一种茶条槭组织培养快速繁殖的方法与流程

本发明涉及茶条槭组织培养快速繁殖的实用技术。

背景技术：

茶条槭为槭树科槭属落叶大灌木或小乔木，叶、果供观赏，叶型美丽。秋季叶色红艳，特别引人注目；夏季刚刚结出的双翅果呈粉红色，十分秀气、别致，是北方优良的观赏绿化树种。此外，其木材可做细木；嫩叶经加工可代茶用，具有生津止渴、退热明目等功效，还可提取大量的没食子酸(Gallic acid，3，4，5－三羟基苯甲酸)。没食子酸又称倍酸，五倍子酸，应用范围很广，主要用于药物、染料、墨水制造，也用做食品抗氧剂、防腐剂、金属提取剂、紫外线吸收剂、消毒剂、止血收敛剂、显影剂、化学试剂、泥浆流化剂和葡萄生长剂等。研究表明，以没食子酸为原料制成的药物可使肿瘤细胞的生长抑制或凋亡，还可作为抗氧剂，具有较强的抗氧化作用，在国际医学上，以没食子酸为原料现已合成抗感染药品如四氧普林(TXP)、溴莫普林(BOP)和美替普林(MTP)；脑复清(Exifone),用于治疗老年意识障碍；联苯双脂，用于治疗慢性肝炎；克冠卓、忧心平、心痛平，用于心绞痛、心衰、心肌梗塞恢复期等；通牌酯，用于治疗脑血栓；Troxipide，用于治疗胃溃疡；克冠酸,用于治疗心肌梗塞；没食子酸锑钠,用于治疗血吸虫；鞣花酸，用于防癌和抗癌。随着科技发展及外贸不断扩大,需求量将会越来越大。但目前茶条槭未见有天然优良种群,多为镶嵌零散分布,加之掠夺性采收,已处于渐危状。

目前，茶条槭的繁殖技术主要以播种育苗为主，但这些方式都存在以下不足之处：播种育苗技术出苗率低、不整齐、且易变异，对保存母株的优良性状有一定影响，成苗周期长，出苗受季节限制，如要大批量出苗，需大量人力、物力及土地资源，生产成本高。综上所述，寻找方法便捷，可批量出苗，生产成本低的茶条槭组培快繁方式，推动产业化生产极具必要性。

在2007年东北林业大学李海艳的硕士论文中曾提到采用种子为外植体建立茶条槭的组织培养再生体系；2007年甘肃农业大学李岩岩在硕士毕业论文中提到以实生苗茎段为外植体建立组培快繁体系；2008年东北林业大学生命科学学院董杰等以茶条槭子叶为外植体组培获得没食子酸。以上几项研究都是以提取茶条槭没食子酸为目的开展，在遗传性状稳定方面没有进行系统的研究，因此其园林价值尚未开发利用。

技术实现要素：

本发明通过筛选母株的优良性状，采用茎段诱导不定芽再生和成熟种子胚培养诱导植株再生的方法，克服了现有技术中无菌苗褐化、增殖系数低和培养周期长的特点，提供了一种培养简单，繁殖系数高，再生周期短，可持续获得再生植株的方法，同时降低成本，可用于苗木产业化生产。

茶条槭组织培养快速繁殖的实用方法

外植体的选择：对茶条槭进行为期两年的物候期观察，详细记载每株苗木的萌芽期、花期、果期、翅果颜色、红叶期、落叶期、病虫害情况，筛选出无病虫害的茶条槭健壮植株；

茎段诱导萌发：取经过筛选的植株无病虫害萌条，截取当年生萌条的第一个至第四个带芽幼嫩茎段为实验材料，除去叶片，切段进行常规消毒，消毒茎段切成1.5-2.0cm长，每段带一对腋芽，再接种到启动培养基中，培养12-14天，使每个腋芽诱导1-2个芽，叶色嫩绿，生长健壮的无菌苗；所述的启动培养基为MS+6-BA0.5-1.0mg/L+NAA0.05-0.1mg/L+AC0.5-1.0g/L +PVP100 -200mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉4.5g/L，其培养环境条件为温度23±2℃、湿度60±2%、光照12-14h/d、光强1500-1800lx的恒温恒湿培养室内。

