本发明涉及一种植物组织培养的方法，具体涉及一种速生无刺槐组培苗的生根培养方法，属于生物技术领域。
背景技术：
速生无刺槐是人工选育出的一个刺槐优良无性系新品种，豆科刺槐属落叶乔木，树高可达30～35m。托叶刺小而软，1～2年生树有刺，3年生以后刺基本脱落。树体高大，干型通直，生长迅速，年胸径生长量为2.5～3.0cm，年树高生长量2m以上。叶色浓绿，花白色，有香气，花期5月。主要分布在北部暖温带落叶阔叶林区，分布的城市有沈阳、大连、北京、天津、石家庄、济南、青岛等。适应性强，抗寒、抗旱、耐瘠薄、耐盐碱，是盐碱地以及城市绿化的优良树种。
速生无刺槐属豆科刺槐属树种，有关无刺槐的研究尚处于起始阶段，仅中国农业大学有一篇关于《无刺桅杆槐和无刺槐再生体系的研究》的报道，该文章主要是从叶片再生角度进行无刺槐的研究，主要目的是为了通过建立再生体系进行基因工程育种，文章中无刺桅杆槐和无刺槐的再生率人别为60％、50％，生根率分别为55.6％、72.2％，组培苗移栽成活率为85％。本专利主要目的是通过继代增殖培养实现速生无刺槐的大规模生产，专利中速生无刺槐的增殖系数达到4以上，生根率达到95％以上，大棚炼苗移栽成活率达到90％以上，各项指标标准高，有利于速生无刺槐生产成本的降低，易于实现大规模的工厂化生产。
技术实现要素：
本发明的目的在于，提供一种速生无刺槐组培苗的生根培养方法，以克服现有技术所存在的上述缺点和不足。
本发明所需要解决的技术问题，可以通过以下技术方案来实现：
一种速生无刺槐组培苗的生根培养方法，其特征在于，包括：
(1)实验材料的选择：
选取继代周期为30～40天，生长健壮、叶片舒展，株高为3～5cm的速生无刺槐组培苗为实验材料，切除基部愈伤及基部叶片，保留1cm左右的顶芽、茎段及芽团；
(2)具体实验步骤：
(2.1)无菌外植体的获取；
(2.2)速生无刺槐继代增殖步骤；
(2.3)速生无刺槐生根培养步骤；
(2.4)速生无刺槐继代培养及生根培养条件；
(2.5)速生无刺槐组培苗的炼苗与移栽。
其中，步骤(2.1)无菌外植体的获取
选取1～2年生带芽体的健壮根系埋于育苗基质中，待新芽萌发出来后切割成1～2cm长的顶芽或带腋芽的茎段，剪去叶片留3～5mm叶柄，用75％酒精擦拭外植体表面，用洗衣粉水浸泡2min，再置于流水下冲洗0.5～1h；在超净工作台上，用0.05～0.1％的升汞处理10～15min，用无菌水冲洗5～6次，接种至诱导培养基中(MS+0.01～0.1mg/L 6-BA+30g/L糖+5～7g/L卡拉胶)，每瓶接种一株，获得的无菌外植体的成功率为80％。
其中，步骤(2.2)速生无刺槐继代增殖步骤：
(2.2.1)试验材料
选取步骤1中诱导出来的芽直接进行增殖培养，所选材料生长健壮、叶片舒展，利用顶芽、茎段及芽团进行繁殖，其中顶芽高0.8～1.2cm左右、茎段高0.5～1cm左右含至少一个腋芽、芽团高0.5～1cm至少含两个小芽；
(2.2.2)速生无刺槐继代培养的实验方案设计
速生无刺槐继代培养的基本培养基为改良DKW培养基，其中添加蔗糖30g/L，卡拉胶5～7g/L，土豆30g/L，pH为5.8～6.0。
选用6-BA(6-苄基腺嘌呤)、IBA(吲哚丁酸)、NAA(萘乙酸)植物生长调节剂,速生无刺槐继代培养最佳配方为：改良DKW+0.1mg/L 6-BA+0.2～0.5mg/L KT+0.1mg/L NAA+30g/L土豆+30g/L蔗糖+5～7g/L卡拉胶，采用该配方继代培养的速生无刺槐的最大增殖比例为4.1，且植株长高明显，能用于生根培养的单株苗多。
