本发明涉及植物生物工程组织培养技术领域。更具体地说，本发明涉及一种用灵发素诱导烟草愈伤组织的方法。
背景技术：
烟草的愈伤组织(callus)是生产再生植株，获得遗传良性变异，进行品种改良的重要材料。同时，烟草作为植物生物技术研究的模式植物，其愈伤组织还是细胞生物学、分子生物学和基因学等基础研究的重要试验材料。所以，国内外对获得烟草愈伤组织的技术研究报告颇多。但是归纳起来，其共同点有：①基本培养基。绝大多数是用MS(Murashige和Skoog,1962)，偶然有用H(Bourgin和Nitsch,1967)。②诱导剂。几乎全部是使用以下2类5种植物生长物质。即生长素类(Auxin)中的三种：2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)，NAA(萘乙酸)和IBA(吲哚丁酸)；细胞分裂素类(Cytokinin)中的两种：BA(N6-苄基腺嘌呤)和KT(激动素)。而且还必定是其中的2种，甚至3种进行复配使用，才能达到诱导愈伤组织的效果。现有诱导获得烟草愈伤组织技术的缺点是：1.培养基的配制程序繁琐复杂费工；2.出愈率(出愈外植体数/接种外植体数×100％)虽不算低(据不同报导，培养25d-30d可达75％-100％)，但是愈伤组织的实际产量却不高，只是相关报导都避而不谈而已；3.2,4-D，IBA和NAA(三者之中至少必用其一或二)均有明显的毒性和残留，特别是使用最多的2,4-D，原本就是除草剂，极易使刚获得的愈伤组织发生褐化和板结，严重影响质量，使其增殖和再分化的能力显著下降。所以，在相关报导中，几乎无一例外，从外植体获得少量愈伤组织后，都必须及时转入另外某种不同的专用增殖培养基，才能进行扩繁。
蓝桃菊等人公开了一种用灵发素诱导甘蔗愈伤组织的方法，专利号为ZL 2010 1 0216180.9，曾用LFS0.01-0.50mg·L-1成功诱导单子叶植物纲禾本目禾本科植物甘蔗幼叶发生愈伤组织，最佳浓度为0.20mg·L-1。许鸿源等人研究了灵发素对三七愈伤组织发生和增殖的影响，以MS为基本培养基，添加复合诱导剂2,4-D2.0mg·L-1和LFS2.0mg·L-1成功诱导双子叶植物纲伞形目五加科三七的茎段发生愈伤组织。但是，对于在植物分类学上亲缘关系极其遥远的双子叶植物纲合瓣花亚纲管状花目茄科烟草属的烟草来说，至今未见有单独用灵发素，或将灵发素同其它物质复配后成功诱导其愈伤组织发生的技术报导。
技术实现要素：
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种用灵发素诱导烟草愈伤组织的方法，以灵发素作诱导剂制备的诱导培养基比传统的培养基出愈快、产量高、质量优，且该培养基还可直接用于愈伤组织的增殖扩繁，达到一基多用，能显著提高整体工作效率。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种用灵发素诱导烟草愈伤组织的方法，以灵发素作诱导剂制备诱导培养基进行烟草叶片外植体的愈伤组织诱导。
优选的是，所述的用灵发素诱导烟草愈伤组织的方法，所述诱导培养基为配方为：MS+灵发素0.05-2.0mg/L，pH为5.8～6.0。
优选的是，所述的用灵发素诱导烟草愈伤组织的方法，所述烟草叶片外植体的获取方法为：取由烟草种子获得的无菌烟草植株，当其长至5、6片叶时，自上至下取第3片叶，在无菌条件下，切成方片作为外植体，备用。
优选的是，所述的用灵发素诱导烟草愈伤组织的方法，将自上至下的第3片叶在无菌条件下切除叶柄以上2mm和叶尖以下2mm的叶片部分，留叶片中间部分，再沿其主脉两侧分切成5mm×5mm的方片作烟草叶片外植体。
优选的是，所述的用灵发素诱导烟草愈伤组织的方法，将烟草叶片外植体接种于灭菌后的诱导培养基中培养10-20天，获得烟草愈伤组织。
优选的是，所述的用灵发素诱导烟草愈伤组织的方法，所述诱导培养基中灵发素的浓度为1.5mg/L。
本发明至少包括以下有益效果：
1)灵发素同时具有细胞分裂素(Cytokinin)和生长素(Auxin)两类植物生长物质的生物活性，对培养物没有毒副作用，采用灵发素添加于固体MS配制成单一的诱导培养基，大大简化培养基的配制程序，节省物力人力，降低了培养成本；
2)本发明的诱导培养基以灵发素作为唯一的诱导剂成分，针对双子叶植物烟草的特殊生物学特性，本申请研究人员对十多种未曾在诱导烟草愈伤组织中使用过的植物生长物质进行了大量筛选试验，确定了灵发素的适宜浓度，使得烟草叶片外植体在诱导培养基作用下进行脱分化，以高效优质地形成烟草愈伤组织，本发明的诱导培养基比传统的培养基诱导效果更好，出愈快、产量高、质量优，能显著提高整体工作效率；其中以MS+LFS1.50mg·L-1诱导烟草叶片获得愈伤组织，不仅出愈快，出愈率高，褐化板结轻微，而且转绿率达到传统技术CK组的3.9倍，产量达CK组的4.9倍。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1：
