鸡冠菜小孢子培养方法与流程

本发明涉及鸡冠菜小孢子培养方法。

背景技术：

鸡冠菜是江浙一带的一个地方白菜类蔬菜品种，叶片边缘呈波浪形，多皱折，形状似鸡冠，故称鸡冠菜。鸡冠菜具有较高的营养价值，含有丰富的维生素和矿物质，炒食柔嫩多汁，以叶柄和叶片食用，经腌制加工后的雪菜色泽鲜黄、香气浓郁、滋味清脆鲜美，深受消费者欢迎。但鸡冠菜种质资源流失严重已濒于绝种，名、特、优蔬菜地方种质资源的收集保护工作不容忽视。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种鸡冠菜小孢子培养方法，采用该方法能获得大量的双单倍体。

为了解决上述技术问题，本发明提供如下一种鸡冠菜小孢子培养方法，依次包括以下步骤：

1)、从鸡冠菜主花序、一次分枝花序上摘取0.3～0.5cm大小的花蕾，置4±0.5℃冷藏(冰箱冷藏)72±2小时，然后将冷藏的花蕾取出后用水冲洗(放入纱布袋中用自来水冲洗半小时)；

2)、取步骤1)所得的15～20枚水冲洗后的花蕾消毒、无菌水冲洗后，加入5ml的NLN培养液，挤压花蕾(用玻璃棒研碎挤压花蕾，目的是将小孢子挤出)，匀浆，过滤(40μm～50μm过滤器过滤去除花蕾表皮等碎片)，滤液离心(500～800r/min离心5min)，去上清液，在所得的沉淀中加入15ml～18ml NLN培养液；再重复上述过滤、滤液离心，去上清液；在第二次离心所得的沉淀中加8ml诱导胚状体培养基，得小孢子悬浮液；

上述消毒可具体为：取步骤1)所得的15～20枚冲洗后的花蕾加入10ml质量浓度为5.0％～5.6％(体积％)次氯酸钠溶液，摇床(50～80r/min)消毒20分钟；

所述无菌水冲洗的次数为3次；

3)、取步骤2)所得小孢子悬浮液0.5ml于培养皿(6cm培养皿)中，加入3±0.5ml的诱导胚状体培养基(从而使培养皿底部被培养基盖满)，再加入0.2ml～0.3ml混合活性碳，混匀后密封培养皿置于32±1℃的恒温箱中黑暗培养72±2小时，之后移至25±1℃进行暗培养，当肉眼可见胚状体时，将培养皿移至摇床(45～50r/min)于25±1℃继续黑暗培养；

所述混合活性碳的制备方法为：将1g的活性碳溶解于50±2ml诱导胚状体培养液中；

4)、将步骤3)摇床培养15～20d后的胚状体(此时胚状体发育成鱼雷形状)移入植株再生培养基中，于25±1℃进行光培养，光照时间12h·d^-1，光强为30～40μmol·m^-2·s^-1，培养3～4周后胚状体分化成试管苗；上述光照和暗培养交替进行；暗培养时的温度控制在22±1℃；

5)、将步骤4)所得试管苗切除周围愈伤组织后直接移入增殖培养基中，继续25±1℃光培养，光照时间12h·d^-1，光强为30～40μmol·m^-2·s^-1；上述光照和暗培养交替进行；暗培养时的温度控制在22±1℃；

备注说明：1个胚状体再生为1个单株小苗，但小苗基部会有部分愈伤组织，如不去除愈伤组织会影响增殖效果；

当增殖培养基中培养所得的小苗Ⅰ诱导出不定芽且小苗Ⅰ长到2.0～3.0cm高时(时间约30～35d)结束上述增殖培养，以2～3株不定芽为一丛进行割取作为丛生小苗Ⅱ；

