提高罗汉果苷Ⅲ含量的方法与流程

本发明涉及罗汉果栽培技术领域。更具体地说，本发明涉及一种提高罗汉果苷Ⅲ含量的方法。

背景技术：

罗汉果(Siraitia grosvenorii)为中国特有的珍贵药用和甜料植物。其果实性凉、味甘，具有清热润肺，利咽开音，滑肠通便和抗癌等功效，活性成分甜苷V为世界上最强的非糖甜味物质之一，是蔗糖甜度的300-400倍，广泛应用于食品、保健品和药品中，是糖尿病人、肥胖者和高血压患者的理想糖替代品。研究发现，甜苷V是由苷Ⅲ等低苷转化而来，特别是在果实发育后期，苷Ⅲ等低苷被完全消耗殆尽转化成甜苷V，然而，苷Ⅲ只存在占果重不足15％的果肉内，且含量极低，严重制约了罗汉果产业的健康发展。

茉莉酸甲酯作为植物信号诱导子能够安全有效地激发植物次生代谢物的产生和积累。因此，优选合适的茉莉酸甲酯施用时间和浓度，可以最大限度地提高药用植物活性成分的含量。现有技术中未见有茉莉酸甲酯提高罗汉果苷Ⅲ含量的报道。

技术实现要素：

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种提高罗汉果苷Ⅲ含量的方法，具有见效快、成本低、操作简单、方便实施、产品无毒无残留等特征，以满足罗汉果苷Ⅲ的大规模生产。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种提高罗汉果苷Ⅲ含量的方法，将罗汉果组培苗接种于含有茉莉酸甲酯的固体培养基中进行组织培养28～35天；其中，茉莉酸甲酯的浓度为50-400μmol/L。

优选的是，所述固体培养基中还包括基础培养基，其配方为：MS、1.5mg/L 6-BA、0.3mg/L IBA、3.5g/L琼脂、30g/L蔗糖和1.0g/L活性炭。

优选的是，罗汉果组培苗组织培养的条件为：相对湿度60-66％、光照强度1400lux、光照时间8h/d、温度23±2℃。

优选的是，固体培养基的配制方法如下：将茉莉酸甲酯溶解于体积分数为2％的乙醇水溶液中，配制成50mmol/L的茉莉酸甲酯母液，并用0.22μm的微孔滤膜灭菌，将灭菌后的茉莉酸甲酯母液添加到凝固前的基础培养基中，至茉莉酸甲酯浓度为50-400μmol/L，灭菌并冷却至24-26℃。

优选的是，所述固体培养基中茉莉酸甲酯的浓度为200-245μmol/L。

优选的是，将经固体培养基培养的罗汉果组培苗移栽后，待授粉后40-50天，每天早、中、晚在罗汉果表面喷洒茉莉酸甲酯溶液至表面滴水，连续喷洒10天，所述茉莉酸甲酯溶液中含有浓度为50-400μmol/L的茉莉酸甲酯。

优选的是，所述茉莉酸甲酯溶液中含有浓度为200-245μmol/L的茉莉酸甲酯；

所述茉莉酸甲酯溶液的制备方法为：将茉莉酸甲酯用2％的乙醇水溶液溶解后加水定容至茉莉酸甲酯的浓度为200-245μmol/L。

优选的是，组织培养之后，将罗汉果组培苗距离根部1cm以上部位划伤1-2个0.8mm深的伤口，并将含有0.03mg/L蜂毒和0.2mg/L硝酸钙的诱导剂滴涂于伤口处，每株罗汉果组培苗滴涂0.05mL，然后将芦荟胶涂覆于伤口处形成厚度为1-1.5mm厚度的膜，再将罗汉果组培苗置于波长为280-315nm的中波紫外线下辐射处理0.5h后用于移栽。