其中，步骤(2.3)速生无刺槐生根培养步骤
(2.3.1)选取继代培养的速生无刺槐组培苗，选取标准为高度1.5～3cm、健壮、叶片舒展的单株组培苗；
(2.3.2)将选取的继代培养的速生无刺槐组培苗接种至1/2MS生根培养基上，
1/2MS生根培养基中包括：NH4NO3 825mg/L、KNO3 950mg/L、KH2PO4 85mg/L、MgSO4·7H2O 185mg/L、CaCl2·2H2O 220mg/L、FeSO4·7H2O 13.9mg/L、Na2·EDTA·2H2O 18.65mg/L、KI 0.42mg/L、H3BO3 3.1mg/L、MnSO4·H2O8.45mg/L、ZnSO4·7H2O 4.25mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.05mg/L、CoCl2·6H2O0.0125mg/L、CuSO4·5H2O 0.0125mg/L、肌醇50mg/L、烟酸0.25mg/L、盐酸吡哆醇0.25mg/L、盐酸硫胺素0.05mg/L、甘氨酸1.0mg/L、吲哚丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)、20g/L蔗糖、5～7g/L卡拉胶；
(2.3.3)接种30天后统计生根率，生根率＝生根株数/接种株数×100％；
筛选出的最适生根配方为：1/2MS+0.01mg/L6-BA+0.2mg/L NAA+0.2mg/L IBA+20g/L土豆+20g/L蔗糖+5～7g/L卡拉胶。
其中，步骤(2.4)速生无刺槐继代培养及生根培养条件
速生无刺槐组培苗继代及生根培养的条件为：光培养与暗培养交替进行，光培养条件为连续进行12h光照，光照强度为3000lx，培养温度为25℃；暗培养条件为连续进行12h，温度为20℃。
其中，步骤(2.5)速生无刺槐组培苗的炼苗与移栽
(2.5.1)生根培养30～45天的生根苗可进温室炼苗移栽，选取叶色正常、无枯叶黄叶的健壮植株进行移栽；
(2.5.2)将速生无刺槐生根苗根系上的培养基洗净，种植在含珍珠岩、草炭、河沙等基质的营养杯或穴盘中，湿度控制在75～80％，待新根与新叶发出后逐渐降低湿度，培养45～60天，即可得速生无刺槐容器苗，其大棚炼苗成活率为90％以上；
(2.5.3)上述所说基质配方包括上下两层，其中上层1/3容量体积为蛭石：珍珠岩＝1:1；下层2/3容量体积为园土：草炭：河沙：珍珠岩＝2:1:1:1。该基质配方的特点是上层基质疏松透气、保水保湿，利于炼苗前期新根及新叶的发出；下层基质营养丰富，利于后期组培苗营养生长，且根系与基质易于成团、便于容器苗运输。
本发明的有益效果：
本发明主要目的是通过继代增殖培养实现速生无刺槐的大规模生产，采用该方法繁殖的速生无刺槐具有如下优点：
(1)增殖系数高，平均增殖系数达到4以上；
(2)生根率高，最高可达95％；
(3)炼苗成活率高，平均为90％以上。与扦插繁殖相比，速生无刺槐组织培养繁殖的方式，生产上不受季节的限制，繁殖系数大；与再生培养相比，后代不易发生变异，操作方便，能实现大规模的工厂化生产，利于速生无刺槐的繁育及推广。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