6)、以丛生小苗Ⅱ替代切除周围愈伤组织后的试管苗，重复上述步骤5)，从而实现继代增殖培养；

7)、在步骤5)中，将切除周围愈伤组织后的试管苗直接增殖培育成3.0～5.0cm高，然后转入生根培养基进行培育；

或者将丛生小苗Ⅱ在增殖培养基中增殖培育成3.0～5.0cm高(约需要一个月，培养条件同步骤5)，割取单株小苗后转入生根培养基进行培育；

待生根培养基上的苗长出3～5片叶子并形成根系后(约20～25d)，得到可移栽植株；培养条件：25±1℃光培养，光照时间12h·d^-1，光强为30～40μmol·m^-2·s^-1，光照和暗培养交替进行，暗培养时的温度控制在22±1℃。

作为本发明的鸡冠菜小孢子培养方法的改进：

将步骤7)所得的小植株移至基质培养钵中，浇(定期浇)水及营养液(常规营养液)；待小植株成活后移入温室驯化，以便逐渐适应大田条件；

基质为泥炭：珍珠岩＝2:1的质量比。

作为本发明的鸡冠菜小孢子培养方法的进一步改进：

步骤2)、步骤3)诱导胚状体培养基为：改良NLN基础培养基+2,4-D 0.02～0.05mg/L+蔗糖130g/L，pH为6.0。

该诱导胚状体培养基的制作方法为：在1L的改良NLN基础培养基中加入2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)0.02～0.05mg、蔗糖130g均匀混合，利用1mol/L的KOH或1mol/L的HCl调节pH为6.0。

作为本发明的鸡冠菜小孢子培养方法的进一步改进：步骤4)植株再生培养基为1/4MS基础培养基+蔗糖20g/L+琼脂粉8g/L，pH为5.8。

该植株再生培养基的制作方法为：在1L的1/4MS(含1/4MS大量，全量的MS微量、铁盐和有机成份)中分别加入蔗糖20g、琼脂粉8g均匀混合，利用1mol/L的KOH或1mol/L的HCl调节pH为5.8。

作为本发明的鸡冠菜小孢子培养方法的进一步改进：步骤5)、步骤6)增殖培养基为MS基础培养基+6-BA 0.2～0.5mg/L+蔗糖20g/L+琼脂粉8g/L，pH为5.8。

该增殖培养基的制作方法为：在1L的MS基础培养基中分别加入6-苄基腺嘌呤(6-BA)0.2～0.5mg、蔗糖20g、琼脂粉8g均匀混合，利用1mol/L的KOH或1mol/L的HCl调节pH为5.8。

作为本发明的鸡冠菜小孢子培养方法的进一步改进：步骤7)生根培养基为1/2MS基本培养基+蔗糖20g/L+琼脂粉8g/L，pH为5.8。

生根培养基的制作方法为：在1L的1/2MS(含1/2MS大量，全量的MS微量、铁盐和有机成份)中分别加入蔗糖20g、琼脂粉8g均匀混合，利用1mol/L的KOH或1mol/L的HCl调节pH为5.8。

在本发明中：改良NLN基础培养基为NLN基础培养基的大量元素、微量元素、有机成份+MS基础培养基的铁盐，即，具体如下表1所述(为常规配方)：

表1、改良NLN基础培养基

注：上述为每L改良NLN基础培养基的成分含量，余量为水。

小孢子培养是指直接从花蕾或花药中获得小孢子群体进行培养的方法，由于小孢子培养较花药培养效率高，还可排除花药壁和绒毡层组织等体细胞的影响，因此受到育种学家的青睐，使用常规方法，选育一个纯合的自交系或自交不亲和系一般需要5～8年时间，而运用小孢子培养技术在1～2年就可以获得大量的双单培体植株，通过小孢子培养快速、有效地获得的纯系，可直接用于培育新品种或作为优良亲本间接应用于品种改良。从花药中分离获得的小孢子是单倍体又是单细胞，由于分离小孢子具有极强的胚胎发生能力和植株再生潜力，小孢子培养具有与单细胞微生物系统相似的所有优势，加倍后的双单倍体纯系通过筛选能获得目的突变性状，因而是突变诱导和突变体产生的理想途径。同时由于有大量的小孢子及胚体产生，增加了获得有益性状的机率，双单倍体的快速纯合，对多种性状的筛选能一步到位，提高了选择机率，也加快了育种进程。小孢子培养技术的应用可以加快提纯复壮与杂种纯合速度，创制新种质材料，为蔬菜品种的选育提供新的技术手段。尽管我国在芸苔属作物小孢子培养方面有较多研究，但对鸡冠菜的小孢子培养研究尚未见报导。

