球孢白僵菌脱乙酰几丁质酶BbCSN在防治植物病原真菌中的用途的制作方法

本发明属于微生物技术领域，尤其是涉及球孢白僵菌脱乙酰几丁质酶bbcsn在防治植物病原真菌中的用途。

背景技术：

植物病害是严重危害农业生产的自然灾害之一，发生于植物生长的各个时期，各个生长部位，种类繁多，形成危害的因素复杂(张越等,2015)。化学防治是目前农业生产上解决植物病害所采取的主要措施，具有见效快、杀菌谱广、成本低、使用简便等优点(吴金平等,2009)。但是随着时间的推移，化学防治也逐渐的暴露出很多弊端，如长期使用同一类农药造成的定向选择，使防治对象产生抗药性，从而降低或失去防治效果；而且使用不易降解的农药造成粮食、果品、土壤、水域残留量超标，严重污染环境，威胁人类健康；除少数几种农药有选择性外，多数化学农药对害虫及其天敌都有较大的杀伤作用，长期使用此类农药会削弱天敌环。

针对农业方面的这种现状，人们迫切需要寻找一种对人类和环境无害并具有良好防治效果的植物病害防治方法。选育抗病品种是防治植物病害最经济、最有效的途径，人类己利用植物抗病品种控制了多种大范围流行的毁灭性病害。利用抗病品种还可以避免或减轻因过分倚重农药而出现的耐药和环境污染问题，但是这种方法育种年限长。而转基因育种则能够对具体基因进行操作和选择，不受物种的限制，扩大可利用的基因范围，大大地提高植物品种改良的效率(刘珊,2012)。随着生物技术的迅猛发展，转基因技术得到广泛应用，为农作物病害的防治开辟了新的道路。而转基因技术的关键是表达什么基因能够提高植物的抗病能力。

植物病原真菌的细胞壁主要由几丁质、甘露聚糖、葡聚糖等组成。有研究指出，植物病原真菌在侵入植物的过程中，为了躲避植物几丁质酶对胞壁几丁质的降解，会将几丁质转化为脱乙酰几丁质(kouzaytaiyetal.,2012)。因此，在植物中导入脱乙酰几丁质酶基因，利用脱乙酰几丁质酶对入侵真菌胞壁的降解，可提高植物对对真菌病害的抗性。此外，脱乙酰几丁质酶降解脱乙酰几丁质后产生的脱乙酰几丁质寡聚体，可诱导植物自身的防御反应，比如气孔关闭(leesetal.,1999)、木质化作用(vanderpetal.,1998；moerschbacherbmetal.,1988)、病原相关(pr)基因的表达等(jabstetal.,1997)。因此发掘高效降解脱乙酰几丁质的水解酶，利用其提高植物的抗病能力是植物抗病基因工程研究的一个重要领域。球孢白僵菌是一种国内外应用广泛的昆虫病原真菌。除致病昆虫外，球孢白僵菌还是一种重要的植物内生菌，可提高植物的抗病能力。体外实验表明，来自球孢白僵菌的水解酶，如几丁质酶、蛋白酶等被认为与拮抗植物病原真菌的能力相关。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题为防治植物病原真菌提供一种新选择。

本发明提供了球孢白僵菌脱乙酰几丁质酶bbcsn在防治植物病原真菌中的用途。

具体的，所述的球孢白僵菌脱乙酰几丁质酶具有如seqidno.2所示的氨基酸序列。

具体的，所述的球孢白僵菌脱乙酰几丁质酶的编码基因具有如seqidno.1所示的核苷酸序列。

具体的，所述的植物病原真菌为毛霉菌、稻瘟病菌或灰葡萄孢霉。

本发明还提供一种植物病原真菌抑制剂，其主要活性成分为球孢白僵菌脱乙酰几丁质酶bbcsn。

其中，所述的植物病原真菌为毛霉菌、稻瘟病菌或灰葡萄孢霉菌。

本发明还提供了表达球孢白僵菌脱乙酰几丁质酶bbcsn的载体的构建方法，包括如下步骤：

a、设计引物扩增bbcsn，t/a克隆，进行验证；

b、双酶切验证为阳性的转化子和表达载体骨架，然后回收bbcsn片段和载体骨架片段，连接，验证；

c、验证正确的表达载体转入根癌农杆菌。

具体的，步骤a中的引物序列具有如seqidno.3和seqidno.4所示的核苷酸序列。

本发明的有益效果：本发明公开了一种具有抑制植物病原真菌生长的脱乙酰几丁质酶bbcsn基因，来源于昆虫病原真菌球孢白僵菌。将该bbcsn基因转入烟草后，与野生型烟草叶片总蛋白相比，转基因烟草叶片总蛋白对毛霉及灰葡萄孢霉孢子萌发均有抑制作用，对稻瘟病菌及灰葡萄孢霉菌丝的生长抑制作用较野生型强。本发明为植物病害的防治提供了有效的抗性基因，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1plgn-bbcsn农杆菌质粒酶切验证。图中m表示marker2000；泳道1-5表示不同plgn-35s-bbcsn农杆菌转化子经过限制性内切酶ecorⅰ和bamhⅰ酶切的结果。

