本发明涉及农业生物技术中植物组织培养的方法，具体地说，涉及苗药黑骨藤的组培快繁方法。
背景技术：
苗药黑骨藤(Periploca forrestil Schltr)，又名黑龙骨、滇杠柳等，为萝藦科杠柳属藤状灌木，为苗族民间广泛应用于治疗闭合性软组织损伤、风湿与类风湿等疾病的民族药，其富含C21甾类、强心苷类、萜类等物质。黑骨藤作为一种苗药，其历史悠久，早在西汉刘向的《世说新语说苑辨物》中便有：“吾闻古之为医者，曰苗父，医道精纯，方剂独特，为世人称道”的记载，清代《马关县志风俗篇》中就有“苗人良药接骨祛风，其效如神”的描述。由于苗族人经常性含服黑骨藤，因此苗族人不易患风湿类疾病。目前已开发出黑骨藤追风活络胶囊、黑骨藤伸筋透骨液等治疗风湿类疾病中成药。
鉴于目前国内对黑骨藤的组织培养相关研究未见有报道，本发明选择黑骨藤带节茎段为外植体，经诱导、增殖、生根、炼苗以及移栽等步骤，建立了苗药黑骨藤的组织培养技术体系。本发明具有技术性强、成本低廉、成苗快等特点，可直接用于黑骨藤种苗的工厂化生产，对于促进苗药黑骨藤的资源开发利用具有重要的现实意义。
目前，国内外尚未有黑骨藤组织培养技术的报道，也未有黑骨藤组培快繁专利的申请。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种苗药黑骨藤的组培快繁方法，本发明选择黑骨藤带节茎段为外植体，经诱导、增殖、生根、炼苗以及移栽等步骤，建立了苗药黑骨藤的组织培养技术体系，从而实现了本发明的目的。
本发明提供的技术方案为：一种苗药黑骨藤的组培快繁方法，包括依次进行的如下步骤：获取黑骨藤的外植体、外植体诱导、不定芽的增殖培养、不定芽的生根培养、试管苗移栽；
所述的外植体诱导的诱导培养基包括：MS培养基、3.0～5.0mg/L KT、1.5～2.0mg/L6-BA、20～30g/L蔗糖、3.5～4.0g/L琼脂、0.5～1.0g/L活性炭，pH为5.4～5.8。
在上述的苗药黑骨藤的组培快繁方法中，所述的外植体诱导的方法为：将黑骨藤外植体经清洗消毒处理后切成1.5～2.5cm左右的带节藤茎并接种到诱导培养基中，置于25～28℃进行全暗培养30～35天即可诱导形成不定芽。
在上述的苗药黑骨藤的组培快繁方法中，不定芽的增殖培养所用的增殖培养基包括：MS培养基、2.0～3.0mg/L KT、0.5～1.0mg/L NAA、20～30g/L蔗糖、3.5～4.0g/L琼脂、0.1～0.5g/L活性炭，pH为5.4～5.8。
在上述的苗药黑骨藤的组培快繁方法中，所述的不定芽的增殖培养的方法具体为：将经过外植体诱导得到的不定芽切成长约1～1.5cm的茎段并接种到增殖培养基中培养25～30天即可实现不定芽的增殖。
在上述的苗药黑骨藤的组培快繁方法中，不定芽的生根培养所用的生根培养基包括：1/2MS培养基、1.0～2.0mg/L GGR、0.5～1.0mg/L NAA、15～20g/L蔗糖、3.0～4.0g/L琼脂、0.1～0.3g/L活性炭，pH为5.4～5.8。
在上述的苗药黑骨藤的组培快繁方法中，所述的不定芽的生根培养的方法为：从经过增殖培养得到的不定芽的基部切取长约1.5～2.0cm的不定芽并接种到生根培养基中培养25～30天即能实现试管苗的生根。
在上述的苗药黑骨藤的组培快繁方法中，所述的试管苗移栽的方法具体为：将经过生根培养得到的生长良好的试管苗在温室的自然光下炼苗1～3天，洗净根部的培养基移栽于体积比为1:1的腐殖土、椰子糠混合基质中栽培成苗即得种苗。
在上述的苗药黑骨藤的组培快繁方法中，所述的外植体诱导、不定芽的增殖培养的培养条件均为：培养温度为25～28℃，光照强度为2000～3000lx，光照时间为10～12小时/天。
在上述的苗药黑骨藤的组培快繁方法中，获取获取黑骨藤的外植体的具体方法为：在野外选取生长健壮、无明显病害的黑骨藤植株中上部、向阳充实的带节藤茎为外植体，采集后立即进行保水保湿处理。
有益效果：
本发明利用植物组织培养技术建立了苗药黑骨藤的组织培养技术体系，本发明具有技术性强、成本低廉、成苗快等特点，其成活率达到95％以上，可直接用于黑骨藤种苗的工厂化生产，对于促进苗药黑骨藤的资源开发利用具有重要的现实意义。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，对本发明的技术方案作进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
实施例一
(1)外植体采集：在野外选取生长健壮、无明显病害的黑骨藤植株中上部、向阳充实的带节藤茎为外植体，采集后立即进行保水保湿处理并及时带回实验室。
(2)外植体诱导：当步骤(1)采集回实验室外植体先在自来水下冲洗过夜，置于超净工作台中于75％的乙醇溶液中消毒15秒钟，无菌水冲洗5次后用无菌滤纸吸干水分后，置于0.1％的升汞溶液中消毒15分钟，无菌水冲洗5次后用无菌滤纸吸干水分后切成1.5～2.5cm左右的带节藤茎并接种到诱导培养基中，置于25℃进行全暗培养30天即可诱导形成不定芽，诱导率为93.1％，污染率低于10％。所述的诱导培养基为：MS培养基+5.0mg/L KT+2.0mg/L 6-BA+20g/L蔗糖+3.5g/L琼脂+0.5g/L活性炭，pH为5.4。
