一种植物组织培养脱毒的外植体及其脱毒方法与流程

本发明属于植物脱毒技术领域，特别涉及植物组织培养脱毒外植体脱毒方法。

背景技术：

病毒对植物危害严重，病毒可导致植物树体衰弱，果实变小并且畸形，品质变劣，产量严重下降，病毒病属于难治疗病害，迄今还没有一种有效的药物。因此，培育无病毒植物苗木已经成为防止病毒危害的主要措施。目前通常采用的培育无病毒植物苗木的方法是茎尖组织培养技术。茎尖培养可以从植物组织中脱除病毒，形成无病毒(或脱毒)植株。茎尖培养，有时也称微茎尖培养，此处所称的茎尖实质是指茎尖的分生区。茎尖培养是利用茎尖的分生区为分生组织，其中无病毒的原理，通过组织培养实现脱除病毒的目的。但茎尖大小对成活率和脱毒率有很大的影响，茎尖越大，分化率和成活率越大，但脱毒率越低；反之，如果茎尖越小，虽然脱毒率提高了，但分化率和成活率又大大降低，往往外植体死亡，造成组织培养脱毒失败。

技术实现要素：

为解决传统的茎尖培养法培育脱毒苗时，由于外植体太小，外植体分化为组培苗的难度较大，成苗率自然很低，往往导致接种后的外植体死亡的问题，本发明提供一种植物组织培养脱毒外植体，使得组织培养脱毒操作变得更加简单，大大提高分化率和成活率，使得脱毒的成功率提高。

从茎的结构上看，分生区的形态学下方是伸长区，该区域为分生区和成熟区的过渡区，伸长区的组成既有成熟组织，也有分生组织。根据这一结构的特殊性，可以认为伸长区与分生区具有相似性，因为其中也含有分生组织，故也可以参与植物脱毒苗的培育。发明人将茎尖的分生区与伸长区(甚至包括少部分成熟区的组织)结合在一起，称其为茎尖plus。在发明人的研究中发现，茎尖plus作为外植体，采取诱导胚状体的方式可以培育出脱毒苗。采用茎尖plus作为外植体时，首先要诱导出胚性细胞，然后诱导胚状体和茎叶分化的培养，最后进行生根培养、驯化与移栽。

本发明采用的技术方案如下：

一种植物组织培养脱毒的外植体，该外植体为植物茎尖plus，包括植物茎的分生区和伸长区。

采用上述植物组织培养脱毒的外植体脱毒方法，包括以下步骤：取植物茎尖plus作为外植体，将其灭菌处理后进行胚性细胞培养，在胚性细胞培养的基础上，进行胚状体诱导培养，在胚状体诱导培养的基础上进行茎叶分化培养，然后取无根苗进行病毒检测，挑选病毒阴性的无根苗继续进行增殖培养，扩大繁殖量并进行生根培养，筛选适宜的根系驯化、移栽。

进一步的，上述方法包括以下步骤：

(1)将休眠季或生长季的植物茎尖plus作为外植体用流水清洗，放入30～50wt％大蒜水溶液中灭菌20～40min；

(2)灭菌后的外植体立即接种在最适胚性细胞培养基中，经8～10周培养形成大量的胚性细胞团后，转移到最适胚状体诱导培养基中培养；

(3)经4～6周培养形成胚状体块，切割胚状体块成小块，并将这些小块置于最适茎叶分化培养基上培养；

(4)待茎叶分化阶段的无根苗达到较大数量时，取50～100mg叶片进行主要病毒的检测，将检测结果为阴性的无根苗继续在茎叶分化培养基上培养，到一定数量后再将其转到生根培养基中进行生根培养，

(5)待长出良好的根系后驯化、移栽。

进一步的，所述的最适胚性细胞培养基包括：1.0～3.5mg/L 6-BA，0.1～0.8mg/L NAA。

进一步的，所述的最适胚状体诱导培养基包括：0.5～4.0mg/L 6-BA。

进一步的，所述的最适茎叶分化培养基包括：0.01～0.05mg/L 6-BA。

进一步的，所述的生根培养基包括：0.2～3.5mg/L IBA。

所述的驯化为：将长出良好的根系转移到珍珠岩和沙土上进行驯化。

进一步的，所述步骤(5)中，驯化后将根系移栽在中性土壤中。

本发明另一个目的是请求保护双子叶植物茎尖plus在组织培养脱毒中的应用。

采用茎尖plus作为外植体，在脱除植物病毒方面具有如下优势：

1、操作方便。传统的茎尖培养培育脱毒苗，由于所取外植体太小(一般外植体长度不超过1mm)，工作人员需要在体视显微镜下，才能获取外植体。而且由于外植体太小，很难用镊子夹住并将其接种到培养基上，导致操作速度慢，操作不便。采用茎尖plus作为外植体，由于外植体较大(分生区长度1mm左右，伸长区的长度为3～5mm，故茎尖plus的长度为4～6mm)，不存在上述操作难度大等问题，且无需体视显微镜也可以较为准确的切割外植体。

