本发明涉及植物组织培养技术领域。更具体地说，本发明涉及一种膝柄木胚乳诱导愈伤组织方法。
背景技术：
卫矛科植物膝柄木是一种极度濒危的热带树种，我国仅广西海岸边有分布，天然种群数量不到10株，被列入1992年第一批《国家珍贵树种名录》中。野生膝柄木生树高可达十多米，一年生苗高可达1米，适宜在海边盐渍环境中生长，是我国华南热带海岸有发展利用前景的乡土绿化树种。由于膝柄木种群数量小，种子产量低，因此获得种子繁殖的实生苗很少，开展无性繁殖是抢救性保护这一种群的有效途径。
无性繁殖包括扦插、嫁接和组织培养，我们对膝柄木开展了2年多年的扦插育苗试验，使用了多种生根剂和大量枝条，最好结果生根率还不到10％，因此采用扦插繁殖对膝柄木而言难度相当大。对膝柄木的组培培养也实施3年多时间，利用茎段、叶片、花粉、种子等不同的外植体做了试验，并且在诱导胚乳愈伤组培方面取得了突破，这对膝柄木的组培快繁有极大的推动作用。
技术实现要素：
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种膝柄木胚乳诱导愈伤组织方法，解决濒危植物膝柄木保护与人工繁殖的技术突破。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种膝柄木胚乳诱导愈伤组织方法，包括以下步骤：
步骤一、选择膝柄木胚乳作为外植体；
步骤二、配制初始培养基，在MS培养基中加入0.3-1mg/L的萘乙酸和0.1-0.5mg/L的6-苄氨基嘌呤，并调节pH至5.8-6.0，并灭菌；
步骤三、将膝柄木胚乳接种于初始培养基中，在黑暗环境中培养6-8天，之后培养6-8天，每天用光照强度为1500～2000LX灯光照射9-12h，培养温度控制在25℃，得到初愈伤组织；
步骤四、配制继代培养基，在MS培养基中加入0.08-0.4mg/L的萘乙酸和0.08-0.4mg/L的6-苄氨基嘌呤，并灭菌；
步骤五、将所述初愈伤组织接种于继代培养基中培养10-15天，每天用光照强度为1500～2000LX灯光照射9-12h，培养温度控制在25℃，即诱导完成。
优选的是，所述膝柄木胚乳的获取方法为：将膝柄木种子去除表面泥土和污物后，用质量浓度为1％-5％的洗衣粉浸泡10-30min，自来水清洗后剥开种皮取出胚乳，在无菌条件下，用体积分数为60-80％酒精浸泡20-40s，无菌水冲洗1-3次，再用0.1％氯化汞处理7-10min，无菌水冲洗5-6次即得。
优选的是，初始培养基和继代培养基均采用120-130℃高压灭菌12-20min。
优选的是，初始培养基和继代培养基均加入有琼脂粉2-6g/L，以及蔗糖；其中初始培养基和继代培养基中加入蔗糖的量均占所加入MS培养基质量分数的1-6％。
优选的是，选择每年3月中旬采收的膝柄木种子来获取膝柄木胚乳。
优选的是，所述胚乳在用无菌水冲洗5-6次后接着浸泡于经过灭菌的质量分数为2％的牛奶树汁液中15-20min。
优选的是，初愈伤组织在接种于继代培养基前，在经过灭菌的第一浸液中浸泡了3-5小时，并期间向第一浸液中持续通入氧气，所述第一浸液包括2-2.3mol/L的植物盐、0.8-0.9mol/L的维生素C磷酸酯镁和0.6-0.7mol/L钼酸铵、1-1.2mol/L的花青素、2..6×10-4-2.9×10-4mol/L的CrCl3、1.4×10-3-1.7×10-3mol/L的生化黄腐酸钾，溶剂为水。
本发明至少包括以下有益效果：
1)将胚乳利用牛奶树汁液浸泡后，有利于活化修复胚乳表面的细胞，再接种于培养基中培育得到的愈伤组织更加松散更容易分离，使愈伤组织内部细胞吸收营养物质更加充分均匀，得到的愈伤组织性状更加均一，松散的膝柄木愈伤组织相较于紧密的膝柄木愈伤组织，其活性细胞更丰富，老化的细胞较少，并不像紧密的膝柄木愈伤组织只有外部的细胞可进行诱变再生，从而提高了诱变效率。
