球孢白僵菌在玉米苗期的定殖方法及其应用与流程

本发明涉及微生物定殖技术领域，具体而言，涉及一种球孢白僵菌在玉米苗期的定殖方法及其应用。

背景技术：

寄生在昆虫、蜘蛛等幼虫或成虫上的真菌，称为虫生真菌(entomogenous fungi或entomopathogenic fungi)虫生真菌在保护植物免受病虫害侵扰方面扮演着重要的角色，是近三十年来在国内外迅速受到关注的微生物类群。虫生真菌的植物内生性已得到众多研究者的验证，该类菌种可以存在于多种野生植株的组织内，如玉米、高粱、番茄、棉花、香蕉、加州山松、可可、罂粟等。此外，也可以通过人工接种的方式将菌种接种到寄主植物当中，主要接种方法有土壤灌溉、种子包衣、浸种、胚根敷料(土壤拌种)、根和根茎浸泡、茎部注射、叶面喷施和花朵喷施等，菌株能从接种部位向周围组织扩散并定殖在寄主植物组织中，但根据接种方法、接种部位及宿主植物不同，菌种定殖效率也存在一定差异。虫生真菌在植物中定殖对植物的生长有一定的促进作用，主要表现在增加生物量，提高自身抗性等。但有关虫生真菌促进植物生长的相关机制报道较少，植物自身生长状态的改变势必会带来植物体内相关防御酶活性的变化，这方面的研究目前未见报道。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种球孢白僵菌在玉米苗期的定殖方法，利用球孢白僵菌孢子悬液浸种法处理玉米种子，使其在玉米中定殖，其方法简便易行，本方法明确了最佳的浸种时间，以及球孢白僵菌在玉米苗期的定殖偏好性，同时检测了该种接种方法对玉米苗期生长状态的影响，并进一步研究了玉米抗性相关防御酶活性的变化情况，对虫生真菌促进植物生长的机制进行了初步探讨。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种球孢白僵菌在玉米苗期的定殖方法，包括：

将玉米种子表面消毒后经球孢白僵菌孢子悬液浸种；

所述球孢白僵菌菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC7192；保藏时间为：2013年01月23日。

本发明使用的菌株为吉林省农业科学院植物保护研究所生物农药课题组分离保存的球孢白僵菌Beauveria bassiana D1-5菌株。该菌株分离自亚洲玉米螟，2008年采集于吉林省德惠市。

本发明使用的玉米品种为垦粘一号(KN1)。该品种属于青食玉米，微甜，口感好，是主要的食用品种，在吉林省种植面积居首位。

本发明利用球孢白僵菌孢子悬液浸种法处理玉米种子，使其在玉米中定殖，该种方法简便易行，旨在明确最佳的浸种时间，以及球孢白僵菌在玉米苗期的定殖偏好性，同时监测了该种接种方法对玉米苗期生长状态的影响，并进一步研究了玉米抗性相关防御酶活性的变化情况，对虫生真菌促进植物生长的机制进行了初步探讨。