一种用灵发素诱导烟草愈伤组织的方法，包括以下步骤：
步骤一、诱导培养基制备：以MS为基本培养基，添加灵发素0.05mg/L，调整培养基pH为5.8～6.0，灭菌后备用；
步骤二、外植体准备：取由烟草种子获得的无菌烟草植株，在无菌条件下，将烟草叶片切成方片作为外植体，备用，方片可切成大小约为5mm×5mm；
步骤三、接种与诱导培养：将步骤二获得的烟草叶片外植体在无菌条件下接入步骤一的诱导培养基中，培养10-20天。
实施例2：
一种用灵发素诱导烟草愈伤组织的方法，包括以下步骤：
步骤一、诱导培养基制备：以MS为基本培养基，添加灵发素1.5mg/L，调整培养基pH为5.8～6.0，灭菌后备用；
步骤二、外植体准备：取由烟草种子获得的无菌烟草植株，当其长至5、6片叶时，自上至下取第3片叶，在无菌条件下，切成方片作为外植体，备用，方片可切成大小约为5mm×5mm；
步骤三、接种与诱导培养：将步骤二获得的烟草叶片外植体在无菌条件下接入步骤一的诱导培养基中，培养10-20天。
无菌烟草植株的叶片长至5、6片叶时，自上至下的第3叶为充分成熟健壮的功能叶，细胞代谢旺盛，生命力强，相比其他烟草叶片，作为外植体培养更易发生脱分化形成愈伤组织。
实施例3：
一种用灵发素诱导烟草愈伤组织的方法，包括以下步骤：
步骤一、诱导培养基制备：以MS为基本培养基，添加灵发素2.0mg/L，调整培养基pH为5.8～6.0，灭菌后备用；
步骤二、外植体准备：取由烟草种子获得的无菌烟草植株，当其长至5、6片叶时，自上至下取第3片叶，在无菌条件下，切除叶柄以上2mm和叶尖以下2mm的叶片部分，留叶片中间部分，再沿其主脉两侧分切成5mm×5mm的方片作为外植体，备用，需要说明的是，前述的沿主脉切片是指弃用了叶片左右两侧的边缘叶片部分，只要主脉两侧的叶片部分；
步骤三、接种与诱导培养：将步骤二获得的烟草叶片外植体在无菌条件下接入步骤一的诱导培养基中，培养10-20天。
无菌烟草植株的叶片长至5、6片叶时，自上至下的第3叶为充分成熟健壮的功能叶，细胞代谢旺盛，生命力强，在切除叶片的上下两端以及在沿主脉两边切取5mm×5mm的方片的同时也切除了左右两侧边缘的叶片部分，这种操作更有利保证所用的烟草叶片外植体从外部形态到内在代谢水平都更为均匀一致，有效减少材料误差对实验结果的影响。
对比例1：
为了说明本发明的用灵发素诱导烟草愈伤组织的方法的效果，本发明的发明人以实施例3的方法，将诱导培养基中的灵发素浓度依次设定为：0.05mg/L、0.10mg/L、0.50mg/L、1.00mg/L、1.50mg/L、2.00mg/L，并以传统诱导培养基(其配方为：MS+2,4-D 0.1mg/L+NAA 0.5mg/L+BA 0.2mg/L)为对照组(CK)，在上述每组试验中接种5瓶，每瓶接种5个方片，称量并计算每组试验中5个方片的平均鲜重FW1(g)，以便最后计算每瓶(5个方片)愈伤组织的平均产量。在常规条件下培养诱导烟草愈伤组织，并统计各组培养10天的出愈率和培养20天的出愈率、褐变率、板结率和愈伤组织净增鲜重，其中：
平均出愈率(％)＝出愈方片数/接种方片数×100％，不论方片污染与否及出愈多少；
褐变率(％)＝出愈方片褐变数/出愈方片数×100％；
褐变程度：以“+”多少表示；
板结率(％)＝愈伤组织紧实难以增殖分化的方片数/出愈方片数×100％；
转绿率(％)＝有愈伤组织转绿方片数/出愈方片数×100％，不论愈伤组织转绿方片的实际转绿程度，以肉眼可辨为准；
愈伤组织净增鲜重：试验终止，当即每组随机取3瓶无污染者，去除培养基后，称量每瓶培养物(含外植体方片，及其愈伤组织和附生物)的总鲜重FW2(g)，计算每瓶愈伤组织的净增鲜重FW(g)＝FW2-FW1(FW1为培养前5个方片的平均鲜重)。
结果见表1。
表1.灵发素诱导烟草叶片愈伤组织的实施案例及与传统技术的效果对比
在本申请试验条件下，从表1可见，灵发素0.05-2.00mg/L都能诱导烟草叶片外植体脱分化发生愈伤组织，而且效果明显优于现有的技术方法(CK)，最佳浓度为1.50mg/L。以MS为基本培养基，添加单一诱导剂灵发素1.50mg/L，常规无菌培养10d，出愈率约相当CK组的4.8倍；培养20d出愈率达100％，而褐化率只有CK组的10％，板结率只有CK组的3.7％，都相当轻微；愈伤组织转绿率却是CK组的3.9倍；每瓶(5个方片)平均收获愈伤组织净鲜重达8.3g，是CK组1.7g的4.9倍。所以本申请技术的建立，实现了简单、快速、优质、高效生产烟草愈伤组织的目标。在科研及规模化生产烟草愈伤组织时具有实用价值。
另外需要说明的是，本发明的诱导培养基还可直接用于愈伤组织的增殖扩繁，无需额外再另配专用增殖培养基，达到一基多用，显著提高整体工作效率。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。