本发明涉及植物线虫标本制作技术领域，具体为一种植物线虫永久玻片的制作方法。
背景技术：
植物线虫属于无脊椎动物中的线虫门，能寄生于植物根、茎、叶、果实、种子等部位，其种类繁多、危害严重。据不完全统计，全世界每年因植物线虫造成的农林作物经济损失在数千亿元以上。我国2007年公布的对外植物检疫性有害生物名录中，有20种(属)的线虫为检疫性线虫，其实际种数多达200种以上。
在植物线虫检测鉴定研究工作中，一般首先必须制作临时玻片，对线虫的形态结构进行初步观察和摄影，并对各种数据进行测计。随后，需进一步将样品制成永久玻片，作为实验室的实物标本，可作为检疫实验室的截获证据，也可供教学或科研需要，尤其对鉴定的新种，必须要求有模式标本。
一般线虫永久玻片制作过程较为复杂，制作步骤多，涉及标本的杀死、固定、脱水、制片等步骤。而且需耗时较长，一般需要5～6周。公开号为CN102640742A的中国专利公开了一种对传统的永久玻片制作方法改进的技术方案，但该方案仍需用2种脱水液，且用时需20天左右。
技术实现要素：
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供简易的线虫永久玻片制作方法，其方法便捷、可操作性强、效果好。
具体的技术方案如下：
一种植物线虫永久玻片的制作方法，包括以下步骤：
a、将含有线虫的水溶液在55-60℃温浴2-3min后离心，分离水层得到线虫液，将所述线虫液在固定液中浸泡24h以上；
b、将含有线虫的固定液离心，分离上层固定液得到固定后的线虫，将固定后的线虫与1.5～2.5ml甘油水溶液混合置于24孔细胞培养皿中，再将所述24孔细胞培养皿在35℃～40℃条件下恒温放置40h～50h，得到完全脱水浸泡于甘油中的线虫；其中，所述甘油水溶液包括体积比为1:15～25的甘油与水；
c、在载玻片上滴加甘油，将所述完全脱水浸泡于甘油中的线虫移至载玻片的甘油滴中，在甘油滴两边放蜡块，加盖玻片，加热至蜡块融化后冷却。
本发明中，所述线虫固定液包括体积比为5～15:1～5:65～94的40wt％甲醛、甘油和水。
本发明步骤a或步骤b中，所述离心的转速独立地为2000～4000r/min，离心时间独立地为1～5min。
本发明步骤c中，移至甘油滴中央的线虫为已完全脱水的雌、雄线虫各若干条，排列均匀。
步骤c中，所述加热步骤具体为，将含有蜡块的玻片置于50～70℃的加热板上加热，所述加热的时间为20～40s。
步骤c中，玻片冷却后，在所述玻片上贴上标签，所述标签上包括样品号、寄主、产地、制作日期。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
本发明简化了永久玻片制作的复杂程序，在脱水过程中只需要使用一种脱水液，其操作过程和所需材料比常规线虫永久玻片制片方法简化了许多，降低了制作难度。本发明植物线虫永久玻片简易制作方法，从杀死、固定、脱水和制片的全过程仅需约3d，操作简单、快捷，对各种常见植物线虫都能获得较好的永久玻片。
具体实施方式
下面将结合本发明中的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种植物线虫永久玻片的制作方法，包括以下步骤：
线虫的杀死与固定：将含有线虫的水溶液温浴后离心，分离水层得到微量线虫液，在线虫液中加入固定液浸泡，杀死和固定线虫。
本发明中目标线虫需是活的，最好是刚从土壤或植物组织中分离出的，若分离出的目标线虫放置过久而没有固定或固定时间短，会使线虫变形。将含有线虫的水溶液温浴以杀死线虫。温浴温度优选为55-60℃，进一步为56-58℃，温浴时间优选为2-3min。将温浴后的含有线虫的水溶液离心，使线虫和水分离。所述离心的转速为2000～4000r/min，优选为2500～3500r/min，进一步为3000r/min；离心时间为1～5min，优选为2～4min，更优选为3min。