优选的，如上所述的球孢白僵菌在玉米苗期的定殖方法，所述表面消毒的方法为：

用65％～75％乙醇溶液浸泡20s～40s，再使用0.8％～1.2％次氯酸钠溶液浸泡20s～40s，最后用无菌水清洗2～5次。

优选的，如上所述的球孢白僵菌在玉米苗期的定殖方法，所述球孢白僵菌孢子的浓度为10^8～9个孢子/mL。

优选的，如上所述的球孢白僵菌在玉米苗期的定殖方法，所述玉米种子和所述白僵菌孢子悬液的比例为：

每100粒玉米种子浸泡在15～25mL白僵菌孢子悬液中。

优选的，如上所述的球孢白僵菌在玉米苗期的定殖方法，所述白僵菌孢子悬液的溶剂为0.04％～0.06％的吐温-80溶液。

优选的，如上所述的球孢白僵菌在玉米苗期的定殖方法，所述浸种的条件为：26℃～30℃，60r/min～100r/min浸种10h～14h。

浸种时间会对苗期几种防御酶活性产生影响，是关键的参数之一。

优选的，如上所述的球孢白僵菌在玉米苗期的定殖方法，将玉米种子表面消毒后经球孢白僵菌孢子悬液浸种后还包括：

将种子铺于无菌滤纸上，吹干备用。

优选的，如上所述的球孢白僵菌在玉米苗期的定殖方法，所述玉米的品种为垦粘一号。

如上所述的球孢白僵菌在玉米苗期的定殖方法在提高玉米幼苗品质以及防治玉米害虫中的应用。

优选的，如上所述的应用，所述玉米害虫包括玉米螟、松毛虫、小蔗螟、盲椿、谷象、柑桔红蜘蛛和蚜虫中的一种或多种。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明提供的定殖方法简便易行，明确了最佳的浸种时间，以及球孢白僵菌在玉米苗期的定殖偏好性；虫生真菌在植物体内定殖可以使植物的抗性增强，一方面可以减缓病原菌对植物的危害程度，另一方面可以通过对植食性昆虫的间接调控保护植物免受害虫侵扰。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为浸种时间对球孢白僵菌在玉米中定殖偏好性的影响；

图2为球孢白僵菌浸种对玉米生理生态指标的影响；

图3为球孢白僵菌浸种对玉米叶片抗性相关酶活力的影响。

本发明所采用的球孢白僵菌(Beativeria bassiana)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏时间为：2013年01月23日，保藏编号CGMCC7192。经保藏中心于2013年01月23日检测为存活菌株。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

本实施例提供了一种球孢白僵菌在玉米苗期的定殖方法，包括：

本发明采取随机区组设计，盆栽控制实验。浸种时间和球孢白僵菌处理分别设置2个水平。实验设置4个处理，每个处理8株玉米，10个重复。实验处理分别为吐温-80浸种12h(T80-12h)，球孢白僵菌孢子悬液浸种12h(Bb-12h)，吐温-80浸种24h(T80-24h)，球孢白僵菌孢子悬液浸种24h(Bb-24h)。

选取颗粒大小均一的玉米种子，将种子表面消毒(首先用70％乙醇溶液浸泡30s，其次使用1％次氯酸钠溶液浸泡30s，最后用无菌水清洗3次)，每100粒(约23g)玉米种子浸泡在20mL球孢白僵菌孢子悬液(使用0.05％吐温-80溶液，将球孢白僵菌孢子粉悬浮，采用血球计数板计悬浮液中孢子数，孢子悬液浓度为10⁸个孢子/mL)或0.05％吐温-80溶液中，28℃，80r/min浸种。随后将种子铺于无菌滤纸上，吹干30min，备用。播种花盆规格为，直径20cm×高14.5cm，土壤选用丹麦进口泥炭土，每盆装土2kg，2株苗/盆(1株取样，1株测生物量)。

实施例2

本实施例提供了对实施例1效果的检测方法及结果。

一、实验方法

1.球孢白僵菌定殖偏好性调查

取样时期为3次，分别为实施例1玉米出苗14d，21d，28d，每个时期各处理取幼苗10株，每株苗取根、茎、叶各9块，根茎长度为1cm，叶片面积1cm2。定殖率检测采用PDA检测法，样材料表面消毒(实施例1中种子消毒方法)，每种组织摆放在一个PDA选择培养皿中(每个平板9块样品)，28℃，培养箱中暗培养。7d后每天观察并记录植物组织上菌体生长情况，定殖率＝植物组织出现菌落的平皿数量/平皿总数×100，取3次检测结果的平均值。

2.玉米生理生态指标调查

2.1种子发芽率

每个培养皿中均匀摆放50粒种子，种子表面铺1张滤纸，每个处理(T80-12h、Bb-12h、T80-24h和Bb-24h)4次重复。将培养皿放在温室中，每天加水10mL，芽长达到2mm视为出芽，每天观察并记录发芽种子数目，共历时5d，计算种子发芽率。

2.2幼苗生长势

玉米株高测量时期为5次(每次测量10株)，分别为玉米出苗7d，11d，15d，19d，23d，即叶片拉直顶点至土壤表面的长度。

2.3叶面积

测量时期为4次(每次测量10株)，分别为玉米出苗7d，14d，21d，28d，参考Ruget等[14]的方法，统计每株植物的叶片面积总和，测量叶片长、宽。叶面积＝k×长×宽，k＝0.75。

