天山云杉胚性愈伤组织高效增殖培养基的制作方法

本发明属于无性繁殖技术领域，具体涉及天山云杉胚性愈伤组织高效增殖培养基。

背景技术：

植物体细胞胚（体胚）发生是双倍体或者单倍体的体细胞在特定条件下，未经性细胞融合而是通过合子胚胎发生类似的途径发育出新个体的过程。植物组织培养中体细胞胚的发生不仅具有普遍性，而且具有数量多，速度快，结构完整的特点，在应用上是一种有效大规模的无性繁殖方法。

目前天山云杉主要通过有性繁殖产生后代。因为，种子成熟率低、生长较慢、繁殖和品种选育困难，所以无性繁殖一直受到各国林业决策部门的重视与林木育种工作者以及森林经营者的特别关注，尤其是现代生物技术的蓬勃发展，如植物组织培养及体细胞胚胎发生技术，具有繁殖效率高、周期短、不受自然条件制约、稳定、选育优良品种，对造林工程具有重大意义等特点。天山云杉体细胞胚愈伤组织的诱导培养已取得了一定的进展，愈伤组织的增殖是体细胞胚胎培养的关键，而在天山云杉体细胞胚愈伤组织的专用增殖培养基鲜见报道。

技术实现要素：

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种天山云杉胚性愈伤组织高效增殖培养基。

本发明报道了天山云杉体细胞胚增殖阶段的技术研究，为实现天山云杉体细胞胚培养的更广泛应用提供坚实的理论基础，同时建立了天山云杉胚性愈伤组织增殖培养的技术平台，为天山云杉遗传改良种质创新、缩短育种周期奠定了研究基础。