去除分离的水层，向存留的少量线虫液中加入线虫固定液。所述线虫固定液加入的体积以能没过所述线虫液为基础，优选所述线虫液与所述固定液的体积比为1：10～30，进一步优选为1：15～25，具体为1:20。其中，线虫固定液可以采用本领域中常用的固定液对线虫进行固定。在本发明中优选采用40wt％甲醛、甘油和水混合形成的固定液。其中，40wt％甲醛、甘油和水的体积比为5～15:1～5:65～94，优选为8～12:2～4:80～90，进一步优选为10:2:88。本发明中对固定液的温度没有特殊的限定，采用室温下的线虫固定液即可。线虫液与固定液混合后，在室温下浸泡24小时以上，优选为36小时以上，进一步为久于48小时进行固定。
固定之后，将含有线虫的固定液离心。所述离心的转速为2000～4000r/min，优选为2500～3500r/min，进一步为3000r/min；离心时间为1～5min，优选为2～4min，更优选为3min。
离心后，固定液位于上层。分离上层固定液得到固定后的线虫，将固定后的线虫与甘油水溶液混合。具体为吸出上层固定液，将线虫转移至容器中，并在所述容器中加入甘油水溶液脱水浸泡。所述容器优选用24孔细胞培养皿。所述甘油水溶液为含有甘油与水的混合溶液，甘油与水的体积比为1:10～30，优选为1:15～25，具体为1:20。本发明甘油水溶液的体积为1.5～2.5mL，进一步为2mL。
将含有线虫-甘油水溶液的容器在35℃～40℃条件下恒温放置40h～50h。具体为，将含有甘油水溶液和线虫的24孔细胞培养皿置于恒温培养箱中放置，待甘油水溶液中的水完全蒸发，线虫浸泡于甘油中，得到完全脱水的线虫，用于制作线虫永久玻片。其中，恒温培养箱的温度设置为35℃～40℃，进一步为37℃～38℃；线虫在恒温培养箱中放置的时间为40h～50h，进一步优选为43～47小时。此时容器中蒸馏水已全部蒸发，线虫浸泡于甘油中，用于制作线虫永久玻片。
制作线虫永久玻片：在载玻片上滴加甘油，将上述浸泡于甘油中的线虫移至载玻片的甘油滴中。可以根据本领域技术人员的经验选择滴加甘油的量，在本发明中，优选在载玻片上滴加2～4微升甘油。每个玻片中可放置雌、雄线虫各若干条，均匀排列在载破片上。在甘油滴两边放蜡块，加盖玻片，加热至蜡块融化后自然冷却，贴上标签。本领域技术人员可以采用常规的加热方式，如酒精灯加热，也可以采用加热板加热。在本发明实施例中，加热具体为将含有蜡块的玻片置于加热板上加热。加热温度为50～70℃，优选为55～65℃，具体为64℃。待蜡块融化后，停止加热。优选加热时间为20～40s，进一步为30s。自然冷却后贴上标签。标签上包括样品号、寄主、产地、制作日期等信息，完成线虫永久玻片的制作。将制作好的线虫标本放入标本盒中保存。保存时注意保持玻片水平，以防线虫滑动。
实施例1：
松材线虫简易永久玻片制作步骤：
a、清洗载玻片和盖玻片；
b、松材线虫的杀死与固定：在解剖镜下，用移液器反复从培养皿中吸取线虫，转移到500μL塑料管中，将塑料管在57℃下温浴2min后取出，以2500r/min离心3min，使线虫沉降到塑料管底部。用移液器慢慢将塑料管上层的水吸出，使管中仅留少量的线虫液(约10μL)，然后向管中加入线虫固定液(40％甲醛：甘油：蒸馏水＝10:2:88)，使线虫在固定液中浸泡24h以上，同时杀死和固定线虫。
c、将塑料管2000r/min离心3min，使线虫沉于管底。吸去上层线虫固定液后，用移液器将线虫移至24孔细胞培养皿中(为防止线虫粘附于管壁，可用移液器吸取甘油水溶液反复吸取)，加入甘油水溶液(甘油：蒸馏水＝1:20)2mL，再将皿置于38℃恒温培养箱中放置45h。此时皿中蒸馏水已全部蒸发，线虫已浸泡于甘油中，可用于制作线虫永久玻片。