2.4生物量

取样时期为4次(每次测量10株)，分别为玉米出苗7d，14d，21d，28d，取植物组织的地上部分，称取鲜重，植物材料置于65℃，烘干72h，称取干重。

2.5玉米叶片抗性相关酶活力测定

取样时期为出苗14d，取样部位为完全展开的第3片叶片，每处理取10株，每2株样品混合(测量时5次重复)，样品材料迅速放入-80℃冰箱保存。5种酶活力测定均采用比色法，其中苯丙氨酸解氨酶(PAL)及多酚氧化酶(PPO)活力测定参照张志良等[15]的方法，超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)及过氧化物酶(POD)活力测定使用南京建成试剂盒。

3数据统计与分析

首先采用SPSS 17.0软件对数据进行描述性统计及方差齐性检测，并通过Duncan氏方法进行多重比较及显著性分析，利用Sigmaplot 12.5软件画图。

二、结果与分析

1.球孢白僵菌定殖偏好性

T80-12h和T80-24h处理组中玉米幼苗各部位均未检测到球孢白僵菌，Bb-12h和Bb-24h处理组中玉米根部未检测到球孢白僵菌(数据未显示)。Bb-12h和Bb-24h处理组中浸种时间(12h和24h)对球孢白僵菌在玉米中定殖率的影响差异不显著(P＝2.909，F＝0.126)，球孢白僵菌在玉米不同组织部位(叶和茎)中定殖率差异显著(P<0.05，F＝8.909)。浸种12h叶片中定殖检测率最高，达到40％，茎部平均定殖检测率为10％，浸种24h叶片中定殖检测率为20％，茎部平均定殖检测率为3.33％(图1)。调查结果表明，球孢白僵菌在玉米组织中定殖具有一定的偏好性，叶片＞茎部＞根部，最佳检测部位为植物叶片，玉米幼苗根部未检测出球孢白僵菌，这可能与根系接触杂菌较多有关，根部其他共生菌与球孢白僵菌有较强的竞争力。

2.玉米生理生态指标

2.1种子发芽率

由表1可以看出，玉米种子处理后第5天，浸种时间(12h和24h)对各处理组之间种子累积发芽率影响差异不显著(P＝0.468，F＝0.513)，球孢白僵菌对各处理组之间种子累积发芽率影响差异不显著(P＝0，F＝1)说明球孢白僵菌对种子萌发没有产生影响。但从种子生长状态来看，Bb-12h和Bb-24h处理组种子污染率显著降低，由此推测，球孢白僵菌浸种有利于玉米植株生长。

表1浸种5天种子累积发芽率

Table1 Statistical analysis for germinative percentage of seed

注：数据为平均值±标准误，不同小字母表示0.05水平上差异显著。

2.2幼苗生长势

苗期株高的测定结果表明，不同处理组的株高在各时期呈现一定的差异。从spss软件分析结果来看，浸种时间对幼苗的生长并没有产生显著影响(P＝0.495，F＝0.487)，而球孢白僵菌处理对玉米苗期株高影响及显著(P<0.01，F＝14.887)，其中浸种12h优于24h，出苗19d株高增加最多，增长率为5.34％，出苗15d株高增加最少，增长率为2.67％(图2A)，可见球孢白僵菌浸种对玉米幼苗生长势的效应是正向的，对幼苗株高增加有一定的促进作用。

2.3叶面积

从图2B可以看出，玉米出苗早期，各处理间叶面积无显著差异，随着出苗时间的增加，球孢白僵菌处理组的叶面积有增加趋势，出苗21d各处理间差异最为显著(P<0.01，F＝9.121)，Bb-12h叶面积最大，为256.41cm2，比Bb-24h增加3.44％，比T80-12h增加13.71％。叶面积的增加有利于植物进行光合作用及养分运输，对促进苗期植物的生长尤为关键，可见球孢白僵菌对植物幼苗生长的促进作用是多方面的。

2.4生物量

四个处理组随出苗时期的变化，地上鲜生物量逐渐增加，其中球孢白僵菌处理组重量显著高于对照组，随着出苗时间的增加，球孢白僵菌处理组鲜生物量增长率逐渐加大，Bb-12h高于Bb-24h，出苗28d，达到11.46g，比Bb-24h增加6.98％，比T80-12h增加27.2％(图2C；地上干生物量与鲜生物量变化趋势基本相同，出苗28d，Bb-12h地上干生物量最大，达到0.817g，比Bb-24h增加5.56％，比Bb-12h增加27.2％(图2D)。以上结果表明球孢白僵菌浸种可以促进植株地上生物量的积累，有利于植物储存养分。