胚培养诱导萌发：取经过筛选的优良性状茶条槭为母本，采用形态成熟种子，去掉果翅，用洗衣粉浸洗15分钟，流水冲洗2小时，再在超菌工作台进行消毒。消毒过程为：先用75%酒精灭菌1分钟，倒出用无菌水清洗2次，再用0.1%升汞消毒30分钟，倒出用无菌水清洗4次，第一次快速清洗，后三次每次清洗3分钟，此方法可彻底清洗升汞残留物，避免伤害种胚。将消毒好的种子，去除外种皮，接种到胚培养的培养基中，培养2周，胚根及子叶逐步产生，进而形成完整无菌苗；所述的胚培养的培养基为MS+GA₃1.0-3.0mg/L+AC0.5-1.0g/L+PVP 100-200mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉4.5g/L，其培养环境条件为温度23±2℃、湿度60±2%、光照12-14h/d、光强1500-1800lx的恒温恒湿培养室内。初次接种三天后，进行第一次转接，其后20天转接一次，培养基不变。该方法有效控制褐化，同时可通过转管的方式，吸附种胚中抑制其萌发的抑制物质，促进胚萌发；

增殖培养：将茎段诱导萌发或胚培养诱导萌发诱导而来的无菌苗接种到增殖培养基上培养，培养12-16天，得到从基部和腋芽处分化出新芽的苗；增殖培养基为MS+6-BA0.05-0.1mg/L+NAA0.1-0.2mg/L+TDZ0.5-1.0mg/L+AC0.5-1.0g/L+ PVP100-200mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉4.5g/L，其培养环境条件为温度23±2℃、湿度60±2%、光照12-14h/d、光强1500-1800lx的恒温恒湿培养室内。

壮苗生根培养：待新芽长到2-3cm时，将生长健壮的单芽切下，接种到生根培养基中培养，培养25-30d后，有不定根产生，形成完整的植株；生根培养基为MS+IBA0.5-1.0mg/L+AC0.5-1.0g/L+PVP100-200mg/L+蔗糖20g/L+琼脂粉4.5g/L，其培养环境条件为温度23±2℃、湿度60±2%、光照12-14h/d、光强1500-1800lx的恒温恒湿培养室内。该方法克服现有的技术不足，一步完成壮苗与生根培养，节省培养周期，并获得健壮的生根苗。

炼苗移栽：将株高在4cm以上的生根瓶苗移到培养室外，在自然散射光条件下炼苗3～7d，在移栽前打开瓶盖驯化5～7d，取出无菌苗，清洗植株根部附着的培养基，进行移栽上盆，移栽基质为腐叶土：泥炭土：珍珠岩1：1：1，移栽后用多菌灵1000倍液将基质浇透水，放于PVC温室大棚进行养护管理；生根培养基为MS+IBA0.5-1.0mg/L+AC0.5-1.0g/L+PVP100-200mg/L+蔗糖20g/L+琼脂粉4.5g/L，其培养环境条件为温度23±2℃、湿度60±2%、光照12-14h/d、光强1500-1800lx的恒温恒湿培养室内。

维护管理：移栽后将其置于散射光丰富处，移栽后1～3周，每天喷水1～2次，空气相对湿度保持在60%以上，移栽一个月后，植株开始长出新叶，此时每隔两周薄施腐熟饼肥一次，病虫害防治一次，移栽两个月后，幼苗生长良好，在营养钵中生长至高15～20cm时，移至大田苗圃进行定植。

茶条槭组织培养快速繁殖实用技术的优点

茶条槭组织培养快速繁殖实用技术方法简便，从外植体筛选到诱导植株再生，移栽炼苗整个培养周期打破现有的组培繁殖方式，在保持植株优良性状的同时，缩短培养周期，提高了繁殖系数，减少了组培实验过程中过多的人力和物力的消耗，从根本上提高了工作效率，节约了生产成本，并能达到工厂化育苗的目的；