综上所述，本发明建立的小孢子培养法，为地方蔬菜品种“鸡冠菜”的提纯复壮、创制新种质材料提供理论依据和技术支撑。

本发明具有如下技术优势：

1)、本发明明确了鸡冠菜花蕾0.3～0.5cm大小时小孢子发育正处于单核中晚期，采用4℃低温预处理72小时，低温预处理能改善花粉的生理状态，延缓花粉退化，提高内源激素的水平，启动雄核发育，适宜的温度和时间处理可改善小孢子代谢活动，利于小孢子适应离体后的培养环境，促使大部分的小孢子得以正常生长。

2)、本发明诱导胚状体培养基中添加0.02～0.05mg/L2,4-D，使胚状体的诱导率增率得到提高。

3)、本发明采用1/4MS基本培养基作为无菌苗培养基(即，作为植株再生培养基)，因为1/4MS基本培养基中无机盐浓度相对较低，植株长的较快，有利于胚状体分化成苗。

4)、本发明在增殖培养基中添加0.2～0.5mg/L 6-BA，发现试管苗增殖倍数在2～3(每株试管苗可增殖2～3个簇生小苗)，并且比不添加6-BA的健壮，但6-BA浓度过高会引进试管苗玻璃化。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为实施例1的鸡冠菜处于单核中晚期花蕾的小孢子的电镜图；

图2为实施例1的小孢子分裂图；

图3为实施例1的小孢子培养后呈现胚状体的电镜图图；

图4为实施例1的小孢子培养后呈现鱼雷期的电镜图；

图5为实施例1的小孢子培养胚状体的生长图；

图6为实施例1的小孢子培养将胚状体转入固体培养基分化培养图；

图7为实施例1的小孢子培养胚状体分化苗图；

图8为实施例1的小孢子培养瓶苗增殖培养图；

图9为实施例1的小孢子培养瓶苗生根瓶苗图；

图10为实施例1的小孢子培养瓶苗移栽驯化图；

图11为实施例1的小孢子培养DH群体田间生长情况图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1、一种鸡冠菜小孢子培养方法，依次进行以下步骤：

1)、从鸡冠菜主花序、一次分枝花序上摘取0.3～0.5cm大小的花蕾(如图1电镜所观察到小孢子处于单核中晚期)，置4℃冰箱冷藏72小时，然后将冷藏的花蕾取出并放入纱布袋中用自来水冲洗半小时；

2)、取步骤1)所得的15～20枚冲洗后的花蕾加入10ml浓度为5.0％～5.6％次氯酸钠溶液，摇床(50～80r/min)消毒20分钟后用无菌水冲洗3次，加入5ml的NLN培养液，用玻璃棒研碎挤压花蕾将小孢子挤出，轻轻匀浆，过滤(40μm～50μm过滤器过滤去除花蕾表皮等碎片)，滤液离心(500～800r/min离心5min)，去上清液，在所得的沉淀中加入15ml～18ml NLN培养液，再重复上述过滤、滤液离心，去上清液；在第二次离心所得的沉淀中加8ml诱导胚状体培养基，得小孢子悬浮液；