2.5玉米叶片抗性相关酶活力

图3结果表明，浸种时间对苗期几种防御酶活性的影响未呈现一致性规律，但球孢白僵菌处理中防御酶活性呈现增加趋势。参照活性较高的对照组计算酶活性增长率，PPO活性Bb-12h比对照增加21.64％，Bb-24h比对照增加15.58％(图3A)；PAL活性Bb-12h增加12.98％，Bb-24h无变化(图3B)；CAT活性Bb-12h无变化，Bb-24h增加9.5％(图3C)；POD活性Bb-12h增加23.04％，Bb-24h无变化(图3D)；SOD活性Bb-12h增加24.90％，Bb-24h增加16.81％(图3E)。

从防御酶的应激反应来看，Bb-12h的活性增长率高于Bb-24h。两种抗病相关防御酶(PPO和PAL)中PPO活性增长率高于PAL，抗氧化活性相关酶(CAT，POD，SOD)中SOD增长率最高。不同的防御酶变化幅度不同，说明其对球孢白僵菌侵染的应激反应不同，球孢白僵菌处理对玉米幼苗生长有一定的诱导抗性，有利于提高幼苗自身抗性。

三、讨论

影响球孢白僵菌在植物中定殖的因素有很多，包括接种方法、栽培介质、菌种种类等，而接种方法在几种因素中最为关键，本发明在玉米苗期定殖规律研究中使用的浸种法，综合考虑了玉米播种特点、操作便捷性及推广应用的可行性。本发明首次优化了侵种方法，明确了最佳浸种时间为12h，最佳检测时期为出苗14d，叶片中定殖检测率达到60％，研究发现球孢白僵菌在植株各部位定殖率不同，叶片和茎部比根部有更高的侵染率，该现象证明内生性球孢白僵菌在植株系统中具有流动性和一定的生态适应性。发明人分析由于植株不同部位组成成分的不同，导致了各部位定殖率存在差异，这一点可以在后续工作中进一步验证。

目前有一些研究表明虫生真菌对植物的生长有促进作用。有报道通过在电镜下观察发现，绿僵菌在土壤中并不是随机分布的，而是有选择性的附着在供试植物的根部，在接种后1-5d，可以显著观测到根毛密度及长度增加，根毛的生长时期也有所提前；还有研究发现用分离得到的3个绿僵菌菌株接种到番茄植株内，结果表明番茄幼苗地上高度，根长以及地上地下生物量干重都有显著增加。本发明表明人工接种球孢白僵菌可以促进玉米幼苗的生长，宏观上证明了球孢白僵菌在玉米组织中定殖对植物生长有着有益的影响，但虫生真菌作为植物体内潜在的生物调控工具，具体诱导哪些关键因子发生改变，具体作用机制仍需要深入研究。

虫生真菌在植物体内定殖可以使植物的抗性增强，一方面可以减缓病原菌对植物的危害程度，另一方面可以通过对植食性昆虫的间接调控保护植物免受害虫侵扰。有报道发现球孢白僵菌能够显著提高棉花和西红柿对立枯丝核菌和腐霉这两种真菌病害的抗性，同时发现球孢白僵菌能够诱导棉花产生对细菌性叶枯病的系统抗性。还有研究证明了球孢白僵菌在香蕉树种定殖可以提高香蕉象甲幼虫的死亡率；之前的研究还发现球孢白僵菌在植物中定殖可以延缓蚜虫和蝗虫的生长发育。本发明初步探索了植物的抗性机制，发现球孢白僵菌在玉米中定殖后，玉米幼苗期几种关键防御酶的活力增强，这几种酶参与了植物的水杨酸途径和茉莉酸途径，与植物抗性密切相关。虫生真菌侵染后，在玉米的整个生育期防御酶活性呈现怎样的变化趋势，同玉米植株的生长是否存在相关性，有待进一步研究。

综上所述，本研究为虫生真菌-植物互作提供了新的证据，对二者的互作机理进行了初步探讨。在未来的工作中，还需更深层的研究虫生真菌促进植物生长、提高抗性的机制，关注虫生真菌的生态适应性及其在生态系统中的作用，明确其生态学特性及变化规律，从而在生产应用上更充分的运用和提高正向作用，最大限度地发挥其寄生害虫、调节生态的潜力。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。