本发明属于植物组培技术领域，具体涉及一种金丝4号枣的组培快繁方法。
背景技术：
“金丝4号”枣是山东省果树研究所1990年从金丝2号自然杂交的实生枣树中选育出的优良单株。具有果大、整齐、含糖高、品质优、抗病、抗裂果、结果早、极丰产、抗逆、适应性强等优点。金丝4号枣果实近长筒形，两端平，中部略粗。平均果重10～12克，整齐度高。果肩平而略斜，无明显梗洼，环洼中等深宽，果尖微凹，果面光滑，光亮艳丽，果皮细薄富韧性，白熟期浅绿白色，着色后呈浅棕红色。果肉白色，质地致密脆嫩，汁液较多，味极甜微酸，无苦辣草辛等杂味，口感极佳。皮薄肌丰，核小肉厚，清香甘甜，既可以鲜食，又可以制干，以其优异的品质和丰富的营养备受消费者欢迎。“金丝4号”枣具有早实、丰产、抗逆性强的特点，是我国南方丘岗山地开发极具发展前途的树种，已经成为我国南方地区主栽枣品种。
目前，在实际栽培中，“金丝4号”枣大多采用根蘖苗分株、扦插和嫁接等方法进行繁育，利用根孽分苗繁殖，需与嫁接繁殖相结合，不仅费工费时，成苗率较低，且易侵染各种植物病毒，而且采用根蘖苗分株、扦插和嫁接等方法进行繁育繁殖率很低，生长速度慢，弱病苗比例高，不能进行周年生产，远远不能满足市场的大量需求。因而影响了其大面积的推广。在此形势下，采用枣树组织培养技术则成了快速培育良种苗木的有效途径。组织培养（Tissue Culture）是在无菌条件下，分离并在培养基中培养离体植物组织的技术，用组织培养方法快速繁殖，具有整株的遗传一致性，生长健壮，根系发达、移栽成活率高，果品品质好，产量高等优点。
枣树的组织培养研究始于 2O 世纪 70 年代末，迄今为止，已有20多个品种以不同类型外植体建立了无菌离体繁殖体系。对于枣树的组培方法也有相关文献报道，如：1、【题名】毛叶枣组培快繁技术研究 【作者】续九如，李春立，孙建设【出处】北京林业大学学报，2003,25（3）【摘要】利用组织培养技术对毛叶枣的组培快繁技术进行了研究。证明3、4月是1年内采集外植体的最佳时期，在此阶段对外植体进行培养时，有效萌芽率最高。以MS为基本培养基筛选出适合毛叶枣组培各阶段的适宜激素浓度和配比 ，分别为：启动培养基 MS+6-BA 0.8 mg/L+IBA 0.4mg/L；增殖培养基MS+ 6-BA 1.2 mg/L+IBA 0.5mg/L；生根培养基1/2MS+IBA 3.0mg/L并阐明了继代次数与增殖系数和生根率的关系，提出毛叶枣继代次数以8代左右为宜，8 代之后 应进行生根培养。2、【题名】酸枣组培快繁研究【作者】代丽，刘孟军，王玖瑞，周俊义【出处】河北农业大学学报，2005,28（2）【摘要】:以休眠芽为试材 ，建立了酸枣的组培快繁体系。最适启动培养基为MS+ BA1.0+ IBA0.1或 MS+BA2.0+NAA0.1，增殖培养基为MS+BA2.0-3.0，萌芽率和壮芽率均超过了70％。增殖培养时，下部茎段的出芽率高于上部茎段 ，但萌发壮芽的比率则以上部茎段相对较高。1/2 MS+IBA0.5-1.0是酸枣快繁生根培养的适宜培养基，生根率最高可达92％。迄今为止，人们在枣树的组培研究方面已取得了一些成就，运用组培繁殖枣树优良品种的技术已逐步应用到生产中，但是，枣的组织培养较困难，成本较高，不同品种间的繁殖条件差异较大，不同品种的枣树的组培方法也不一样。目前，在“金丝4号”枣的繁育上，由于采用传统的根蘖苗分株、扦插和嫁接等方法进行繁育，存在着繁育繁殖率很低，生长速度慢，远远不能满足市场的大量需求等问题；因此，开发一种针对“金丝4号”枣的组培快繁方法进行培养繁殖，能够促进优良遗传材料的快速繁殖，实现 “金丝4号”枣树的大量繁殖和快速推广，是解决市场需求等问题的有效方法。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种操作简便，生产成本低，生根率高，繁殖率高，可应用于大规模商品化育苗的金丝4号枣的组培快繁方法，采用该方法能有效、方便的在短时间内获得大量金丝4号枣组培苗，而且所获得的组培苗成活率高，适合广西喀斯特地貌山区种植。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种金丝4号枣的组培快繁方法，包括以下步骤：