2)采用本发明的继代培养基和光照强度与光照时间的控制，大大缩短了继代培养的次数，在初始培养完成后仅需更换一次继代培养基，之后无需再更换培养基，继代培养10-15天即可得到胚性愈伤组织；相较于传统的组培需要继代3-6次，大大简化了工序。
3)由于膝柄木一种极度濒危的热带树种，天然种群数量不到10株，其每年2月-4月生长种子，由于2月的种子中的胚乳呈液体状，还没生长成熟，不适合用于进行组培，而4月份时膝柄木种子已完全成熟，导致胚乳进行组培诱导率低，当选取3月中旬膝柄木种子进行组培时(此时膝柄木果皮稍呈黄色，包裹1粒褐色种子，在果皮与种子之间有黄偏红的肉质假种皮)，其诱导率几乎可以达到100％，大大提高了诱导率。
4)初愈伤组织在第一浸液中浸泡后通过继代培育形成的愈伤组织呈现多数胚状体结构，有利于诱导分化形成幼苗，实现膝柄木的人工抢救繁殖。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1
一种膝柄木胚乳诱导愈伤组织方法，包括以下步骤：
步骤一、选择膝柄木胚乳作为外植体；所述膝柄木胚乳的获取方法为：将3月11号和12号采集的膝柄木种子去除表面泥土和污物后，用质量浓度为2％的洗衣粉浸泡20min，自来水清洗后剥开种皮取出胚乳，在无菌条件下，用体积分数为70％酒精浸泡30s，无菌水冲洗1次，再用0.1％氯化汞处理8min，无菌水冲洗5次即得。
步骤二、配制初始培养基，在MS培养基中加入0.5mg/L的萘乙酸、0.3mg/L的6-苄氨基嘌呤、琼脂粉4g/L，蔗糖占所加入MS培养基质量分数的4％，并调节pH至5.9，并灭菌，采用121℃高压灭菌15min。
步骤三、将膝柄木胚乳接种于初始培养基中，在黑暗环境中培养7天，之后培养7天，每天用光照强度为1800LX灯光照射10h，培养温度控制在25℃，得到初愈伤组织。
步骤四、配制继代培养基，在MS培养基中加入0.2mg/L的萘乙酸和0.2mg/L的6-苄氨基嘌呤、琼脂粉4g/L、蔗糖占所加入MS培养基质量分数的4％，并灭菌，采用121℃高压灭菌15min。
步骤五、将所述初愈伤组织接种于继代培养基中培养15天，每天用光照强度为1600LX灯光照射11h，培养温度控制在25℃，即诱导完成。
在实施例1中选取3月11号和12号采集的膝柄木种子共90粒，分为三组，每组30瓶进行诱导培养，诱导率为88/90＝97.8％。
实施例2
一种膝柄木胚乳诱导愈伤组织方法，包括以下步骤：
步骤一、选择膝柄木胚乳作为外植体；所述膝柄木胚乳的获取方法为：将3月14号采集的膝柄木种子去除表面泥土和污物后，用质量浓度为1％的洗衣粉浸泡10min，自来水清洗后剥开种皮取出胚乳，在无菌条件下，用体积分数为60％酒精浸泡20s，无菌水冲洗1次，再用0.1％氯化汞处理7min，无菌水冲洗5次即得。
步骤二、配制初始培养基，在MS培养基中加入0.3mg/L的萘乙酸、0.1mg/L的6-苄氨基嘌呤、琼脂粉2g/L，蔗糖占所加入MS培养基质量分数的1％，并调节pH至5.8，并灭菌，采用120℃高压灭菌12min。
步骤三、将膝柄木胚乳接种于初始培养基中，在黑暗环境中培养6天，之后培养8天，每天用光照强度为1500LX灯光照射9h，培养温度控制在25℃，得到初愈伤组织。
步骤四、配制继代培养基，在MS培养基中加入0.08mg/L的萘乙酸和0.08mg/L的6-苄氨基嘌呤、琼脂粉2g/L、蔗糖占所加入MS培养基质量分数的1％，并灭菌，采用120℃高压灭菌12min。
步骤五、将所述初愈伤组织接种于继代培养基中培养10天，每天用光照强度为2000LX灯光照射9h，培养温度控制在25℃，即诱导完成。
在实施例2中选取3月14号采集的膝柄木种子共90粒，分为三组，每组30瓶进行诱导培养，诱导率为87/90＝96.7％。
实施例3
一种膝柄木胚乳诱导愈伤组织方法，包括以下步骤：
