纳米几丁质在提高烟草产量和品质方面的应用的制作方法与工艺

本发明属于烟草技术领域，具体涉及一种新型生物纳米材料纳米几丁质在烟草生产上的应用，尤其是纳米几丁质在提高烟草产量和品质方面的应用。

背景技术：
生物纳米材料被公认为是21世纪最有前途的科研领域，是国际生物技术领域的前沿和热点学科，纳米技术正在引发着一场新的产业技术革命。纳米科技与农业技术的相互渗透，也催生了农业纳米科技等新兴学科，为农业科学提供新的理论、方法和技术手段，必将对未来农业的发展产生广泛而深远的影响。纳米材料有着特殊的四大效应：表面效应、体积效应、量子效应和宏观量子隧道效应。这些特殊的效应使纳米材料具有传统材料所不具备的奇异或反常的物理、化学特性。几丁质（chitin，结构式如下左所示）是广泛存在于自然界的可再生多聚物，主要的来源为虾、蟹、昆虫等甲壳类动物的外壳与软体动物的器官（例如乌贼的软骨），以及真菌类的细胞壁等。其蕴藏量在地球上的天然高分子中占第二位，估计每年自然界生物的合成量可达1×1011吨，仅次于纤维素。自然条件下，几丁质不溶于水，也不溶于酸或有机溶剂，因此很难被有效利用。壳聚糖（chitosan,结构式如下右所示）是几丁质的衍生物，在特殊条件下，对几丁质进行降解和脱酰反应得到的。壳聚糖是可以溶解在弱酸中的。在弱酸中，壳聚糖上的氨基质子化后即成为带正电荷的聚合物，从而具有生物活性，被广泛的应用于医药、植物病虫害防治等领域。和纤维素一样，天然几丁质也是以纤维状形式存在，通过分子间和分子内的氢键将N-乙酰葡萄糖分子紧密结合在一起，形成具有晶体和非晶体两种结构的几丁质纤维。几丁质的晶体结构有三种，即α，β和γ型。不同来源的几丁质，其化学结构和性质不同。虾壳外壳主要是α-型，鱿鱼的羽状壳主要是β-型，真菌细胞壁的几丁质主要是γ-型（结晶度较低）。α-型，β-型几丁质最丰富，且结晶度高，最稳定，不易熔化，不易溶解，同时也不易溶于一般有机溶剂。α-型几丁质资源最丰富，易于工业化生产。纯净几丁质的制作工艺比较简单，目前生产上常用的方法是将原料（虾壳或蟹壳）经过脱蛋白、脱盐、脱色素、漂白、烘干研磨得到几丁质。传统工艺生产壳聚糖是化学脱酰反应或水解法，其原理是通过水解破坏几丁质的非晶体区域，使分子键断裂，分子链中部分N-乙酰葡萄糖脱酰，提高亲水性。但是化学脱酰或水解法反应条件要求较高，不宜控制，且反应时间较长，耗能，环境污染。利用酶解法可以解决这些问题，包括使用甲壳素酶，壳聚糖酶和溶菌酶进行水解。但是此类酶价格昂贵且不易获得，造成产品成本过高。盐酸水解是常用的方法制备纳米几丁质。α-型几丁质经酸水解可生产大小为150－800nm长，宽5－70nm的几丁质纳米颗粒。本发明是采用3MHCl,按1:300的比例在85-90oC条件下水解2小时。其产物经透析、超声处理获得粒度为100-150nm长，宽度15-30nm宽的几丁质纳米晶须，综合表面电荷密度为33mmol/kg。由于几丁质的天然性质和独特的分子结构，越来越受到科学界的重视。大量研究表明，几丁质除了具有无毒、生物相容、生物可降解性等性能外，几丁质的衍生物（壳聚糖）在农业生产中可用作病虫害防治、种子包衣、水果和蔬菜的涂层，也可以提高植物生长，诱发植物抗性和提高植物免疫力的作用。纳米几丁质除了继承几丁质的基本性质外，还有很高的比表面积、高结晶度和聚阳离子的性质，被视为综合性能优异的天然高分子材料。利用水解制备的纳米几丁质，比表面积较大且携带一定量的聚阳离子，其纳米颗粒比一般壳聚糖具有更显著的生物活性。