d、取一干净载玻片，在中间滴加2微升甘油，在解剖镜下用挑针将已完全脱水的雌、雄线虫各数条移至甘油滴的中央，排列均匀。
e、在甘油滴两边对称放两块小蜡块，加盖玻片，置于64℃的加热板上加热，30s后待蜡块融化后自然冷却。
f、加贴标签，写明样品号、寄主、产地、制作日期等，线虫永久玻片制作完成。
实施例2：
花生根结线虫简易永久玻片制作步骤：
a、清洗载玻片和盖玻片；
b、花生根结线虫的杀死与固定：在解剖镜下，用移液器反复从培养皿中吸取线虫，转移到500μL塑料管中，将塑料管在60℃下温浴2min后取出，以3000r/min离心1min，使线虫沉降到塑料管底部。用移液器慢慢将塑料管上层的水吸出，使管中仅留少量的线虫液(约10μL)，然后向管中加入线虫固定液(40％甲醛：甘油：蒸馏水＝15:5:94)，使线虫在固定液中浸泡36h以上，同时杀死和固定线虫。
c、将塑料管2500r/min离心4min，使线虫沉于管底。吸去上层线虫固定液后，用移液器将线虫移至24孔细胞培养皿中(为防止线虫粘附于管壁，可用移液器吸取甘油水溶液反复吸取)，加入甘油水溶液(甘油：蒸馏水＝1:30)1.5mL，再将皿置于35℃恒温培养箱中放置40h。此时皿中蒸馏水已全部蒸发，线虫已浸泡于甘油中，可用于制作线虫永久玻片。
d、取一干净载玻片，在中间滴加3微升甘油，在解剖镜下用挑针将已完全脱水的雌、雄线虫各数条移至甘油滴的中央，排列均匀。
e、在甘油滴两边对称放两块小蜡块，加盖玻片，置于54℃的加热板上加热，38s后待蜡块融化后自然冷却。
f、加贴标签，写明样品号、寄主、产地、制作日期等，线虫永久玻片制作完成。
实施例3：
燕麦真滑刃线虫简易永久玻片制作步骤：
a、清洗载玻片和盖玻片；
b、燕麦真滑刃线虫的杀死与固定：在解剖镜下，用移液器反复从培养皿中吸取线虫，转移到500μL塑料管中，将塑料管在55℃下温浴3min后取出，以2000r/min离心5min，使线虫沉降到塑料管底部。用移液器慢慢将塑料管上层的水吸出，使管中仅留少量的线虫液(约10μL)，然后向管中加入线虫固定液(40％甲醛：甘油：蒸馏水＝7:1:75)，同时杀死和固定线虫。使线虫在固定液中浸泡48h以上；
c、将塑料管3500r/min离心4min，使线虫沉于管底。吸去上层线虫固定液后，用移液器将线虫移至24孔细胞培养皿中(为防止线虫粘附于管壁，可用移液器吸取甘油水溶液反复吸取)，加入甘油水溶液(甘油：蒸馏水＝1:10)2.5mL，再将皿置于40℃恒温培养箱中放置40h。此时皿中蒸馏水已全部蒸发，线虫已浸泡于甘油中，可用于制作线虫永久玻片。
d、取一干净载玻片，在中间滴加4微升甘油，在解剖镜下用挑针将已完全脱水的雌、雄线虫各数条移至甘油滴的中央，排列均匀。
e、在甘油滴两边对称放两块小蜡块，加盖玻片，置于70℃的加热板上加热，24s后待蜡块融化后自然冷却。
f、加贴标签，写明样品号、寄主、产地、制作日期等，线虫永久玻片制作完成。
其它线虫种类都同该实施例，也能取得本发明所述的效果。
上述植物线虫永久玻片简易制作方法，从杀死、固定、脱水和制片的全过程仅需约3d，操作简单、快捷，对各种常见植物线虫都能获得较好的永久玻片。
上述实施方式旨在举例说明本发明可为本领域专业技术人员实现或使用，对上述实施方式进行修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，故本发明包括但不限于上述实施方式，任何符合本权利要求书或说明书描述，符合与本文所公开的原理和新颖性、创造性特点的方法、工艺、产品，均落入本发明的保护范围之内。