实施例1
一种速生无刺槐组培苗的生根培养方法，包括：
一实验材料
选取继代周期为30～40天，生长健壮、叶片舒展，株高为3～5cm的速生无刺槐组培苗为实验材料，切除基部愈伤及基部叶片，保留1cm左右的顶芽、茎段及芽团。
二具体实验步骤
一种速生无刺槐组培苗继代培养的方法，步骤如下：
1、无菌外植体的获取
选取1～2年生带芽体的健壮根系埋于育苗基质中，待新芽萌发出来后切割成1～2cm长的顶芽或带腋芽的茎段，剪去叶片留3～5mm叶柄，用75％酒精擦拭外植体表面，用洗衣粉水浸泡2min，再置于流水下冲洗0.5～1h；在超净工作台上，用0.05～0.1％的升汞处理10～15min，用无菌水冲洗5～6次，接种至诱导培养基中(MS+0.01～0.1mg/L 6-BA+30g/L糖+5～7g/L卡拉胶)，每瓶接种一株，获得的无菌外植体的成功率为80％。
2、速生无刺槐继代增殖步骤：
(1)试验材料
选取步骤1中诱导出来的芽直接进行增殖培养，所选材料生长健壮、叶片舒展，利用顶芽、茎段及芽团进行繁殖，其中顶芽高0.8～1.2cm左右、茎段高0.5～1cm左右含至少一个腋芽、芽团高0.5～1cm至少含两个小芽。
(2)速生无刺槐继代培养的实验方案设计
速生无刺槐继代培养的基本培养基为改良DKW培养基，其中添加蔗糖30g/L，卡拉胶5～7g/L，土豆20～30g/L，pH为5.8～6.0。选用6-BA(6-苄基腺嘌呤)、IBA(吲哚丁酸)、NAA(萘乙酸)等植物生长调节剂。每个处理接种50瓶，每瓶接种6株，实验重复三次，培养30天统计增殖比例及生长情况，从而比较不同培养基对不定芽增殖的影响，进一步筛选出最佳继代增殖培养基。
改良DKW培养基主要针对培养基的大量元素进行改良，其它DKW添加物保持不变，改良表如表1：
表1
速生无刺槐继代培养细胞分裂素6-BA的筛选如表2：
表2
由上述表2结果显示，速生无刺槐继代培养所用细胞分裂素的最佳浓度为0.3～0.8mg/L。在此基础上进行速生无刺槐生长素种类的筛选，各处理结果如表3：
表3
由上述表3结果可知，使用6-BA与三种生长素组合培养的速生无刺槐基部愈伤组织大且蓬松；6-BA与IBA的组合培养的速生无刺槐易出现玻璃化现象；6-BA与IAA组合培养的速生无刺槐虽然丛芽多，但是植株不长高，不利于后期生根。综合分析适合速生无刺槐继代培养的生长素为NAA，在此基础上进一步筛选速生无刺槐的激素水平，各处理结果如表4：
表4
由上述表4结果可知，速生无刺槐继代培养最佳配方为：改良DKW+0.1mg/L 6-BA+0.2～0.5mg/L KT+0.1mg/L NAA+30g/L土豆+30g/L蔗糖+5～7g/L卡拉胶，采用该配方继代培养的速生无刺槐的最大增殖比例为4.1，且植株长高明显，能用于生根培养的单株苗多。
3、速生无刺槐生根培养步骤
(1)选取继代培养的速生无刺槐组培苗，选取标准为高度1.5～3cm、健壮、叶片舒展的单株组培苗；
(2)将选取的继代培养的速生无刺槐组培苗接种至1/2MS生根培养基上。