(1)外植体的建立：于3月初，剪取16-18cm长、当年生优质粗壮的根蘖条，用自来水冲洗10分钟后，于质量浓度为0.4%洗衣粉溶液中浸泡10-13分钟，再用自来水冲洗干净，然后将洗净后的根蘖条置于培养室中水培培养，每22-26小时换一次水，培养温度为27-28℃，光照时间17-19h/d，光照强度2000～3500lx，培养至长出2～3cm的水培芽后，取出根蘖条，清洗、消毒后剪取水培芽作为外植体；
（2）启动培养：将水培芽转入经高温灭菌的启动培养基中，诱导不定芽的萌发，培养条件为温度 25～28 ℃ ,光照强度为2000-2500lx，光照时间16-17h/d，在培养室中无菌培养，新芽萌发之后，将其转接到分生培养基中培养，在光照强度为2000-2200lx，光照时间14-16h/d，温度为27℃的条件下，培养40-45天；
（3）继代培养：将植株茎段转接入经消毒后的继代培养基中培养，在培养温度为25-26℃，光强 2000～25O0lx，光照时间为15h/d的条件下培养32-34d；
（4）生根培养：在无菌条件下，剪取长2-2.5cm继代培养得到的带叶茎段，插入生根培养基中进行生根培养；培养温度 26～28℃，光强1800～20001x，光照时间14-16h/d；
（5）炼苗：当经过生根培养后的生根试管苗根长1.0～2.0 cm时，将组培苗进行室内炼苗，炼苗温度为：27-28℃，光照强度为4000-6000lx，室内瓶炼4-6天后，敞口炼苗5-7天；
（6）移栽：取出试管苗，洗净根上的培养基，移栽到用质量浓度为0.2%KMnO4溶液消毒过的椰糠+蛭石+细河沙按照2-3:5:1的比例做基质的营养杯中，浇足水，保持空气湿度为85％-90%，温度 25～26℃，避免阳光直射， 35-38 天后，移出温室进行全光照炼苗5-6d，及时浇水，然后移栽大田。
所述的金丝4号枣的组培快繁方法，步骤（1）中培养至长出2～3cm的水培芽后对根蘖条清洗消毒的具体步骤为：取出根蘖条，用75%的酒精浸泡35s，无菌水冲洗3-4次，沥干水分，放到质量浓度为0.1%HgCL2溶液中浸泡消毒7分钟，然后用无菌水冲洗7-8次，用镊子夹取清洗好的茎段，放置在灭菌的接种碟上，用灭菌过的滤纸吸干表面水分，剪取水培芽作为外植体。
所述的金丝4号枣的组培快繁方法，步骤（2）中的启动培养基的成分为：MS+ N6苄基腺嘌呤（6-BA) 1.2mg/L +萘乙酸（NAA）0.15～0.25mg/L +3.5%糖蜜+琼脂6g/L，培养基pH 值为 6.0-6.3。
所述的金丝4号枣的组培快繁方法，步骤（2）中的分生培养基的成分为：MS+ N6苄基腺嘌呤（6-BA) 2.2mg/L+萘乙酸（NAA）0.5mg/L +维生素C 1.6-1.8mg/L+谷氨酸1.7 ～ 2.0mg/L +3.5%糖蜜+琼脂7g/L，培养基pH 值为6.0。
所述的金丝4号枣的组培快繁方法，步骤（3）中继代培养基的成分为：MS+ N6苄基腺嘌呤（6-BA) 2.2mg/L+萘乙酸（NAA）0.5-0.6mg/L +维生素C 0.7-0.9mg/L+维生素B2 1.5-1.8mg/L+谷氨酸1.7～2.0mg/L +3.5%糖蜜+琼脂8g/L, 培养基pH 值为6.1。