茶条槭茎段再生植株，移栽炼苗成活率高，植株适应自然环境的能力强，移栽炼苗后生长迅速，植株健壮。

附图说明

图1为实施例1茶条槭茎段诱导萌发。

图2为实施例1茶条槭增殖培养。

图3为实施例1茶条槭壮苗生根培养。

图4为实施例1茶条槭炼苗移栽。

图5为实施例1茶条槭移栽半年生长情况。

图6为实施例2茶条槭胚培养诱导胚根产生。

图7为实施例2茶条槭胚培养诱导萌发形成完整幼苗。

图8为实施例2茶条槭增殖培养。

图9为实施例2茶条槭壮苗生根培养。

具体实施方式

实施例1

外植体的选择 对三峡苗圃引种的茶条槭进行为期两年的物候期观察，详细记载每株苗木的萌芽期、花期、果期、翅果颜色、红叶期、落叶期、病虫害等，根据观赏效果将上述参数进行比较，以筛选出最优植株。

茎段诱导萌发 取经过筛选的优良植株无病虫害萌条，截取当年生萌条的第一个至第四个带芽幼嫩茎段为实验材料，除去叶片，切段进行常规消毒。将消毒茎段切成1.5-2.0cm长，每段带一对腋芽，接种到启动培养基MS+6-BA0.8mg/L+NAA0.06mg/L+AC0.8g/L+PVP150mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉4.5g/L，置于环境条件为温度23±2℃、湿度60±2%、光照12-14h/d、光强1500-1800lx的恒温恒湿培养室内，培养5-7d后从腋芽处开始有定芽萌动，培养12-14d后其诱导率达100%，且平均每个腋芽均可诱导1-2个芽，叶色嫩绿，生长健壮（图1）。

增殖培养 将腋芽诱导而来的无菌苗接种到增殖培养基上培养，增殖培养基为MS+6-BA0.08mg/L+NAA0.15mg/L+TDZ0.8mg/L+AC0.8g/L+PVP150mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉4.5g/L，培养条件同上。接种7d后基部先是略有膨大，呈黄绿色，随后形成团块状愈伤组织，2周，开始从基部和腋芽处分化出新芽（图2），两个月后统计其平均增殖系数为5-7。

壮苗生根培养 待新芽长到2-3cm时，将生长健壮的单芽切下，接种到生根培养基中培养，生根培养基为MS+IBA0.8mg/L+AC0.8g/L+PVP150mg/L+蔗糖20g/L+琼脂粉4.5g/L，培养条件同上。培养25-30d后，有不定根产生（图3），从而形成完整的植株，其生根率达100%。

炼苗移栽 试管苗能顺利完成从试管内到田间的适应过程，移栽前的炼苗是非常重要的。炼苗能提高试管苗对外界环境的抵抗力，使它从一个完全封闭的无菌环境中进入完全开放环境的中间过渡，适宜的炼苗过程，能增加植株的抵抗能力，对移栽后的成活至关重要。

将株高在4cm以上的生根瓶苗移到培养室外，在自然散射光条件下炼苗3～7d，然后在移栽前打开瓶盖驯化5～7d，再取出无菌苗，清洗植株根部附着的培养基，最后进行移栽上盆（图4），移栽基质为腐叶土：泥炭土：珍珠岩1：1：1。移栽后用多菌灵1000倍液将基质浇透水，放于PVC温室大棚进行养护管理。

从基质对移栽成活率的影响考虑，茶条槭属比较喜排水良好的沙质壤土的植物，因此选择透气性较好，所含营养物质较多的腐叶土、泥炭土和珍珠岩进行配比，比例为1:1:1混合拌匀作为移栽基质。同时茶条槭是一种阳性树种，比较喜光，移栽后将其置于散射光丰富处。移栽后1～3周，每天喷水1～2次，空气相对湿度保持在60%以上，但不要超过90%，温度保持在20℃左右（因为在高温条件下，相对湿度高于90%，易发生烂苗现象。）。根据天气情况加遮荫网避免强光直射，降低温棚温度。移栽一个月后，植株开始长出新叶，此时每隔两周薄施腐熟饼肥一次，病虫害防治一次。移栽两个月后，统计成活率为90%，所有幼苗均生长良好。在营养钵中生长至高20cm时，移至大田苗圃进行定植（图5）。