本发明提供天山云杉胚性愈伤组织高效增殖培养基，所述培养基为改良SH增殖培养基或改良BM2增殖培养基；

其中，（1）所述改良SH增殖培养基的配方为：

大量元素

硝酸钾(KNO₃) 2500mg/L

硫酸镁(MgSO₄·7H₂O) 400mg/L

磷酸二氢铵（NH4）H₂PO₄ 300mg/L

氯化钙(CaCl₂·2H₂O) 200mg/L

微量元素

五水硫酸铜(CuSO₄·5H₂O) 0.2mg/L

硼酸(H₃BO₃) 5mg/L

一水硫酸锰(MnSO₄·H₂O) 10mg/L

二水钼酸钠(Na₂MoO₄·2H₂O) 0.1mg/L

七水硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O) 1mg/L

碘化钾(KI) 1mg/L

六水氯化钴(CoCl₂·6H₂O) 0.1mg/L

铁盐

乙二胺四乙酸铁钠(FeNaEDTA) 35mg/L

有机物

烟酸(Nicotinie Acid) 5mg/L

盐酸硫胺素(Thiamine-HCl) 5mg/L

盐酸吡哆醇(Pyridoxine-HCl) 0.5 mg/L

肌醇(Myo-Inositol) 1000mg/L

水解酪蛋白(Caseinhydrolysat) 1000mg/L

蔗糖（Saccharose） 20g/L

卡拉胶(Gelrite) 3000mg/L

L-谷氨酰胺 500mg/L

外源生长调节剂

2,4-D 1.10mg/L

6-BA 0.44mg/L；

（2）所述改良BM2增殖培养基的配方为：

大量元素

氯化钙(CaCl₂·2H₂O) 134.5mg/L

硫酸镁(MgSO₄·7H₂O) 400mg/L

磷酸二氢钾KH₂PO₄ 340mg/L

微量元素

四水硫酸锰(MnSO₄·4H₂O) 11.15mg/L

一水硫酸锰(MnSO₄·H₂O) 20.8mg/L

七水硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O) 8mg/L

硼酸(H₃BO₃) 5mg/L

碘化钾(KI) 1mg/L

六水氯化钴(CoCl₂·6H₂O) 0.025mg/L

五水硫酸铜(CuSO₄·5H₂O) 0.24mg/L

二水钼酸钠(Na₂MoO₄·2H₂O) 0.2mg/L

铁盐

乙二胺四乙酸铁钠(FeNaEDTA) 65.1mg/L

有机物

肌醇(Myo-Inositol) 1000mg/L

烟酸(Nicotinie Acid) 0.25mg/L

盐酸吡哆醇(Pyridoxine-HCl) 0.25mg/L

盐酸硫胺素(Thiamine-HCl) 0.5mg/L

L-甘氨酸（Glycine） 1mg/L

水解酪蛋白(Caseinhydrolysat) 500mg/L

蔗糖（Saccharose） 20g/L

卡拉胶(Gelrite) 3000mg/L

L-谷氨酰胺 450mg/L

外源生长调节剂

2,4-D 1.10mg/L

6-BA 0.44mg/L。

作为优选，所述培养基为改良SH增殖培养基。

本发明还提供上述增殖培养基的制备方法，制备时，首先，每升添加除L-谷氨酰胺外的配方量的各组分后，纯净水作为溶剂，搅拌均匀后调pH值至5.8±0.02，然后添加Gelrite（卡拉胶）作为固化剂，封口准备消毒；在121℃，2×10⁷ Pa的压力下进行15min高压灭菌后，将培养基自然冷却至60℃时加入配方量（用孔径为0.22μm的滤器过滤灭菌）的L-谷氨酰胺。然后将培养基倒入培养皿中自然冷却凝固，放置1d后再使用。

本发明还提供上述天山云杉胚性愈伤组织高效增殖的接种方法，其特征在于：是将天山云杉胚性愈伤组织接种于权利要求1或2所述的培养基中，将尺寸为70.3×28mm的培养器皿接种0.65g胚性愈伤组织后（分成4块接种于增殖培养基上），盖上盖子，在黑暗中，温度为23±2℃条件下培养，每周称一次新鲜增殖量并观察增殖的生长状态，直至愈伤组织生长进入停止，各处理均重复5次。首先，将愈伤组织与培养基分离，然后转入无菌培养皿（称量前去皮）进行新鲜增殖的称量。记录数据后再将胚性愈伤组织接回原处继续培养。为了避免污染，上述操作均在超净台内进行。绘制生产曲线，确定最佳继代周期。

本发明建立了天山云杉胚性愈伤组织增殖的的技术平台，确定天山云杉胚性愈伤组织增殖的培养基：改良SH，DCR，1/2DCR，BM和MSG培养基；其中最佳天山云杉胚性愈伤组织增殖的培养基为改良SH，并提出天山云杉胚性愈伤组织增殖的培养条件。本发明为实现天山云杉胚性愈伤组织增殖培养的更广泛应用提供坚实的理论基础，同时建立了天山云杉胚性愈伤组织培养的技术平台，为天山云杉遗传改良种质创新、缩短育种周期奠定了研究基础。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为天山云杉胚性愈伤组织在5种不同增殖培养基上的增殖量与增殖率表现；

（SHT表示SH培养基，其中的T表示为天山云杉）。

图2为不同的天山云杉胚性愈伤组织在改良SH培养基中的增殖情况。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

一、最适培养基的选择

培养基是植物组织培养的重要基质，没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器官，在建立一项新的培养系统时，首先必须找到一合适的培养基培养才有可能成功。

本实验采用DCR、1/2DCR、SH、BM2和MSG为5种增殖培养基，再分别添加外源生长调节剂：1.10mg/L 2,4-D+0.44mg/L 6-BA，作为本实验的5种增殖培养基，并将其分别命名为改良DCR增殖培养基、改良1/2DCR增殖培养基、改良SH增殖培养基、改良BM2增殖培养基和改良MSG增殖培养基。