步骤一、选择膝柄木胚乳作为外植体；所述膝柄木胚乳的获取方法为：将3月15号采集的膝柄木种子去除表面泥土和污物后，用质量浓度为5％的洗衣粉浸泡30min，自来水清洗后剥开种皮取出胚乳，在无菌条件下，用体积分数为80％酒精浸泡40s，无菌水冲洗3次，再用0.1％氯化汞处理10min，无菌水冲洗6次即得。
步骤二、配制初始培养基，在MS培养基中加入1mg/L的萘乙酸、0.5mg/L的6-苄氨基嘌呤、琼脂粉6g/L，蔗糖占所加入MS培养基质量分数的6％，并调节pH至6.0，并灭菌，采用130℃高压灭菌20min。
步骤三、将膝柄木胚乳接种于初始培养基中，在黑暗环境中培养8天，之后培养6天，每天用光照强度为1500LX灯光照射12h，培养温度控制在25℃，得到初愈伤组织。
步骤四、配制继代培养基，在MS培养基中加入0.4mg/L的萘乙酸和0.4mg/L的6-苄氨基嘌呤、琼脂粉6g/L、蔗糖占所加入MS培养基质量分数的6％，并灭菌，采用130℃高压灭菌20min。
步骤五、将所述初愈伤组织接种于继代培养基中培养15天，每天用光照强度为2000LX灯光照射12h，培养温度控制在25℃，即诱导完成。
在实施例3中选取3月15号采集的膝柄木种子共90粒，分为三组，每组30瓶进行诱导培养，诱导率为88/90＝97.8％。
实施例4
一种膝柄木胚乳诱导愈伤组织方法，包括以下步骤：
步骤一、选择膝柄木胚乳作为外植体；所述膝柄木胚乳的获取方法为：将3月13号采集的膝柄木种子去除表面泥土和污物后，用质量浓度为2％的洗衣粉浸泡12min，自来水清洗后剥开种皮取出胚乳，在无菌条件下，用体积分数为65％酒精浸泡22s，无菌水冲洗2次，再用0.1％氯化汞处理8min，无菌水冲洗6次，接着浸泡于经过灭菌的质量分数为2％的牛奶树汁液中15min。。
步骤二、配制初始培养基，在MS培养基中加入0.7mg/L的萘乙酸、0.2mg/L的6-苄氨基嘌呤、琼脂粉3g/L，蔗糖占所加入MS培养基质量分数的4％，并调节pH至5.8，并灭菌，采用128℃高压灭菌14min。
步骤三、将膝柄木胚乳接种于初始培养基中，在黑暗环境中培养7天，之后培养7天，每天用光照强度为1600LX灯光照射10h，培养温度控制在25℃，得到初愈伤组织。
步骤四、初愈伤组织在经过灭菌的第一浸液中浸泡了4小时，并期间向第一浸液中持续通入氧气，所述第一浸液包括2mol/L的植物盐、0.8mol/L的维生素C磷酸酯镁、0.6mol/L钼酸铵、1mol/L的花青素、2..6×10-4mol/L的CrCl3、1.4×10-3mol/L的生化黄腐酸钾，溶剂为水。
步骤五、配制继代培养基，在MS培养基中加入0.08mg/L的萘乙酸和0.08mg/L的6-苄氨基嘌呤、琼脂粉2g/L、蔗糖占所加入MS培养基质量分数的5％，并灭菌，采用128℃高压灭菌19min。
步骤六、将在经过灭菌的第一浸液中浸泡了的初愈伤组织接种于继代培养基中培养11天，每天用光照强度为1700LX灯光照射11h，培养温度控制在25℃，即诱导完成。
在实施例4中选取3月13号采集的膝柄木种子共90粒，分为三组，每组30瓶进行诱导培养，诱导率为89/90＝98.9％。
实施例5
一种膝柄木胚乳诱导愈伤组织方法，包括以下步骤：
步骤一、选择膝柄木胚乳作为外植体；所述膝柄木胚乳的获取方法为：将3月14号采集的膝柄木种子去除表面泥土和污物后，用质量浓度为5％的洗衣粉浸泡30min，自来水清洗后剥开种皮取出胚乳，在无菌条件下，用体积分数为80％酒精浸泡40s，无菌水冲洗3次，再用0.1％氯化汞处理10min，无菌水冲洗6次，接着浸泡于经过灭菌的质量分数为2％的牛奶树汁液中20min。
步骤二、配制初始培养基，在MS培养基中加入1mg/L的萘乙酸、0.5mg/L的6-苄氨基嘌呤、琼脂粉6g/L，蔗糖占所加入MS培养基质量分数的6％，并调节pH至6.0，并灭菌，采用130℃高压灭菌20min。
步骤三、将膝柄木胚乳接种于初始培养基中，在黑暗环境中培养6天，之后培养7天，每天用光照强度为1500LX灯光照射10h，培养温度控制在25℃，得到初愈伤组织。