优选的是，

罗汉果组培苗移栽至田间的具体步骤为：

在田间挖深度为8～14cm的种植坑，并在种植坑的底部铺设聚乙烯醇薄膜，之后在种植坑内插入育苗杯，再在育苗杯内倒入杀菌后的育苗基质至与种植坑外的土层高度相同，将罗汉果组培苗种植于育苗基质中，并使罗汉果组培苗的叶片位于育苗杯外后，在育苗基质上依次铺设1～2cm厚的保水剂层和1～3cm厚的填料层，所述填料层包括质量比为1:5:8～10远红外陶瓷粉、红糖和草炭，再在填料层的表面铺设一层纱布，使罗汉果组培苗穿过纱布，之后在纱布上铺设粗石块，移栽10～20d后，取出粗石块和纱布，抽出育苗杯，将填料层填入抽出育苗杯后形成的环沟中，若填料层将环沟填满后还有多余，则将多余的填料层埋入育苗基质中或进行回收，若填料层未能将环沟填满，则用育苗基质填充环沟至与种植坑外的土层高度相同；其中，

所述育苗杯包括：

杯体，其为圆筒体形，所述杯体的侧壁上沿其圆周方向间隔设置有多个出水孔，所述出水孔位于纱布的上方，粗石块与所述出水孔不接触；

积液板，其为直径上大下小的圆台形，所述积液板的内部中空，且顶部和底部均敞开，所述积液板的顶部的直径与所述杯体的内径相等，所述积液板的顶部与所述杯体的内侧壁固定连接，所述积液板与所述杯体一体成型，且位于所述出水孔的上方。

优选的是，

每次早、中喷洒茉莉酸甲酯溶液后，对罗汉果植株进行全遮光30min。

本发明至少包括以下有益效果：

本发明通过在罗汉果组培苗和种植罗汉果时施加茉莉酸甲酯，以诱导罗汉果苷Ⅲ代谢关键酶(如葡萄糖基转移酶和细胞色素P450酶等)基因的高表达，从而在短期内快速提高罗汉果苷Ⅲ的含量。

本发明通过在罗汉果组培苗移栽后，于授粉后5-10天采用含有茉莉酸甲酯的诱导液喷洒罗汉果表面，在短期内进一步刺激并诱导罗汉果中罗汉果苷ⅡE代谢关键酶的表达，从而促进促进罗汉果苷ⅡE的生物合成。

本发明操作简便，成本低，对环境友好，适于规模化生产，具有较强的实用性和推广价值。

本发明在罗汉果组培苗移栽时采用了育苗杯，将幼苗种植于育苗杯的中部，并使叶片位于育苗杯外，能在移栽初期防止土传病害的发生，为幼苗提供丰富的营养和适宜的生长环境，能提高幼苗的成活率，进而能提高罗汉果的产量和罗汉果苷Ⅳ的提取量，也能对罗汉果幼苗的生长起导向作用，防止其长歪。在浇水过多或雨量较大时，育苗杯内过多的水经填料层和纱布过滤后从出水孔出来，能防止育苗杯内积水，这样也不会有杂质堵塞出水孔。当土壤干旱时，可以只往育苗杯内浇水，无需对育苗杯外的土壤施水，节约了水资源。因积液板为漏斗形，这样方便浇水，使浇的水都能流至位于中部的幼苗上。育苗杯可反复使用，节约了成本。

本发明在诱导处理培养之后移栽之前，将罗汉果组培苗根部划伤后滴涂含有蜂毒和纳米氧化锌的诱导剂，并用芦荟胶涂覆后置于中波紫外线下辐射处理，目的是划伤有助于加速蜂毒进入罗汉果组培苗，促使蜂毒进行化学刺激，诱导罗汉果苷Ⅲ的生物合成功能基因表达，打破罗汉果苷Ⅲ合成过程中的限速步骤，在短时间内加速罗汉果苷Ⅲ的合成与积累，硝酸钙溶液可以促进蜂毒快速分散于罗汉果内部，同时还起抑菌作用，芦荟胶起固封蜂毒促使其进入罗汉果组培苗根部，并起保湿抑菌促进罗汉果组织细胞再生，提高损伤处细胞活力，提高存活率的作用，另中波紫外线穿透性强，能刺激划伤后的罗汉果组培苗为加强自身防御而加快该阶段的生物合成，从而进一步促进汉果苷Ⅲ的生物合成功能基因表达；