经毒理检测，0.3%纳米几丁质水悬浮剂对雄性和雌性大鼠的急性径口LD50均大于5000mg/kg.BW,急性经皮LD50均大于2000mg/kg.BW,对其他生物基本无毒。有研究表明纳米二氧化钛、多层碳纳米管、金属纳米颗粒以及以纳米材料为基础的纳米感应器等等，这些材料在农业上均有应用，然而有着良好生物特性和应用价值的纳米几丁质在烟草上的应用还没有被系统研究。烟草是我国重要的经济作物，而病虫害是影响我国烟草产量和品质的重要因素。对这些病虫害的治理，化学防治是生产上采用的主要措施之一，但是广泛、大量和长期使用化学农药造成了烟叶农药残留增加，病虫的抗药性增强和再度猖獗，即“三R”问题。研究表明，目前有近70种可能干扰人体内分泌的化学物质，其中农药就有40余种。近年来由于使用农残超标的蔬菜、水果等食品而引起农药中毒的事件屡见不鲜。烟草虽然不能被直接食用，但是很多国家依然把烟草划为食品类或准食品类，作为吸食品，烟草在燃烧过程中发生大量复杂的化学反应，产生许多新的化学物质，残留的农药也会参与其中。农药残留指标已成为各国烟草及烟草制品质量控制中的重要内容。因此现代农业迫切需要高效、环境友好的新型制剂取代或减少化学和肥料的使用。

技术实现要素：
本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种纳米几丁质在提高烟草产量和品质方面的应用。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：纳米几丁质在提高烟草产量和品质方面的应用。具体的，可以用0.001－0.02%纳米几丁质水悬浮液处理烟草种子，以提高烟草种子的发芽势。具体的，可以用0.001－0.01%纳米几丁质水悬浮液处理苗床期烟草幼苗，以提高烟草幼苗的长势。具体的，可以用0.001－0.005%纳米几丁质水悬浮液对移栽后的烟草幼苗进行灌根，以提高烟草的株高、茎粗、叶片数及叶面积。具体的，可以将0.001－0.005%纳米几丁质水悬浮液和36%甲基硫菌灵混用处理移栽后的烟草幼苗，以提高烟草的植物学性状，如株高、茎粗、叶片数及叶面积等，同时可以降低化学农药的施加量。具体的，可以将0.002%纳米几丁质水悬浮液和甲霜灵·锰锌混用处理移栽后的烟草，以提高对烟草根腐病的防效，同时降低化学杀菌剂的用量。本发明利用新型生物纳米材料纳米几丁质来提高烟草的产量与品质，以及利用其与常用杀菌剂的协同增效作用来防治烟草根茎病害，从而解决了大量使用化学制剂、农药、化肥等已造成病虫害抗性增加、土壤退化、环境污染、农产品农药残留超标等重大社会问题。和现有技术相比，本发明的有益效果：1）本发明纳米几丁质为一种环境友好型的纳米制剂-水悬浮液，无需任何有机或无机助剂；2）在烟草上超低用量应用既能提高作物的植物学性状，增产提质，又能减少对土壤、水以及环境的影响；3）和常用杀菌剂混用可以提高防病效果，同时降低杀菌剂的用量，降低农药残留，大幅度减少对人和环境的破坏和污染；4）对使用者的技术要求不高，并能省时、省工、省力，符合当前农村社会经济现实；5）具有提供养分、改良土壤和防治作物病虫害的多种功能；6）主要采用农业废弃物生产纳米材料，可以促进农业废弃物资源的循环利用。