五种增殖培养基的配方及制备方法如下：

（1）改良SH增殖培养基的配方如下：

大量元素

硝酸钾(KNO₃) 2500mg/L

硫酸镁(MgSO₄·7H₂O) 400mg/L

磷酸二氢铵（NH4）H₂PO₄ 300mg/L

氯化钙(CaCl₂·2H₂O) 200mg/L

微量元素

五水硫酸铜(CuSO₄·5H₂O) 0.2mg/L

硼酸(H₃BO₃) 5mg/L

一水硫酸锰(MnSO₄·H₂O) 10mg/L

二水钼酸钠(Na₂MoO₄·2H₂O) 0.1mg/L

七水硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O) 1mg/L

碘化钾(KI) 1mg/L

六水氯化钴(CoCl₂·6H₂O) 0.1mg/L

铁盐

乙二胺四乙酸铁钠(FeNaEDTA) 35mg/L

有机物

烟酸(Nicotinie Acid) 5mg/L

盐酸硫胺素(Thiamine-HCl) 5mg/L

盐酸吡哆醇(Pyridoxine-HCl) 0.5 mg/L

肌醇(Myo-Inositol) 1000mg/L

水解酪蛋白(Caseinhydrolysat) 1000mg/L

蔗糖（Saccharose） 20g/L

卡拉胶(Gelrite) 3000mg/L

L-谷氨酰胺 500mg/L

外源生长调节剂

2,4-D 1.10mg/L

6-BA 0.44mg/L。

（2）改良DCR增殖培养基的配方如下：

大量元素

硝酸钾(KNO₃) 340mg/L

硝酸铵（NH₄NO₃） 400mg/L

硝酸钙Ca(NO₃)₂·4H₂O 556mg/L

氯化钙(CaCl₂·2H₂O) 85mg/L

硫酸镁(MgSO₄·7H₂O) 370mg/L

磷酸二氢钾KH₂PO₄ 170mg/L

微量元素

四水硫酸锰(MnSO₄·4H₂O) 16.9mg/L

七水硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O) 8.6mg/L

硼酸(H₃BO₃) 6.2mg/L

碘化钾(KI) 0.83mg/L

六水氯化钴(CoCl₂·6H₂O) 0.025mg/L

五水硫酸铜(CuSO₄·5H₂O) 0.25mg/L

二水钼酸钠(Na₂MoO₄·2H₂O) 0.25mg/L

氯化镍（NiCl₂） 0.025mg/L

铁盐

乙二胺四乙酸铁钠(FeNaEDTA) 65.1mg/L

有机物

肌醇(Myo-Inositol) 200mg/L

烟酸(Nicotinie Acid) 0.5mg/L

盐酸吡哆醇(Pyridoxine-HCl) 0.5mg/L

盐酸硫胺素(Thiamine-HCl) 1.0mg/L

L-甘氨酸（Glycine） 2mg/L

蔗糖（Saccharose） 20g/L

卡拉胶(Gelrite) 3000mg/L

L-谷氨酰胺 730mg/L

外源生长调节剂

2,4-D 1.10mg/L

6-BA 0.44mg/L。

（3）改良BM2增殖培养基的配方如下：

大量元素

氯化钙(CaCl₂·2H₂O) 134.5mg/L

硫酸镁(MgSO₄·7H₂O) 400mg/L

磷酸二氢钾KH₂PO₄ 340mg/L

微量元素

四水硫酸锰(MnSO₄·4H₂O) 11.15mg/L

一水硫酸锰(MnSO₄·H₂O) 20.8mg/L

七水硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O) 8mg/L

硼酸(H₃BO₃) 5mg/L

碘化钾(KI) 1mg/L

六水氯化钴(CoCl₂·6H₂O) 0.025mg/L

五水硫酸铜(CuSO₄·5H₂O) 0.24mg/L

二水钼酸钠(Na₂MoO₄·2H₂O) 0.2mg/L

铁盐

乙二胺四乙酸铁钠(FeNaEDTA) 65.1mg/L

有机物

肌醇(Myo-Inositol) 1000mg/L

烟酸(Nicotinie Acid) 0.25mg/L

盐酸吡哆醇(Pyridoxine-HCl) 0.25mg/L

盐酸硫胺素(Thiamine-HCl) 0.5mg/L

L-甘氨酸（Glycine） 1mg/L

水解酪蛋白(Caseinhydrolysat) 500mg/L