2、分化率和成活率很高，提高无毒苗培育率。传统的茎尖培养培育脱毒苗，由于外植体太小，外植体分化为组培苗的难度较大，成苗率自然很低，往往导致接种后的外植体死亡，导致实验研究失败。采用茎尖plus作为外植体，由于外植体较大，分化率和成活率相对较高。

3、采用茎尖plus作为外植体，即使生成极少量的脱毒苗，也可以通过组培快速地繁殖起来，不影响脱毒培养。

附图说明

图1为苹果主要病毒ACLSV RT-PCR产物电泳图；

图2为甜樱桃主要病毒PNRSV RT-PCR产物电泳图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但本发明不以任何形式受限于实施例内容。实施例中所述试验方法如无特殊说明，均为常规方法；如无特殊说明，所述试剂和生物材料，均可从商业途径获得。

实施例1：

选双子叶植物“红富士”苹果生长期的茎尖plus作为外植体，流水冲洗后，放入到30％大蒜水溶液灭菌30min，立即接种在最适胚性细胞培养基中(LS+BA2.0mg/L+NAA0.4mg/L+3％蔗糖+琼脂7g/L)上。经8～10周培养形成大量的胚性细胞团后，转移到最适胚状体诱导培养基(LS+6-BA 2.0mg/L+3％蔗糖+7g/L琼脂)中培养，经4～6周培养形成胚状体块，切割胚状体块成0.3～1.0cm3小块，并将这些小块置于最适茎叶分化培养基(LS+BA 0.02mg/L+3％蔗糖+7g/L琼脂)上培养。待茎叶分化阶段的无根苗达到较大数量时，取50～100mg叶片进行主要病毒的检测，如电泳图图1所示。本次检测的病毒是苹果主要病毒之一，即苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV)。检测结果为阴性，即图1中没有出现长度为358bp病毒特异性片段。然后将无根苗继续在茎叶分化培养基上培养，到一定数量后再将其转到适宜的生根培养基中(1/2MS+IBA1.0mg/L+3％蔗糖+7g/L琼脂)中进行生根培养，至长出良好的根系后转移到珍珠岩和沙土上进行驯化，最后移栽在中性壤土中。脱毒成功率可达到3.5～5.6％。

实施例2：

选双子叶植物“红富士”苹果休眠期的叶芽，流水冲洗后，剥去芽外面的鳞片，放入到50％大蒜水溶液灭菌30min，切取芽前端的茎尖plus作为外植体，立即接种在最适胚性细胞培养基中(LS+BA2.0mg/L+NAA0.4mg/L+3％蔗糖+琼脂7g/L)上。经8～10周培养形成大量的胚性细胞团后，转移到最适胚状体诱导培养基(LS+BA2.0mg/L+3％蔗糖+7g/L琼脂)中培养，经4～6周培养形成胚状体块，切割胚状体块成小块，并将这些小块置于最适茎叶分化培养基(LS+BA0.02mg/L+3％蔗糖+7g/L琼脂)上培养。待茎叶分化阶段的无根苗达到较大数量时，取50～100mg叶片进行主要病毒的检测。本次检测的病毒是ACLSV。然后将检测结果为阴性的无根苗继续在茎叶分化培养基上培养，到一定数量后再将其转到适宜的生根培养基中(1/2MS+IBA1.0mg/L+3％蔗糖+7g/L琼脂)中进行生根培养，至长出良好的根系后转移到珍珠岩和沙土上进行驯化，最后移栽在中性壤土中，脱毒成功率可达到3.2～4.6％。

实施例3：

选双子叶植物“佳红”甜樱桃生长期的叶片茎尖plus作为外植体，流水冲洗后，放入到30％大蒜水溶液灭菌30min，立即接种在最适胚性细胞培养基中(LS+BA2.0mg/L+NAA0.3mg/L+3％蔗糖+琼脂7g/L)上。经7～8周培养形成大量的胚性细胞团后，转移到最适胚状体诱导培养基(LS+BA 1.5mg/L+3％蔗糖+7g/L琼脂)中培养，经4～5周培养形成胚状体块，切割胚状体块成小块，并将这些小块置于最适茎叶分化培养基(LS+BA0.05mg/L+3％蔗糖+7g/L琼脂)上培养。待茎叶分化阶段的无根苗达到较大数量时，取50～100mg叶片进行主要病毒的检测，如图2所示。本次检测的病毒是甜樱桃主要病毒之一，即李属坏死环斑病毒(Prunus necrotic ring spot virus，PNRSV)。检测结果为阴性(即电泳图中没有出现长度为449bp病毒特异性片段)然后将检测结果为阴性的无根苗继续在茎叶分化培养基上培养，到一定数量后再将其转到适宜的生根培养基中(1/2MS+IBA1.5mg/L+3％蔗糖+7g/L琼脂)中进行生根培养，至长出良好的根系后转移到珍珠岩和沙土上进行驯化，最后移栽在中性壤土中，脱毒成功率可达到5.3～7.1％。