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明所述的育苗杯的结构示意图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得；在本发明的描述中，术语“横向”、“纵向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，并不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

实施例1

一种提高罗汉果苷Ⅲ含量的方法，将罗汉果组培苗接种于含有茉莉酸甲酯的固体培养基中进行组织培养28天，对罗汉果组培苗施加茉莉酸甲酯，诱导罗汉果苷Ⅳ代谢关键酶(如葡萄糖基转移酶和细胞色素P450酶等)基因的高表达，从而在短期内快速提高罗汉果苷Ⅲ的含量，其中，茉莉酸甲酯的浓度为400μmol/L。之后采用常规的罗汉果栽培方法进行栽培至结罗汉果。在本实施例中，固体培养基中基础培养基的配方为：MS、1.5mg/L6-BA、0.3mg/L IBA、3.5g/L琼脂、30g/L蔗糖和1.0g/L活性炭，在固体培养基凝固前加入了茉莉酸甲酯，使其浓度为400μmol/L。

实施例2

一种提高罗汉果苷Ⅲ含量的方法，

步骤一组织培养，将罗汉果组培苗接种于含有茉莉酸甲酯的固体培养基中进行组织培养35天，培养条件为相对湿度60-66％、光照强度1400lux、光照时间8h/d、温度23±2℃，其中，所述固体培养基包括：基础培养基(MS、1.5mg/L 6-BA、0.3mg/L IBA、3.5g/L琼脂、30g/L蔗糖、1.0g/L活性炭)和220μmol/L的茉莉酸甲酯；固体培养基的配制方法如下：将茉莉酸甲酯溶解于体积分数为2％的乙醇水溶液中，配制成50mmol/L的茉莉酸甲酯母液，并用0.22μm的微孔滤膜灭菌，将灭菌后的茉莉酸甲酯母液添加到凝固前的基础培养基中，至茉莉酸甲酯浓度为220μmol/L，灭菌并冷却至26℃，能防止茉莉酸甲酯的乙醇母液携带细菌，影响组培苗的生长。

步骤一移栽培养，将经固体培养基培养的罗汉果组培苗移栽，待授粉后40天，每天早、中、晚在罗汉果表面喷洒茉莉酸甲酯溶液至表面滴水，连续喷洒10天，所述茉莉酸甲酯溶液中含有浓度为220μmol/L的茉莉酸甲酯。所述茉莉酸甲酯溶液的制备方法为：将茉莉酸甲酯用2％的乙醇水溶液溶解后加水定容至茉莉酸甲酯的浓度为220μmol/L。

实施例3

在实施例2的基础上，组织培养之后移栽之前，将罗汉果组培苗距离根部1cm以上部位划伤1-2个0.8mm深的伤口，并将含有0.03mg/L蜂毒和0.2mg/L硝酸钙的诱导剂(溶剂为水)滴涂于伤口处，每株罗汉果组培苗滴涂0.05mL，然后将芦荟胶涂覆于伤口处形成厚度为1-1.5mm厚度的膜，再将罗汉果组培苗置于波长为280-315nm的中波紫外线下辐射处理0.5h后用于移栽。