所述的金丝4号枣的组培快繁方法，步骤（4）中生根培养基的成分为：1/2MS+ NAA 0.05mg/L+ IAA0.15 mg/L+IBA 0.7～1.0 mg/L+5%糖蜜+琼脂8g/L, pH=6.0-6.2。
本发明的有益效果为：
1、本发明是一种针对“金丝4号”枣的组培快繁方法，针对“金丝4号”枣品种进行的研究，经过不断试验，得到了最适合该枣树组培快繁所用的各种培养基，本发明的培养基所采用的碳源为糖蜜（糖厂蔗糖生产分离出来的不结晶的含糖液体），代替了常用的蔗糖，不仅降低了培养基的成本，而且糖蜜富含营养成分，含有各种单糖、粗蛋白质和矿物质，更容易被植物利用。本发明分生培养基和继代培养基中都加入了谷氨酸，谷氨酸不仅能提供有机氮源，同时也对植物体的生长及不定芽，不定胚的分化起促进作用，而且能够被植物细胞很快吸收；在培养基中加入的维生素C 和维生素B2，能增强培养基的营养，利于外植体的生长发育。
2、本发明的金丝4号枣的组培快繁方法可以解决采用传统繁育方法存在的繁殖率很低，生长速度慢等问题，采用本发明的金丝4号枣的组培快繁方法能够极大地提高金丝4号枣的繁殖速度，降低弱苗、病苗的发生比例，加速了新品种的快速推广和开发利用；采用该方法对金丝4号枣进行进行培养繁殖，能够促进优良遗传材料的快速繁殖，实现 “金丝4号”枣树的大量繁殖和快速推广，解决市场的需求。
3、本发明的金丝4号枣的组培快繁方法操作难度低、生产成本低，生根率高达88%以上，生产的组培苗成活率高，易于在大范围内推广使用，采用本发明的金丝4号枣的组培快繁方法可以获得大量整齐一致，遗传性状稳定的再生植株，试验结果稳定，重复性良好，可应用于大规模商品化育苗，苗木能够保持优树的优良遗传性状，适合广西北部山区大面积区域种植，特别是喀斯特地貌山区种植。
具体实施方式
实施例1
一种金丝4号枣的组培快繁方法，包括以下步骤：
(1)外植体的建立：于3月初，剪取16cm长、当年生优质粗壮的根蘖条，用自来水冲洗10分钟后，于质量浓度为0.4%洗衣粉溶液中浸泡10分钟，再用自来水冲洗干净，然后将洗净后的根蘖条置于培养室中水培培养，每22小时换一
次水，培养温度为27-28℃，光照时间17h/d，光照强度3500lx，培养至长出2～3cm的水培芽后，取出根蘖条，用质量浓度为75%的酒精浸泡35s，无菌水冲洗3次，沥干水分，放到质量浓度为0.1%HgCL2溶液中浸泡消毒7分钟，然后用无菌水冲洗7次，用镊子夹取清洗好的茎段，放置在灭菌的接种碟上，用灭菌过的滤纸吸干表面水分，剪取水培芽作为外植体；
（2）启动培养：将水培芽转入经高温灭菌的启动培养基中（启动培养基的成分为：MS+ N6苄基腺嘌呤（6-BA) 1.2mg/L +萘乙酸（NAA）0.15mg/L +3.5%糖蜜+琼脂6g/L，培养基pH 值为6.0-6.3）诱导不定芽的萌发，培养条件为温度 25℃ ,光照强度为2500lx，光照时间16h/d，在培养室中无菌培养，新芽萌发之后，将其转接到分生培养基中培养，分生培养基的成分为：MS+ N6苄基腺嘌呤（6-BA) 2.2mg/L+萘乙酸（NAA）0.5mg/L +维生素C 1.6mg/L+谷氨酸2.0mg/L +3.5%糖蜜+琼脂7g/L，培养基pH 值为6.0；在光照强度为2000lx，光照时间16h/d，温度为27℃的条件下，培养40天；
（3）继代培养：将植株茎段转接入经消毒后的继代培养基中培养中，继代培养基的成分为：MS+ N6苄基腺嘌呤（6-BA) 2.2mg/L+萘乙酸（NAA）0.5mg/L +维生素C 0.7mg/L+维生素B2 1.8mg/L+谷氨酸1.8mg/L +3.5%糖蜜+琼脂8g/L, 培养基pH 值为6.1；在培养温度为25-26℃，光强 2000lx，光照时间为15h/d的条件下培养34d；