实施例4：

选双子叶植物“佳红”甜樱桃休眠期的叶芽，流水冲洗后，剥去芽外面的鳞片，放入到50％大蒜水溶液灭菌30min，切取芽前端的茎尖plus作为外植体，立即接种在最适胚性细胞培养基中(LS+BA2.0mg/L+NAA0.3mg/L+3％蔗糖+琼脂7g/L)上。经7～8周培养形成大量的胚性细胞团后，转移到最适胚状体诱导培养基(LS+BA 1.5mg/L+3％蔗糖+7g/L琼脂)中培养，经4～5周培养形成胚状体块，切割胚状体块成小块，并将这些小块置于最适茎叶分化培养基(LS+BA0.05mg/L+3％蔗糖+7g/L琼脂)上培养。待茎叶分化阶段的无根苗达到较大数量时，取50～100mg叶片进行主要病毒的检测。本次检测的病毒是李属坏死环斑病毒。然后将检测结果为阴性的无根苗继续在茎叶分化培养基上培养，到一定数量后再将其转到适宜的生根培养基中(1/2MS+IBA1.5mg/L+3％蔗糖+7g/L琼脂)中进行生根培养，至长出良好的根系后转移到珍珠岩和沙土上进行驯化，最后移栽在中性壤土中，脱毒成功率可达4.8～7.6％。

试验例

一.“红富士”苹果ACLSV RT-PCR检测技术体系：

1.总RNA的提取

⑴取50～100mg叶片(包括待检测“红富士”苹果继代组培苗、阴性和阳性指示植物GF305叶片)，加液氮研磨成粉末状，迅速移入1.5mL Eppendorf管中，加入600μL RNA提取缓冲液(50mmol/L TrisCl、140mmol/L NaCl、10mmol/L EDTA、1％SDS及2％PVP，用1‰DEPC水配制，pH8.0)，1μL RNasin混匀。4℃，12000rpm，离心15min。

⑵取上清，加入等体积氯仿：异戊醇(24∶1)溶液，混匀，4℃，12000rpm，离心10min。重复1～2次，直至不再出现蛋白层。

⑶取水相，加2.5倍体积的无水乙醇及1/10体积3mol/L NaAc(pH5.3)，混匀。-20℃静置2h。取出后，于4℃，12000rpm，离心15min。

⑷弃上清，用200μL 70％无水乙醇洗沉淀，于4℃，12000rpm，5min，清洗多次，至沉淀为纯白色。

⑸室温下干燥后15min左右，溶于30μL 1‰DEPC水中，-20℃保存。

2.RT优化体系及程序：

⑴反应体系：dNTPs 125μmol/L；5×Buffer 1.0μl；RNasin 8U；MgCl₂1.05mmol/L；Cl-Pc 0.60μmol/L；Mo-MLV RTase 50U；总RNA模板0.5μl；用DEPC水补足10μl。

⑵反应程序：37℃，1～1.5h；95℃，5min。

3.PCR优化体系及程序：

⑴反应体系：dNTPs 100μmol/L；10×Buffer(10x)2.5μl；MgCl₂1.5mmol/L；Cl-Pc 0.6μmol/L；Cl-P_h 0.64μmol/L；TaqE 1U；RT产物10μl；用DEPC水补足25μl。

⑵反应程序：94℃1min；52℃2min；72℃2min；循环25～30次，最后一次延伸5min。

二.“佳红”甜樱桃PNRSV RT-PCR检测技术体系：

1.总RNA的提取

⑴取50～100mg叶片(包括待检测“佳红”甜樱桃继代组培苗、阴性和阳性指示植物GF305叶片)，加液氮研磨成粉末状，迅速移入1.5mL Eppendorf管中，加入600μL RNA提取缓冲液(50mmol/L TrisCl、140mmol/L NaCl、10mmol/L EDTA、1％SDS及2％PVP，用1‰DEPC水配制，pH8.0)，1μL RNasin混匀。4℃，12000rpm，离心15min。

⑵取上清，加入等体积氯仿：异戊醇(24∶1v/v)溶液，混匀，4℃，12000rpm，离心10min。重复1～2次，直至不再出现蛋白层。

⑶取水相，加2.5倍体积的无水乙醇及1/10体积3mol/L NaAc(pH5.3)，混匀。-20℃置2h。取出后，4℃，12000rpm，离心15min。

⑷弃上清，用200μL 70％无水乙醇洗沉淀，4℃，12000rpm，5min，清洗多次，至沉淀为纯白色。

⑸室温下干燥后15min左右，溶于30μL 1‰DEPC水中，-20℃保存。

2.RT优化体系及程序：

⑴反应体系：dNTPs 125μmol/L；RT Buffer 1μl；RNasin 8U；MgCl₂1.13mmol/L；Nr-Pc 0.496μmol/L；Mo-MLV RTase 50U；总RNA模板0.5μl。

⑵反应程序：37℃1～1.5h；95℃5min。

3.PCR优化体系及程序：

⑴反应体系：dNTPs 100μmol/L；PCR Buffer 2.5μl；MgCl₂1.2mmol/L；Nr-Pc0.396μmol/L；Nr-P_h 0.456μmol/L；TaqE 1U；RT产物10μl，用DEPC水补足25μl。⑵反应程序：94℃30sec；54℃1min；72℃1min，循环25～30次，最后一轮延伸5min。

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