(3)不定芽增殖：将步骤(2)诱导得到的不定芽切成长约1～1.5cm的茎段并接种到增殖培养基中培养25天即可实现不定芽的增殖，增殖系数达到6倍。所述的增殖培养基为：MS培养基+3.0mg/L KT+1.0mg/L NAA+20g/L蔗糖+3.5g/L琼脂+0.1g/L活性炭，pH为5.4。
(4)生根培养：从基部切取步骤(3)增殖得到的长约1.5～2.0cm的不定芽并接种到生根培养基中培养25天即能实现试管苗的生根，生根率达到93％以上。所述的生根培养基为：1/2MS培养基+2.0mg/L GGR(生根粉)+1.0mg/L NAA+15g/L蔗糖+3.0g/L琼脂+0.1g/L活性炭，pH为5.4。
(5)移栽：将步骤(4)根系生长良好的试管苗在温室的自然光下炼苗1天，洗净根部的培养基移栽于体积比为1:1的腐殖土、椰子糠混合基质中栽培成苗即得种苗，移栽30天后成活率达到95％以上。
上述步骤(3)～(4)的培养条件为：培养温度为25℃，光照强度为2000lx，光照时间为10小时/天。
实施例二
(1)外植体采集：在野外选取生长健壮、无明显病害的黑骨藤植株中上部、向阳充实的带节藤茎为外植体，采集后立即进行保水保湿处理并及时带回实验室。
(2)外植体诱导：当步骤(1)采集回实验室外植体先在自来水下冲洗过夜，置于超净工作台中于75％的乙醇溶液中消毒17秒钟，无菌水冲洗6次后用无菌滤纸吸干水分后，置于0.1％的升汞溶液中消毒18分钟，无菌水冲洗6次后用无菌滤纸吸干水分后切成1.5～2.5cm左右的带节藤茎并接种到诱导培养基中，置于27℃进行全暗培养33天即可诱导形成不定芽，诱导率为90％，污染率低于8％。所述的诱导培养基为：MS培养基+4.0mg/L KT+1.7mg/L 6-BA+25g/L蔗糖+3.7g/L琼脂+0.8g/L活性炭，pH为5.6。
(3)不定芽增殖：将步骤(2)诱导得到的不定芽切成长约1～1.5cm的茎段并接种到增殖培养基中培养28天即可实现不定芽的增殖，增殖系数达到5.3倍。所述的增殖培养基为：MS培养基+2.5mg/L KT+0.8mg/L NAA+25g/L蔗糖+3.7g/L琼脂+0.3g/L活性炭，pH为5.6。
(4)生根培养：从基部切取步骤(3)增殖得到的长约1.5～2.0cm的不定芽并接种到生根培养基中培养27天即能实现试管苗的生根，生根率为91.5％。所述的生根培养基为：1/2MS培养基+1.5mg/L GGR(生根粉)+0.7mg/L NAA+18g/L蔗糖+3.5g/L琼脂+0.2g/L活性炭，pH为5.6。
(5)移栽：将步骤(4)根系生长良好的试管苗在温室的自然光下炼苗2天，洗净根部的培养基移栽于体积比为1:1的腐殖土、椰子糠混合基质中栽培成苗即得种苗，移栽30天后成活率为96.7％。
上述步骤(3)～(4)的培养条件为：培养温度为26℃，光照强度为2300lx，光照时间为11小时/天。
实施例三
(1)外植体采集：在野外选取生长健壮、无明显病害的黑骨藤植株中上部、向阳充实的带节藤茎为外植体，采集后立即进行保水保湿处理并及时带回实验室。
(2)外植体诱导：当步骤(1)采集回实验室外植体先在自来水下冲洗过夜，置于超净工作台中于75％的乙醇溶液中消毒20秒钟，无菌水冲洗7次后用无菌滤纸吸干水分后，置于0.1％的升汞溶液中消毒20分钟，无菌水冲洗7次后用无菌滤纸吸干水分后切成1.5～2.5cm左右的带节藤茎并接种到诱导培养基中，置于28℃进行全暗培养35天即可诱导形成不定芽，诱导率87.3％，污染率低于3％。所述的诱导培养基为：MS培养基+3.0mg/L KT+1.5mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+4.0g/L琼脂+0.5～1.0g/L活性炭，pH为5.8。
(3)不定芽增殖：将步骤(2)诱导得到的不定芽切成长约1～1.5cm的茎段并接种到增殖培养基中培养30天即可实现不定芽的增殖，增殖系数达到4倍。所述的增殖培养基为：MS培养基+2.0mg/L KT+0.5mg/L NAA+30g/L蔗糖+4.0g/L琼脂+0.5g/L活性炭，pH为5.8。
(4)生根培养：从基部切取步骤(3)增殖得到的长约1.5～2.0cm的不定芽并接种到生根培养基中培养30天即能实现试管苗的生根，生根率达到90％以上。所述的生根培养基为：1/2MS培养基+1.5mg/L GGR(生根粉)+0.5mg/L NAA+20g/L蔗糖+4.0g/L琼脂+0.3g/L活性炭，pH为5.8。
(5)移栽：将步骤(4)根系生长良好的试管苗在温室的自然光下炼苗3天，洗净根部的培养基移栽于体积比为1:1的腐殖土、椰子糠混合基质中栽培成苗即得种苗，移栽30天后成活率达到95％以上。
上述步骤(3)～(4)的培养条件为：培养温度为28℃，光照强度为2500lx，光照时间为12小时/天。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。