（4）生根培养：在无菌条件下，剪取长2-2.5cm继代培养得到的带叶茎段，插入生根培养基中进行生根培养；生根培养基的成分为：1/2MS+ NAA 0.05mg/L+ IAA0.15 mg/L+IBA 0.7mg/L+5%糖蜜+琼脂8g/L, pH=6.0-6.2；培养温度 26～28℃，光强18001x，光照时间16h/d；
（5）炼苗：当经过生根培养后的生根试管苗根长1.0～2.0 cm时，将组培苗进行室内炼苗，炼苗温度为：27-28℃，光照强度为4000lx，室内瓶炼6天后，敞口炼苗5天；
（6）移栽：取出试管苗，洗净根上的培养基，移栽到用质量浓度为0.2%KMnO4溶液消毒过的椰糠+蛭石+细河沙按照2:5:1的比例做基质的营养杯中，浇足水，保持空气湿度为85％-90%，温度 25～26℃，避免阳光直射， 35天后，移出温室进行全光照炼苗5d，及时浇水，然后移栽大田。
实施例2
一种金丝4号枣的组培快繁方法，包括以下步骤：
(1)外植体的建立：于3月初，剪取17cm长、当年生优质粗壮的根蘖条，用自来水冲洗10分钟后，于质量浓度为0.4%洗衣粉溶液中浸泡12分钟，再用自来水冲洗干净，然后将洗净后的根蘖条置于培养室中水培培养，每24小时换一
次水，培养温度为27-28℃，光照时间18h/d，光照强度3000lx，培养至长出2～3cm的水培芽后，取出根蘖条，用75%的酒精浸泡35s，无菌水冲洗4次，沥干水分，放到质量浓度为0.1%HgCL2溶液中浸泡消毒7分钟，然后用无菌水冲洗8次，用镊子夹取清洗好的茎段，放置在灭菌的接种碟上，用灭菌过的滤纸吸干表面水分，剪取水培芽作为外植体；
（2）启动培养：将水培芽转入经高温灭菌的启动培养基中（启动培养基的成分为：MS+ N6苄基腺嘌呤（6-BA) 1.2mg/L +萘乙酸（NAA）0.20mg/L +3.5%糖蜜+琼脂6g/L，培养基pH 值为6.0-6.3）诱导不定芽的萌发，培养条件为温度25～28℃ ,光照强度为2300lx，光照时间16h/d，在培养室中无菌培养，新芽萌发之后，将其转接到分生培养基中培养，分生培养基的成分为：MS+ N6苄基腺嘌呤（6-BA) 2.2mg/L+萘乙酸（NAA）0.5mg/L +维生素C 1.7mg/L+谷氨酸1.8mg/L +3.5%糖蜜+琼脂7g/L，培养基pH 值为6.0；在光照强度为2100lx，光照时间15h/d，温度为27℃的条件下，培养43天；
（3）继代培养：将植株茎段转接入经消毒后的继代培养基中培养中，继代培养基的成分为：MS+ N6苄基腺嘌呤（6-BA) 2.2mg/L+萘乙酸（NAA）0.6mg/L +维生素C 0.8mg/L+维生素B2 1.7mg/L+谷氨酸1.9mg/L +3.5%糖蜜+琼脂8g/L, 培养基pH 值为6.1；在培养温度为25-26℃，光强 23O0lx，光照时间为15h/d的条件下培养33d；
（4）生根培养：在无菌条件下，剪取长2-2.5cm继代培养得到的带叶茎段，插入生根培养基中进行生根培养；生根培养基的成分为：1/2MS+ NAA 0.05mg/L+ IAA0.15 mg/L+IBA 0.8mg/L+5%糖蜜+琼脂8g/L, pH=6.0-6.2；培养温度 27℃，光强19001x，光照时间15h/d；
（5）炼苗：当经过生根培养后的生根试管苗根长1.0～2.0cm时，将组培苗进行室内炼苗，炼苗温度为：27-28℃，光照强度为5000lx，室内瓶炼5天后，敞口炼苗6天；
（6）移栽：取出试管苗，洗净根上的培养基，移栽到用质量浓度为0.2%KMnO4溶液消毒过的椰糠+蛭石+细河沙按照3:5:1的比例做基质的营养杯中，浇足水，保持空气湿度为85％-90%，温度 25～26℃，避免阳光直射， 37天后，移出温室进行全光照炼苗6d，及时浇水，然后移栽大田。