3)、将步骤2)所得小孢子悬浮液0.5ml加入6cm培养皿中，再加入3ml诱导胚状体培养基(从而使培养皿底部被培养基盖满)，另加0.3ml混合活性碳(将1g的活性碳溶解于50ml诱导胚状体培养基中制备而得)，混匀后密封培养皿置32±1℃的恒温箱中黑暗培养72h，之后移至25±1℃进行暗培养，当肉眼可见胚状体时，将培养皿移至摇床于25±1℃继续培养(45～50r/min，黑暗)，如图2、图3、图4所显示的诱导胚状体的进程；

诱导胚状体的培养基为：改良NLN基础培养基+2,4-D 0.05mg/L+蔗糖130g/L，pH为6.0

4)、步骤3)摇床培养15～20d后胚状体发育成鱼雷形状时(如图5所示)，将胚状体移入植株再生培养基中(图6所示)，于25±1℃下光培养，光照时间12h·d^-1，光强为30～40μmol·m^-2·s^-1，约3～4周后胚状体分化成试管苗(图7)；上述光照和暗培养交替进行；暗培养时的温度控制在22±1℃；

植株再生培养基为1/4MS基础培养基+蔗糖20g/L+琼脂粉8g/L，pH为5.8。

5)、将步骤4)所得试管苗切除周围愈伤组织，直接移入增殖培养基中(图8)，继续25±1℃光培养，光照时间12h·d^-1，光强为30～40μmol·m^-2·s^-1；上述光照和暗培养交替进行；暗培养时的温度控制在22±1℃；

备注说明：1个胚状体再生为1个单株小苗，但小苗基部会有部分愈伤组织，如不去除愈伤组织会影响增殖效果；

增殖培养基为MS基础培养基+6-BA 0.3mg/L+蔗糖20g/L+琼脂粉8g/L，pH为5.8。

当增殖培养基中培养所得的小苗Ⅰ诱导出不定芽且小苗Ⅰ长到2.0～3.0cm高时(时间约30～35d)结束上述增殖培养，以2～3株不定芽为一丛进行割取作为丛生小苗Ⅱ；

6)、以丛生小苗Ⅱ替代切除周围愈伤组织后的试管苗，重复上述步骤5)，从而实现继代增殖培养；

即，将所得的丛生小苗Ⅱ转接至增殖培养基中继续培养，每隔30～35d重复步骤6)进行继代增殖培养；培养条件：25±1℃光培养，光照时间12h·d^-1，光强为30～40μmol·m^-2·s^-1，光照和暗培养交替进行，暗培养时的温度控制在22±1℃；

7)、在步骤5)中，将切除周围愈伤组织后的试管苗直接增殖培育成3.0～5.0cm高，然后转入生根培养基进行培育；

或者将丛生小苗Ⅱ在增殖培养基中增殖培育成3.0～5.0cm高(约需要一个月，培养条件同步骤5)，割取单株小苗后转入生根培养基进行培育；

待生根培养基上的苗长出3～5片叶子并形成根系后(约20～25d)，得到可移栽植株(图9)；培养条件：25±1℃光培养，光照时间12h·d^-1，光强为30～40μmol·m^-2·s^-1，光照和暗培养交替进行，暗培养时的温度控制在22±1℃。

生根培养基为1/2MS基本培养基+蔗糖20g/L+琼脂粉8g/L，pH为5.8。

8)、将步骤7)所得的小植株移至基质(泥炭:珍珠岩＝2:1)培养钵中，定期浇水及营养液(图10)；待小植株成活后移入温室驯化，以便逐渐适应大田条件(图11)。

采用本发明的方法可以得到大量的七星鸡冠菜小孢子培养试管苗。

对比实验1：相对于实施例1，更改了低温预处理方式，具体如下：

在上午9～10点从鸡冠菜主花序和一次分枝花序上摘取0.3～0.5cm的花蕾(处于单核中晚期)，将花蕾放入纱布袋中用自来水流水冲洗半小时。

相对于实施例1采用4℃低温预处理72小时，实施例2采用现摘现用，不经低温处理，胚状体的诱导效果远低于实施例1，这是因为低温预处理能改善花粉的生理状态，延缓花粉退化，提高内源激素的水平，启动雄核发育，适宜的温度和时间处理可改善小孢子代谢活动，利于小孢子适应离体后的培养环境，促使大部分的小孢子得以正常生长。