附图说明图1为纳米几丁质水悬浮液对苗床期烟草幼苗生长的促进作用；图2为纳米几丁质水悬浮液对烟草植物学性状的影响；图3为纳米几丁质水悬浮液和36%甲基硫菌灵混用对烟草植物学性状的协同增效作用；图4为纳米几丁质水悬浮液和甲霜灵·锰锌混用对防治烟草病害的协同增效作用；图5为本发明纳米几丁质的透射电镜图，图中可以看出，几丁质纳米颗粒为晶须结构，粒度在100-150nm长，15-30nm宽。具体实施方式以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。下述实施例中，所用的纳米几丁质经如下方法获得：本发明采用3MHCl，按原料几丁质（Sigma-Aldrich,C9213-1KG）和3M盐酸的重量体积比1g：300mL将两者混合，在85－90℃条件下水解2小时。水解结束后，产物用再生纤维素透析膜（MWCF12－14KDa）在去离子水中常温下透析，以释放游离的酸至析出液中的pH稳定。透析后的产品在0℃条件下，超声处理3－10分钟，然后在4℃条件下高速（12000rpm）离心15分钟，去除沉淀后，即获得粒度为100－150nm长，宽度15－30nm宽的几丁质纳米晶须水悬浮液（见图5），其纳米粒子的综合表面电荷密度为33mmol/kg。经急性毒理测定，纳米几丁质水悬液对雌性和雄性大鼠的急性径口LD50均大于5000mg/Kg.BW，急性经皮LD50大于2000mg/Kg.BW。因此可以作为新型烟草辅助剂。将上述制备所得的纳米几丁质配制成质量浓度0.002%、0.004%、0.006%、0.008%、0.01%的纳米几丁质水悬浮液进行下述应用试验。下述实施例以烟草品种中烟100为例，进行相关试验。实施例1纳米几丁质处理烟草种子提高种子发芽势室内用0.002－0.01%的纳米几丁质水悬浮液培养烟草种子，和清水对照相比，纳米几丁质可以显著提高烟草种子发芽势（P<0.05）（表1）。具体方法：室内选取充实、饱满的种子置于离心管中，用蒸馏水洗若干次后备用。用纳米几丁质处理烟草种子，观察种子的萌发动态。分别将等体积的0.002%、0.004%、0.006%、0.008%、0.01%(wt/v)纳米几丁质水悬浮液加入到垫有两层滤纸的培养皿中。试验以去离子水作对照。每个处理3个重复，每个重复100粒烟草种子。将培养皿放入PQX型多段可编程人工气候箱中（温度为27℃，相对湿度为60%，光照时间12h），每隔24h补充对应的等量的纳米几丁质悬浮液。纳米几丁质对烟草种子发芽势影响的调查方法：每隔12h记录观察种子的发芽情况，以胚根达到种子长度为发芽。发芽势定义为：发芽最多的当天和之前的所有发芽的种子数量。表1：纳米几丁质对烟草种子发芽势的影响注：表中大写英文字母代表差异显著水平，P<0.01；小写英文字母代表差异显著水平，P<0.05。实施例2纳米几丁质提高苗床期烟草幼苗的长势室内用0.001－0.01%纳米几丁质处理苗床期烟草幼苗，和清水对照相比，纳米几丁质对苗床期幼苗的生长有促进作用（见图1），不同的处理方法对幼苗的生长影响不同。具体方法：通过整株喷施和根施两种方式，分别用0.001%、0.003%、0.005%、0.01%纳米几丁质处理苗床期生长情况一致的烟草幼苗，30天后观察幼苗的长势。喷施标准：叶面液滴均匀饱和为止，每株3－4ml：根施标准：每穴10ml。每个处理5个重复。实施例3纳米几丁质对烟草株高、茎粗、叶片数及叶面积的影响在田间自然条件下，分别用0.001%、0.005%的纳米几丁质水悬浮液对移栽后的烟草幼苗进行灌根（100mL/株），按正常烟草生长管理和追肥。试验结果见表2和图2。