一种大麦花药诱导培养基，该培养基的配方如下：

KNO₃ 900～1100mg/L，NH₄NO₃ 900～1100mg/L，谷氨酰胺 500～700mg/L，Ca(NO₃)₂∙4H₂O 330～360mg/L，KH₂PO₄ 270～330mg/L，KCl 60～70mg/L，MgSO₄∙7H₂O 30～40mg/L，Na₂-EDTA 35～40mg/L，FeSO₄∙7H₂O 26～30mg/L，MnSO₄∙4H₂O 4.0～5.0mg/L，ZnSO₄∙7H₂O 1.2～1.8mg/L，H₃BO₃ 1.4～1.8mg/L，KI 0.7～0.9mg/L，甲基磺酸乙酯 0.35～0.45mg/L，肌醇 90～110mg/L，甘氨酸 1.8～2.2mg/L，丙氨酸 1.4～1.6mg/L，叶酸 0.25～0.35mg/L，维生素B1 0.09～0.11mg/L，维生素B6 0.09～0.11mg/L，烟酸 0.45～0.55mg/L，蔗糖 45～55g/L，琼脂 7～8g/L；

2，4-D 1.8～2.2mg/L，NAA 0.45～0.55mg/L，复酞核酸0.45～0.55mg/L，水解蛋白 0.25～0.35g/L，植物硫化激动素PSK-α 23～27pmol/L，胰岛素 3.5～4.5mg/L，生物素 0.18～0.22mg/L，PH 5.6～6.0。

本发明所述的培养基具有显著提高大麦花药出愈率的优点，从而大大提高了大麦花药培养的效率。下面的实施例以及对比实验可以清楚地反映本发明所述培养基的特点。

具体实施方式

实施例1

配制如下配方的培养基：

KNO₃ 1000mg/L，NH₄NO₃ 1000mg/L，谷氨酰胺 600mg/L，Ca(NO₃)₂∙4H₂O 345mg/L，KH₂PO₄ 300mg/L，KCl 65mg/L，MgSO₄∙7H₂O 35mg/L，Na₂-EDTA 37.5mg/L，FeSO₄∙7H₂O 27.5mg/L，MnSO₄∙4H₂O 4.4mg/L，ZnSO₄∙7H₂O 1.5mg/L，H₃BO₃ 1.6mg/L，KI 0.8mg/L，甲基磺酸乙酯 0.4mg/L，肌醇 100mg/L，甘氨酸 2.0mg/L，丙氨酸 1.5mg/L，叶酸 0.3mg/L，维生素B1 0.1mg/L，维生素B6 0.1mg/L，烟酸 0.5mg/L，蔗糖 50g/L，琼脂 7.5g/L；

2，4-D 2.0mg/L，NAA 0.5mg/L，复酞核酸0.5mg/L，水解蛋白 0.3g/L，植物硫化激动素PSK-α 25pmol/L，胰岛素 4.0mg/L，生物素 0.2mg/L，PH 5.8。

选取大麦品种甘啤3号和金川3号作为花药培养供体，供体材料于2011年秋季大田播种，2012年春季取中部小花小孢子发育处于单核靠边期的花药接种，从大田采取供体材料的主茎穗和大分蘖穗，用75%的酒精灭菌，在超净台上取中部花药分别接种于诱导培养基上，每瓶接种40枚花药，放置于暗培室，27℃培养30～40 d后长出愈伤组织后计算愈伤组织诱导率，然后转移入分化培养基。

实施例2

配制如下配方的培养基（谷氨酰胺添加浓度的优选）：

KNO₃ 1000mg/L，NH₄NO₃ 1000mg/L，Ca(NO₃)₂∙4H₂O 345mg/L，KH₂PO₄ 300mg/L，KCl 65mg/L，MgSO₄∙7H₂O 35mg/L，Na₂-EDTA 37.5mg/L，FeSO₄∙7H₂O 27.5mg/L，MnSO₄∙4H₂O 4.4mg/L，ZnSO₄∙7H₂O 1.5mg/L，H₃BO₃ 1.6mg/L，KI 0.8mg/L，甲基磺酸乙酯 0.4mg/L，肌醇 100mg/L，甘氨酸 2.0mg/L，丙氨酸 1.5mg/L，叶酸 0.3mg/L，维生素B1 0.1mg/L，维生素B6 0.1mg/L，烟酸 0.5mg/L，蔗糖 50g/L，琼脂 7.5g/L；

2，4-D 2.0mg/L，NAA 0.5mg/L，复酞核酸0.5mg/L，水解蛋白 0.3g/L，植物硫化激动素PSK-α 25pmol/L，胰岛素 4.0mg/L，生物素 0.2mg/L，PH 5.8。

谷氨酰胺的添加浓度设置以下5种：0；200mg/L；400mg/L；800mg/L；1000mg/L。