实施例4

在实施例2的基础上，罗汉果组培苗移栽至田间的具体步骤为：

如图1所示，在田间挖深度为12cm的种植坑，并在种植坑的底部铺设聚乙烯醇薄膜，防止杀菌后的育苗基质与种植坑底部的土壤接触，防止土传病害的发生，聚乙烯醇薄膜可降解，不会污染环境，也不会阻碍幼苗的根部向下生长，之后在种植坑内插入育苗杯，再在育苗杯内倒入杀菌后的育苗基质150至与种植坑外的土层高度相同，为幼苗提供无菌的生长环境，育苗基质为栽培罗汉果时用到的任何一种基质，只是对其进行了杀菌，将罗汉果组培苗种植于育苗基质中，并使罗汉果组培苗的叶片位于育苗杯外后，在育苗基质上从下到上依次铺设1.5cm厚的保水剂层130和2cm厚的填料层140，所述填料层包括质量比为1:5:8～10远红外陶瓷粉、红糖和草炭，再在填料层的表面铺设一层纱布，使罗汉果组培苗穿过纱布，之后在纱布上铺设粗石块，移栽10～20d后，取出粗石块和纱布，抽出育苗杯，将填料层填入抽出育苗杯后形成的环沟中，若填料层将环沟填满后还有多余，则将多余的填料层埋入育苗基质中或进行回收，若填料层未能将环沟填满，则用育苗基质填充环沟至与种植坑外的土层高度相同。即若环沟较浅，则用填料层即可填满，则无需再填充育苗基质，若填料层填满环沟后还有剩余，则将剩余部分埋入育苗基质中或回收后再利用，若环沟较深，则先将填料层填充至环沟中，再用育苗基质填充环沟至与种植坑外的土层高度相同；填料层具有提高罗汉果组培苗移栽后存活率的作用，和本实施例的移栽方法结合能大大提高罗汉果组培苗的存活率。其中，

所述育苗杯100包括：

杯体101，其为圆筒体形，所述杯体的侧壁上沿其圆周方向间隔设置有多个出水孔102，所述出水孔位于纱布120的上方，粗石块与所述出水孔不接触；

积液板103，其为直径上大下小的圆台形，所述积液板的内部中空，且顶部和底部均敞开，所述积液板的顶部的直径与所述杯体的内径相等，所述积液板的顶部与所述杯体的内侧壁固定连接，所述积液板与所述杯体一体成型，且位于所述出水孔的上方。

本方案提供的提高罗汉果苷Ⅲ含量的方法中，在罗汉果组培苗移栽时采用了育苗杯，将幼苗种植于育苗杯的中部，并使叶片位于育苗杯外，能在移栽初期防止土传病害的发生，为幼苗提供丰富的营养和适宜的生长环境，能提高幼苗的存活率，进而能提高罗汉果的产量和罗汉果苷Ⅲ的提取量，也能对罗汉果幼苗的生长起导向作用，防止其长歪。在浇水过多或雨量较大时，育苗杯内过多的水经填料层和纱布过滤后从出水孔出来，能防止育苗杯内积水，这样也不会有杂质堵塞出水孔。当土壤干旱时，可以只往育苗杯内浇水，无需对育苗杯外的土壤施水，节约了水资源。因积液板为漏斗形，这样方便浇水，使浇的水都能流至位于中部的幼苗上。育苗杯可反复使用，节约了成本。

实施例5

在实施例2的基础上每次早、中喷洒茉莉酸甲酯溶液后，对罗汉果植株进行全遮光30min，30min过后罗汉果植株按正常光照处理，不再进行全遮光。

对照组1：采用普通的栽培方法种植罗汉果，整个栽培期间不施加茉莉酸甲酯。

每一个实施方案得到的30棵罗汉果果树上任选其中10棵中得到的罗汉果果实进行平行试验，采用HPLC法进行罗汉果苷Ⅲ含量检测。

采用实施例1～5的方法培育罗汉果，对照组1采用普通的栽培方法种植罗汉果，并检测通过实施例1-5和对照组1种植得到的罗汉果中的罗汉果苷Ⅲ含量，结果见表1。

表1

存活率实验：用实施例2和实施例4的方法分别培养50株罗汉果组培苗，之后移栽，在一个月后检查存活率，其中采用实施例2培育的50株罗汉果组培苗的存活率为78％，采用实施例4培育的50株罗汉果组培苗的存活率为98％，说明使用实施例4的移栽方法能显著提高罗汉果组培苗的成活率从而间接提高罗汉果苷Ⅲ的提取量。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。