实施例2

外植体的选择 对三峡苗圃引种的茶条槭进行为期两年的物候期观察，详细记载每株苗木的萌芽期、花期、果期、翅果颜色、红叶期、落叶期、病虫害等，根据观赏效果将上述参数进行比较，以筛选出最优植株。

胚培养诱导萌发 取经过筛选的优良性状茶条槭为母本，采用形态成熟种子，去掉果翅，用洗衣粉浸洗15分钟，流水冲洗2小时，再在超菌工作台进行消毒。消毒过程为：先用75%酒精灭菌1分钟，倒出用无菌水清洗2次，再用0.1%升汞消毒30分钟，倒出用无菌水清洗4次，第一次快速清洗，后三次每次清洗3分钟，此方法可彻底清洗升汞残留物，避免伤害种胚。将消毒好的种子，去除外种皮，接种到胚培养的培养基上培养，培养基为MS+GA₃1.0-3.0mg/L+AC0.5-1.0g/L+PVP 100-200mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉4.5g/L，置于环境条件为温度23±2℃、湿度60±2%、光照12-14h/d、光强1500-1800lx的恒温恒湿培养室内，培养2周，胚根及子叶逐步产生（图6），进而形成完整无菌苗（图7）。初次接种三天后，进行第一次转接，其后20天转接一次，培养基不变。该方法有效控制褐化，同时可通过转管的方式，吸附种胚中抑制其萌发的抑制物质，促进胚萌发；

增殖培养 将腋芽诱导而来的无菌苗接种到增殖培养基上培养，增殖培养基为MS+6-BA0.08mg/L+NAA0.15mg/L+TDZ0.8mg/L+AC0.8g/L+PVP150mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉4.5g/L，培养条件同上。接种7d后基部先是略有膨大，呈黄绿色，随后形成团块状愈伤组织，2周，开始从基部和腋芽处分化出新芽（图8），两个月后统计其平均增殖系数为5-7。

壮苗生根培养 待新芽长到2-3cm时，将生长健壮的单芽切下，接种到生根培养基中培养，生根培养基为MS+IBA0.8mg/L+AC0.8g/L+PVP150mg/L+蔗糖20g/L+琼脂粉4.5g/L，培养条件同上。培养25-30d后，有不定根产生，从而形成完整的植株，其生根率达100%（图9）。

炼苗移栽 试管苗能顺利完成从试管内到田间的适应过程，移栽前的炼苗是非常重要的。炼苗能提高试管苗对外界环境的抵抗力，使它从一个完全封闭的无菌环境中进入完全开放环境的中间过渡，适宜的炼苗过程，能增加植株的抵抗能力，对移栽后的成活至关重要。

将株高在4cm以上的生根瓶苗移到培养室外，在自然散射光条件下炼苗3～7d，然后在移栽前打开瓶盖驯化5～7d，再取出无菌苗，清洗植株根部附着的培养基，最后进行移栽上盆，移栽基质为腐叶土：泥炭土：珍珠岩1：1：1。移栽后用多菌灵1000倍液将基质浇透水，放于PVC温室大棚进行养护管理。

从基质对移栽成活率的影响考虑，茶条槭属比较喜排水良好的沙质壤土的植物，因此选择透气性较好，所含营养物质较多的腐叶土、泥炭土和珍珠岩进行配比，比例为1:1:1混合拌匀作为移栽基质。同时茶条槭是一种阳性树种，比较喜光，移栽后将其置于散射光丰富处。移栽后1～3周，每天喷水1～2次，空气相对湿度保持在60%以上，但不要超过90%，温度保持在20℃左右（因为在高温条件下，相对湿度高于90%，易发生烂苗现象。）。根据天气情况加遮荫网避免强光直射，降低温棚温度。移栽一个月后，植株开始长出新叶，此时每隔两周薄施腐熟饼肥一次，病虫害防治一次。移栽两个月后，统计成活率为90%，所有幼苗均生长良好。在营养钵中生长至高20cm时，移至大田苗圃进行定植。