不同低温预处理时间对胚状体诱导率的影响如下表2所述。

表2

注：表中的接种花蕾数-步骤1、小孢子悬浮液培养皿数(个)-步骤3、诱导胚状体数-步骤3。

对比实验2-1：相对于实施例1，更改了诱导胚状体培养基的配方，具体如下：

将诱导胚状体培养基改为：改良NLN基础培养基+蔗糖130g/L，pH为6.0，即，取消了诱导胚状体培养基中的2,4-D的使用。其余等同于实施例1。

在步骤1的“接种花蕾数”均为20、步骤3所设置的“小孢子悬浮液培养皿数”均为16个的前提下；实施例1步骤3所得的诱导胚状体数为83个，而对比实验2-1仅为61个。

对比实验2-2：相对于实施例1，增加了诱导胚状体培养基中2,4-D的浓度，具体如下：

即，将“2,4-D”的浓度改成0.1mg/L；其余等同于实施例1。

在步骤1的“接种花蕾数”均为20、步骤3所设置的“小孢子悬浮液培养皿数”均为16个的前提下；实施例1步骤3所得的诱导胚状体数为83个，而对比实验2-2仅为37个。

对比实验3：相对于实施例1，更改了植株再生培养基的配方，具体如下：

将植株再生培养基改为：1/2MS基础培养基+蔗糖20g/L+琼脂粉8g/L，pH为5.8。其余等同于实施例1。

在步骤3所得的诱导胚状体数均为83个的前提下，实施例1步骤4所得再生植株(试管苗)为81株，胚状体分化成苗比例为97.6％，而对比实验3胚状体分化成苗比例为72.3％。

因此，本发明采用“1/4MS基本培养基”作为诱导试管苗培养基，因为1/4MS大量元素中无机盐浓度相对较低，植株长的较快，有利于胚状体分化成苗。

不同MS基础培养基比例对诱导胚状体再生植株的影响如下表3所述。

表3

上述MS基础培养基均添加蔗糖20g/L+琼脂粉8g/L，pH为5.8

对比实验4-1：相对于实施例1，更改了增殖培养基的配方，具体如下：

将增殖培养基改为：MS基础培养基+蔗糖20g/L+琼脂粉8g/L，pH为5.8。即，取消了增殖培养基中的6-BA的使用。其余等同于实施例1。

在步骤4所得再生植株(试管苗)均为81株，胚状体分化成苗比例均为97.6％的条件下，实施例1步骤5所得试管苗增殖倍数在2～3(每株试管苗可增殖2～3个簇生小苗)，且生长健壮，而对比实验4-1试管苗无增殖，且生长细弱。

对比实验4-2：相对于实施例1，增加了增殖培养基中6-BA的浓度，具体如下：

即，将6-BA的浓度改成0.8mg/L，其余等同于实施例1。

在步骤4所得再生植株(试管苗)均为81株，胚状体分化成苗比例均为97.6％的条件下，实施例1步骤5所得试管苗增殖倍数在2～3(每株小苗可增殖为2～3个簇生小苗)，而对比实验4-2不定芽呈丛生团状，且出现了“试管苗玻璃化”现象，试管苗呈半透明水浸状，叶片脆弱易碎，试管苗的玻璃化会导致组织器官畸形、分化能力低，很难继续作为继代培养扩大繁殖的材料。

因此，本发明在增殖培养基中添加了0.2～0.5mg/L 6-BA，试管苗增殖倍数在2～3，并且试管苗比不添加6-BA的健壮，而6-BA浓度过高会引进试管苗玻璃化。

不同6-BA浓度对试管苗增殖效果的影响如下表4所述。

表4

培养基为：MS基础培养基+蔗糖20g/L+琼脂粉8g/L+不同浓度6-BA，pH为5.8。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。