经试验处理后的烟草在株高、茎粗方面比空白对照高出16%以上，叶面积比对照高出33.76%以上，且0.001%的纳米几丁质促进植物生长的效果比0.005%的纳米几丁质更好（图2）。经spss软件分析可得到处理后的烟草在株高、茎粗、叶片数和叶面积上和对照达到显著性差异（表2）。表2：纳米几丁质对烟草植物学性状的影响结果注：表中大写英文字母代表差异显著水平，P<0.01；小写英文字母代表差异显著水平，P<0.05。实施例4纳米几丁质和36%甲基硫菌灵混用对烟草植物学性状的协同增效作用在自然条件下，分别用常量杀菌剂（36%甲基硫菌灵800倍）、0.001%、0.005%纳米几丁质水悬浮液、以及纳米几丁质和常量、减量25%、减量50%的杀菌剂混合处理移栽后的烟草幼苗，田间按正常烟草生长管理和追肥，试验结果见表3和图3。经试验发现：与空白对照相比，0.001－0.005%纳米几丁质和杀菌剂（常量、减量25%、减量50%）混合处理的烟草在株高、茎粗、叶片数和叶面积方面达到了显著差异（P<0.05）。表3：纳米几丁质和杀菌剂的协同增效作用结果备注：T-0-0：空白对照；T-0-1：36%甲基硫菌灵；T-1-0：0.001%纳米几丁质水悬浮液；T-1-1：0.001%纳米几丁质水悬浮液和36%甲基硫菌灵常量混用；T-1-2：0.001%纳米几丁质水悬浮液和36%甲基硫菌灵减量25%混用；T-1-3：0.001%纳米几丁质水悬浮液和36%甲基硫菌灵减量50%混用；T-5-0：0.005%纳米几丁质水悬浮液；T-5-1：0.005%纳米几丁质水悬浮液和36%甲基硫菌灵常量混用；T-5-2：0.005%纳米几丁质水悬浮液和36%甲基硫菌灵减量25%混用；T-5-3：0.005%纳米几丁质水悬浮液和36%甲基硫菌灵减量50%混用实施例5纳米几丁质和甲霜灵·锰锌混用对防治烟草病害的协同增效作用在自然条件下，分别用0.002%纳米几丁质水悬浮液、杀菌剂常规用药量（甲霜灵·锰锌，1.5公斤/公顷）、以及纳米几丁质水悬浮液和减量25%、减量50%的甲霜灵·锰锌混用处理移栽70天后的烟草，田间按正常烟草生长管理和追肥。试验结果见表4和图4。经试验发现：纳米几丁质对甲霜·锰锌的协同增效作用显著，甲霜灵·锰锌常规用药量与纳米几丁质混用防治效果为62.57%，是单独使用甲霜灵·锰锌防治效果的1.13倍；甲霜灵·锰锌减量25%与纳米几丁质混用防治效果为56.45%，与单用甲霜·锰锌防治效果间不存在显著性差异；单独使用纳米几丁质对烟草镰刀菌根腐病也具有一定的防治作用，防效为24.26%；甲霜·锰锌减量50%与纳米几丁质混用防治效果极显著下降，防效为14.07%（表4）。表4：纳米几丁质和杀菌剂对防治烟草根腐病的协同增效作用结果备注：CK：72%甲霜·锰锌常规用药量；处理二：72%甲霜·锰锌常规用药量+纳米几丁质；处理三：72%甲霜·锰锌常规用药量的75%+纳米几丁质；处理四：72%甲霜·锰锌常规用药量的50%+纳米几丁质；处理一：纳米几丁质；CK0：清水对照。综上可以看出：本发明纳米几丁质生物材料可以促进烟草生长，防治病害、减少化学农药的用量，降低农用化学品使用对环境的污染。如果将纳米材料抗菌促生长以及改善环境的特点与纳米材料胶结或包膜缓/控释杀菌剂相结合，研制出多功能的纳米杀菌剂，可以降低化学农药以及生长调节剂的施用，减少土壤对其吸附，减轻土壤和地下水的污染，改善土壤物理化学结构，提高土壤和作物对养分的利用率。