蔗糖（Saccharose） 20g/L

卡拉胶(Gelrite) 3000mg/L

L-谷氨酰胺 450mg/L

外源生长调节剂

2,4-D 1.10mg/L

6-BA 0.44mg/L。

（4）改良MSG增殖培养基的配方如下：

大量元素

硝酸钾(KNO₃) 100mg/L

氯化钙(CaCl₂·2H₂O) 440mg/L

硫酸镁(MgSO₄·7H₂O) 320mg/L

氯化钾（KCl） 475mg/L

磷酸二氢钾KH₂PO₄ 170mg/L

微量元素

四水硫酸锰(MnSO₄·4H₂O) 22.3mg/L

七水硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O) 8.6mg/L

硼酸(H₃BO₃) 6.2mg/L

碘化钾(KI) 0.83mg/L

六水氯化钴(CoCl₂·6H₂O) 0.025mg/L

五水硫酸铜(CuSO₄·5H₂O) 0.25mg/L

二水钼酸钠(Na₂MoO₄·2H₂O) 0.25mg/L

铁盐乙二胺四乙酸铁钠(FeNaEDTA) 65.1mg/L

有机物

肌醇(Myo-Inositol) 100mg/L

烟酸(Nicotinie Acid) 0.5mg/L

盐酸吡哆醇(Pyridoxine-HCl) 0.5mg/L

盐酸硫胺素(Thiamine-HCl) 1.0mg/L

蔗糖（Saccharose） 20g/L

卡拉胶(Gelrite) 3000mg/L

L-谷氨酰胺 1460mg/L

外源生长调节剂

2,4-D 1.10mg/L

6-BA 0.44mg/L。

上述五种增殖培养基的配制方法均为：

制备时，首先，每升添加除L-谷氨酰胺外的配方量的各组分后，纯净水作为溶剂，搅拌均匀后调pH值至5.8±0.02，然后添加Gelrite（卡拉胶）作为固化剂，封口准备消毒；在121℃，2×10⁷ Pa的压力下进行15min高压灭菌后，将培养基自然冷却至60℃时加入配方量（用孔径为0.22μm的滤器过滤灭菌）的L-谷氨酰胺。然后将培养基倒入培养皿中自然冷却凝固，放置1d后再使用。

应用上述培养基对天山云杉胚性愈伤组织进行增殖的方法如下：

将胚性愈伤组织（T6，T7，T36，T43，T48）分别接种于上述五种增殖培养基（培养器皿尺寸为70.3×28mm）上进行培养。每培养器皿中接种0.65g的愈伤组织（分成4块接种于增殖培养基）。盖上盖子，在黑暗中，温度为23±2℃条件下培养。每周称一次新鲜增殖量并观察增殖的生长状态，直至愈伤组织生长进入停止，各处理均重复5次。称重时，首先，将愈伤组织与培养基分离，然后转入无菌培养皿（称量前去皮）进行新鲜增殖的称量。记录数据后再将胚性愈伤组织接回原处继续培养。为了避免污染，上述操作均在超净台内进行。绘制生产曲线，确定最佳继代周期。

二、结果与分析

影响胚性愈伤组织增殖的因素之一是培养基，本发明将胚性愈伤组织接种于5种不同培养基上增殖培养，结果显示5种培养基其增殖量与增殖率表现出不一样的变化（见图1），试验数据统计结果表示，使用改良BM2和SH培养基的增殖量和增殖率高于其他培养基，分别为5.74g和为4.55g，增殖率达到782.7%和600%。其他3种培养基（MSG、DCR、1/2DCR）的增殖率低，分别为3.41g、2.69g、2.61g，增殖率达到424.4%、313.2%、301.5%。通过原始统计数据进行方差分析、显著性检验，结果表示，BM2和SH培养基的增殖量显著差异（P<0.05）。其他3种培养基之间无显著差异（P>0.05）。增殖量的高低排序为BM>SH>MSG>DCR>1/2DCR。结果表明，BM2和SH培养基的增殖效果明显优于其他3个培养基。虽然BM2培养基的增殖效果最好，但其继代一次后褐化现象严重。SH培养基继代培养后能够保持较好的胚性，褐化现象较少。

基于此，为了研究个体之间的增殖是否存在差异性，分别选取了5种天山云杉个体胚性愈伤组织(T6，T7，T36，T43，T48)，接种在SH培养基上的增殖情况。试验数据统计结果表明，5种不同个体胚性愈伤组织增殖量变化不明显(图2)。5种个体的增殖量分别为4.63g、4.56g、4.50g、4.11g、4.09g。高低排序为T6>T36>T48>T43>T7。通过方差分析结果表示，各个体之间增殖量无显著性差异(P>0.05)。