步骤四、初愈伤组织在经过灭菌的第一浸液中浸泡了4小时，并期间向第一浸液中持续通入氧气，所述第一浸液包括2.3mol/L的植物盐、0.9mol/L的维生素C磷酸酯镁、0.7mol/L钼酸铵、1.2mol/L的花青素、2.9×10-4mol/L的CrCl3、1.7×10-3mol/L的生化黄腐酸钾，溶剂为水。
步骤五、配制继代培养基，在MS培养基中加入0.4mg/L的萘乙酸和0.4mg/L的6-苄氨基嘌呤、琼脂粉6g/L、蔗糖占所加入MS培养基质量分数的6％，并灭菌，采用130℃高压灭菌20min。
步骤六、将在经过灭菌的第一浸液中浸泡了的初愈伤组织接种于继代培养基中培养10-15天，每天用光照强度为2000LX灯光照射12h，培养温度控制在25℃，即诱导完成。
在实施例5中选取3月14号采集的膝柄木种子共90粒，分为三组，每组30瓶进行诱导培养，诱导率为90/90＝100％。
对照例1
一种膝柄木胚乳诱导愈伤组织方法，包括以下步骤：
步骤一、选择膝柄木胚乳作为外植体；所述膝柄木胚乳的获取方法为：将4月10号采集的膝柄木种子去除表面泥土和污物后，用质量浓度为2％的洗衣粉浸泡20min，自来水清洗后剥开种皮取出胚乳，在无菌条件下，用体积分数为70％酒精浸泡30s，无菌水冲洗1次，再用0.1％氯化汞处理8min，无菌水冲洗5次即得。
步骤二、配制初始培养基，在MS培养基中加入0.2mg/L的萘乙酸、0.7mg/L的6-苄氨基嘌呤、琼脂粉4g/L，蔗糖占所加入MS培养基质量分数的4％，并调节pH至5.9，并灭菌，采用121℃高压灭菌15min。
步骤三、将膝柄木胚乳接种于初始培养基中，在黑暗环境中培养7天，之后培养7天，每天用光照强度为1000LX灯光照射6h，培养温度控制在25℃，得到初愈伤组织。
步骤四、配制继代培养基，在MS培养基中加入0.01mg/L的萘乙酸和0.01mg/L的6-苄氨基嘌呤、琼脂粉4g/L、蔗糖占所加入MS培养基质量分数的4％，并灭菌，采用121℃高压灭菌15min。
步骤五、将所述初愈伤组织接种于继代培养基中培养15天，每天用光照强度为1000LX灯光照射6h，培养温度控制在25℃，即诱导完成。
在对照组1中选取4月10号采集的膝柄木种子共90粒，分为三组，每组30瓶进行诱导培养，诱导率为27/90＝30％。
对照例2
一种膝柄木胚乳诱导愈伤组织方法，包括以下步骤：
步骤一、选择膝柄木胚乳作为外植体；所述膝柄木胚乳的获取方法为：将4月3号采集的膝柄木种子去除表面泥土和污物后，用质量浓度为2％的洗衣粉浸泡20min，自来水清洗后剥开种皮取出胚乳，在无菌条件下，用体积分数为70％酒精浸泡30s，无菌水冲洗1次，再用0.1％氯化汞处理8min，无菌水冲洗5次即得。
步骤二、配制初始培养基，在MS培养基中加入1.5mg/L的萘乙酸、1mg/L的6-苄氨基嘌呤、琼脂粉4g/L，蔗糖占所加入MS培养基质量分数的4％，并调节pH至5.9，并灭菌，采用121℃高压灭菌15min。
步骤三、将膝柄木胚乳接种于初始培养基中，在黑暗环境中培养7天，之后培养7天，每天用光照强度为2800LX灯光照射18h，培养温度控制在25℃，得到初愈伤组织。
步骤四、配制继代培养基，在MS培养基中加入0.8mg/L的萘乙酸和0.8mg/L的6-苄氨基嘌呤、琼脂粉4g/L、蔗糖占所加入MS培养基质量分数的4％，并灭菌，采用121℃高压灭菌15min。
步骤五、将所述初愈伤组织接种于继代培养基中培养15天，每天用光照强度为2800LX灯光照射18h，培养温度控制在25℃，即诱导完成。
在对照组2中选取4月3号采集的膝柄木种子共90粒，分为三组，每组30瓶进行诱导培养，诱导率为34/90＝37.8％。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。