1/2MS生根培养基中包括：NH4NO3 825mg/L、KNO3 950mg/L、KH2PO4 85mg/L、MgSO4·7H2O 185mg/L、CaCl2·2H2O 220mg/L、FeSO4·7H2O 13.9mg/L、Na2·EDTA·2H2O 18.65mg/L、KI 0.42mg/L、H3BO3 3.1mg/L、MnSO4·H2O8.45mg/L、ZnSO4·7H2O 4.25mg/L、NaMoO4·2H2O 0.05mg/L、CoCl2·6H2O0.0125mg/L、CuSO4·5H2O 0.0125mg/L、肌醇50mg/L、烟酸0.25mg/L、盐酸吡哆醇0.25mg/L、盐酸硫胺素0.05mg/L、甘氨酸1.0mg/L、吲哚丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)、20g/L蔗糖、5～7g/L卡拉胶。
(3)接种30天后统计生根率，生根率＝生根株数/接种株数×100％。
生根培养基激素筛选如表5：
表5
由上述表5结果可知，IBA与NAA单独使用时不利于速生无刺槐组培苗的生根培养，而IBA与NAA配合使用时其生根率明显提高，但是有落叶现象，添加适量6-BA后能解决落叶问题。筛选出的最适生根配方为：1/2MS+0.01mg/L6-BA+0.2mg/L NAA+0.2mg/L IBA+20g/L土豆+20g/L蔗糖+5～7g/L卡拉胶。该配方培养的速生无刺槐组培苗生根率最高可达95％,且根系数量多、根系粗壮，在炼苗移栽过程中提高了速生无刺槐组培苗的成活率，本发明不仅解决了速生无刺槐组培苗生根率低的问题，而且大大降低了生产成本，加快了速生无刺槐的工厂化生产及推广。
4、速生无刺槐继代培养及生根培养条件
速生无刺槐组培苗继代及生根培养的条件为：光培养与暗培养交替进行，光培养条件为连续进行12h光照，光照强度为3000lx，培养温度为25℃；暗培养条件为连续进行12h，温度为20℃。
5、速生无刺槐组培苗的炼苗与移栽
(1)生根培养30～45天的生根苗可进温室炼苗移栽，选取叶色正常、无枯叶黄叶的健壮植株进行移栽；
(2)将速生无刺槐生根苗根系上的培养基洗净，种植在含珍珠岩、草炭、河沙等基质的营养杯或穴盘中，湿度控制在75～80％，待新根与新叶发出后逐渐降低湿度，培养45～60天，即可得速生无刺槐容器苗。其大棚炼苗成活率为90％以上。
(3)上述所说基质配方包括上下两层，其中上层1/3容量体积为蛭石：珍珠岩＝1:1；下层2/3容量体积为园土：草炭：河沙：珍珠岩＝2:1:1:1。该基质配方的特点是上层基质疏松透气、保水保湿，利于炼苗前期新根及新叶的发出；下层基质营养丰富，利于后期组培苗营养生长，且根系与基质易于成团、便于容器苗运输。
三对比分析
目前，国内几乎没有关于速生无刺槐组培苗繁殖方式的报道，一般采用的是扦插繁殖。仅中国农业大学有一篇关于《无刺桅杆槐和无刺槐再生体系的研究》的报道，该文章主要从叶片再生角度进行无刺槐的研究，再生繁殖的主要目的是为了通过建立再生体系进行基因工程育种，文章中无刺桅杆槐和无刺槐的再生率人别为60％、50％，生根率分别为55.6％、72.2％，组培苗移栽成活率为85％。本专利主要目的是通过继代增殖培养实现速生无刺槐的大规模生产，采用该方法繁殖的速生无刺槐具有如下优点：(1)增殖系数高，平均增殖系数达到4以上；(2)生根率高，最高可达95％；(2)炼苗成活率高，平均为90％以上。与扦插繁殖相比，速生无刺槐组织培养繁殖的方式，生产上不受季节的限制，繁殖系数大；与再生培养相比，后代不易发生变异，操作方便，能实现大规模的工厂化生产，利于速生无刺槐的繁育及推广。
以上对本发明的具体实施方式进行了说明，但本发明并不以此为限，只要不脱离本发明的宗旨，本发明还可以有各种变化。