图2中，a、b：增殖培养基的胚性愈伤组织；c：胚性胚柄团的显微镜观察；d：胚性愈伤组织的显微镜下观察尺寸：10mm(a，b)；100μm(c，d)。

实施例1

本发明的天山云杉胚性愈伤组织高效增殖培养基为改良SH增殖培养基，具体配方如下：

大量元素

氯化钙(CaCl₂·2H₂O) 134.5mg/L

硫酸镁(MgSO₄·7H₂O) 400mg/L

磷酸二氢钾KH₂PO₄ 340mg/L

微量元素

四水硫酸锰(MnSO₄·4H₂O) 11.15mg/L

一水硫酸锰(MnSO₄·H₂O) 20.8mg/L

七水硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O) 8mg/L

硼酸(H₃BO₃) 5mg/L

碘化钾(KI) 1mg/L

六水氯化钴(CoCl₂·6H₂O) 0.025mg/L

五水硫酸铜(CuSO₄·5H₂O) 0.24mg/L

二水钼酸钠(Na₂MoO₄·2H₂O) 0.2mg/L

铁盐

乙二胺四乙酸铁钠(FeNaEDTA) 65.1mg/L

有机物

肌醇(Myo-Inositol) 1000mg/L

烟酸(Nicotinie Acid) 0.25mg/L

盐酸吡哆醇(Pyridoxine-HCl) 0.25mg/L

盐酸硫胺素(Thiamine-HCl) 0.5mg/L

L-甘氨酸（Glycine） 1mg/L

水解酪蛋白(Caseinhydrolysat) 500mg/L

蔗糖（Saccharose） 20g/L

卡拉胶(Gelrite) 3000mg/L

L-谷氨酰胺 450mg/L

外源生长调节剂

2,4-D 1.10mg/L

6-BA 0.44mg/L。

本发明的培养基的制备方法为：

制备时，首先，每升添加除L-谷氨酰胺外的配方量的各组分后，纯净水作为溶剂，搅拌均匀后调pH值至5.8±0.02，然后添加Gelrite（卡拉胶）作为固化剂，封口准备消毒；在121℃，2×10⁷ Pa的压力下进行15 min高压灭菌后,将培养基自然冷却至60℃时加入配方量（用孔径为0.22μm的滤器过滤灭菌）的L-谷氨酰胺。然后将培养基倒入培养皿中自然冷却凝固，放置1d后再使用。

本发明的天山云杉胚性愈伤组织高效增殖的接种方法为：

将胚性愈伤组织接种于上述增殖培养基（培养器皿尺寸为70.3×28mm）上进行培养，每个培养器皿中接种0.65g的胚性愈伤组织（分成4块接种于增殖培养基上）后，盖上培养器皿盖子，在黑暗中，温度为23±2℃条件下培养。称量时，首先，将愈伤组织与培养基分离，然后转入无菌培养皿（称量前去皮）进行新鲜增殖的称量。记录数据后再将胚性愈伤组织接回原处继续培养。每周称一次新鲜增殖量并观察增殖的生长状态，直至愈伤组织生长进入停止。为了避免污染，上述操作均在超净台内进行。绘制生产曲线，确定最佳继代周期。各处理均重复5次。

实施例2

本发明的天山云杉胚性愈伤组织高效增殖培养基为改良BM2增殖培养基，具体配方如下：

大量元素

氯化钙(CaCl₂·2H₂O) 134.5mg/L

硫酸镁(MgSO₄·7H₂O) 400mg/L

磷酸二氢钾KH₂PO₄ 340mg/L

微量元素

四水硫酸锰(MnSO₄·4H₂O) 11.15mg/L

一水硫酸锰(MnSO₄·H₂O) 20.8mg/L

七水硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O) 8mg/L

硼酸(H₃BO₃) 5mg/L

碘化钾(KI) 1mg/L

六水氯化钴(CoCl₂·6H₂O) 0.025mg/L

五水硫酸铜(CuSO₄·5H₂O) 0.24mg/L

二水钼酸钠(Na₂MoO₄·2H₂O) 0.2mg/L

铁盐

乙二胺四乙酸铁钠(FeNaEDTA) 65.1mg/L

有机物

肌醇(Myo-Inositol) 1000mg/L

烟酸(Nicotinie Acid) 0.25mg/L

盐酸吡哆醇(Pyridoxine-HCl) 0.25mg/L

盐酸硫胺素(Thiamine-HCl) 0.5mg/L

L-甘氨酸（Glycine） 1mg/L

水解酪蛋白(Caseinhydrolysat) 500mg/L

蔗糖（Saccharose） 20g/L

卡拉胶(Gelrite) 3000mg/L

L-谷氨酰胺 450mg/L

外源生长调节剂

2,4-D 1.10mg/L

6-BA 0.44mg/L。

本实施例的培养基的制备方法和应用其增殖天山云杉胚性愈伤组织的方法与实施例1相同。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。