实施例3
一种金丝4号枣的组培快繁方法，包括以下步骤：
(1)外植体的建立：于3月初，剪取18cm长、当年生优质粗壮的根蘖条，用自来水冲洗10分钟后，于质量浓度为0.4%洗衣粉溶液中浸泡13分钟，再用自来水冲洗干净，然后将洗净后的根蘖条置于培养室中水培培养，每26小时换一
次水，培养温度为27-28℃，光照时间19h/d，光照强度2000lx，培养至长出2～3cm的水培芽后，取出根蘖条，用质量浓度为75%的酒精浸泡35s，无菌水冲洗4次，沥干水分，放到质量浓度为0.1%HgCL2溶液中浸泡消毒7分钟，然后用无菌水冲洗7次，用镊子夹取清洗好的茎段，放置在灭菌的接种碟上，用灭菌过的滤纸吸干表面水分，剪取水培芽作为外植体；
（2）启动培养：将水培芽转入经高温灭菌的启动培养基中（启动培养基的成分为：MS+ N6苄基腺嘌呤（6-BA) 1.2mg/L +萘乙酸（NAA）0.25mg/L +3.5%糖蜜+琼脂6g/L，培养基pH 值为6.0-6.3）诱导不定芽的萌发，培养条件为温度 25～28℃ ,光照强度为2500lx，光照时间16h/d，在培养室中无菌培养，新芽萌发之后，将其转接到分生培养基中培养，分生培养基的成分为：MS+ N6苄基腺嘌呤（6-BA) 2.2mg/L+萘乙酸（NAA）0.5mg/L +维生素C 1.8mg/L+谷氨酸1.7mg/L +3.5%糖蜜+琼脂7g/L，培养基pH 值为6.0；在光照强度为2200lx，光照时间14h/d，温度为27℃的条件下，培养45天；
（3）继代培养：将植株茎段转接入经消毒后的继代培养基中培养中，继代培养基的成分为：MS+ N6苄基腺嘌呤（6-BA) 2.2mg/L+萘乙酸（NAA）0.5mg/L +维生素C 0.9mg/L+维生素B2 1.5mg/L+谷氨酸2.0mg/L +3.5%糖蜜+琼脂8g/L, 培养基pH 值为6.1；在培养温度为25-26℃，光强25O0lx，光照时间为15h/d的条件下培养32d；
（4）生根培养：在无菌条件下，剪取长2-2.5cm继代培养得到的带叶茎段，插入生根培养基中进行生根培养；生根培养基的成分为：1/2MS+ NAA 0.05mg/L+ IAA0.15 mg/L+IBA1.0 mg/L+5%糖蜜+琼脂8g/L, pH=6.0-6.2；培养温度 26～28℃，光强20001x，光照时间14h/d；
（5）炼苗：当经过生根培养后的生根试管苗根长1.0～2.0 cm时，将组培苗进行室内炼苗，炼苗温度为：27-28℃，光照强度为6000lx，室内瓶炼4天后，敞口炼苗7天；
（6）移栽：取出试管苗，洗净根上的培养基，移栽到用质量浓度为0.2%KMnO4溶液消毒过的椰糠+蛭石+细河沙按照3:5:1的比例做基质的营养杯中，浇足水，保持空气湿度为85％-90%，温度 25～26℃，避免阳光直射，38天后，移出温室进行全光照炼苗6d，及时浇水，然后移栽大田。
以下为本发明金丝4号枣的组培快繁方法得到的金丝4号枣组培苗的繁育结果：
种植地点：广西来宾市象州县（象州县位于广西北部，气候冬天最低零下2度，夏天32度，丘陵山坡较多，适宜枣树生长）。
由上表可以看出，本发明金丝4号枣的组培快繁方法，繁殖系数高，生根率达88%以上，营养杯移栽成活率在86%以上，大田移栽成活率在89%以上，组培苗移栽后能迅速适应露天环境，生长迅速，抗外界不良环境能力强。采用本发明的方法对金丝4号枣进行繁育，能有效、方便的在短时间内获得大量金丝4号枣组培苗，而且苗木能够保持优树的优良遗传性状，适合大面积区域种植，带动了当地的果树生产。