图2表达载体plgn-35s-bbcsn的载体图。其中grp-gusplus-his6代表gusplus报告基因，该基因在n端融合了grp信号肽，在c端融合了his6序列标签；nptii代表新霉素磷酸转移酶基因，具有卡那霉素抗性；nosterm：nos终止子；camv35s：来源于花椰菜花叶病毒的植物组成性启动子；lb：t-dna左边界；rb：t-dna右边界。

图3转基因烟草叶片pcr验证。m表示marker2000；泳道1以无菌水为模板，泳道2以野生型烟草dna为模板，泳道3以农杆菌plgn-bbcsn质粒为模板，泳道4-22表示gus染色阳性的烟草叶片dna。

图4bbcsn在转基因烟草中表达量分析。横坐标表示转基因烟草植株编号，wt代表野生型烟草植株。

图5转基因烟草叶片总蛋白处理毛霉菌孢子23h。wt为野生型烟草叶片总蛋白提取液；2、12、27分别为bbcsn-2、bbcsn-12、bbcsn-27转基因烟草烟草叶片总蛋白提取液。

图6转基因烟草叶片总蛋白处理灰葡萄孢霉孢子30h。wt为野生型烟草叶片总蛋白；bbcsn为bbcsn-27转基因烟草叶片总蛋白。

图7转基因烟草叶片总蛋白对稻瘟病菌菌丝生长的影响。wt表示野生型烟草叶片总蛋白；csn-2、csn-12、csn-27表示为bbcsn-2、bbcsn-12、bbcsn-27转基因烟草叶片总蛋白。

图8转基因烟草叶片总蛋白对灰葡萄孢霉菌丝生长的影响。control表示0.1mph5.2乙酸钠缓冲液，wt表示野生型烟草叶片总蛋白；csn-2、csn-12、csn-27表示为bbcsn-2、bbcsn-12、bbcsn-27转基因烟草叶片总蛋白。

图9离体转基因烟草叶片抗病实验。图中wt为野生型烟草叶片；csn-2，csn-12，csn-27均为为bbcsn-2、bbcsn-12、bbcsn-27转基因烟草叶片，烟草赤星病菌孢子浓度为10⁷个/ml。

具体实施方式

实验材料：

实验中使用的主要的试剂盒：质粒提取试剂盒为omega公司产品；琼脂糖dna回收试剂盒从bioflux公司购买；easyspin植物rna快速提取试剂盒为aidlab(中国北京)公司产品；rna反转录试剂盒revertaid^tmfirststrandcdnasynthesiskit为takara公司产品，real-timepcr试剂盒为bio-rad公司产品。

实验中使用的主要仪器：s1000^tm型pcr仪、dna电泳系统、凝胶成像系统、离心机为thermo公司产品、电转化仪及cfx96实时定量pcr为bio-rad公司产品、酶标仪为tecan公司产品、可见分光光度计为上海菁华科技仪器有限公司产品、灭菌锅为tomy公司产品、倒置显微镜及光学显微镜为olympus产品。

实验中使用的化学试剂：限制性内切酶购自fermentas公司；dna聚合酶购自takara公司；dna连接酶购自promega公司；x-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d-半乳糖)及iptg(异丙基硫代-β-d-半乳糖)购自gibco公司；pcr引物由上海英骏生物技术公司合成；其他常规试剂均为进口或国产分析纯试剂。

实施例1bbcsn基因的克隆

bbcsn的核苷酸及氨基酸序列分别如seqidno.1和seqidno.2所示。以p1/p2为引物(p1：5’-ggatccatggcttctcttcgctctac-3’；p2:5’-gaattcttaaccacgggcacacttgc-3’，下划线分别为bamhⅰ和ecorⅰ位点)从球孢白僵菌的cdna中扩增得到bbcsn基因。反应体系：5μl10×labuffer，4μldntpmix(2.5mmeach)，2.5μl25mmmgcl2,上下游引物各1μl(10mm)，0.2μllataq聚合酶，1μlcdna模版，加水至25μl。pcr反应参数：95℃(5min)；94℃(30s)，56℃(30sec)，72(1min)，32个循环；72℃(5min)。pcr反应参数：95℃(5min)；94℃(30s)，56℃(30sec)，72(1min)，32个循环；72℃(5min)。回收bbcsn片段(约900bp)，克隆进peasy-blunt载体(全式金公司产品)。测序正确的载体命名为peasy-bbcsn。

所使用的植物表达载体为pcambia载体改造的，该载体的hptii基因用xhoi单酶切后替换为nptii基因(设计引物从pbi121载体中扩增获得，引物设计两端带xhoi位点)，限制性酶切和测序结果验证了nptii基因的方向。在pbi121载体中扩增获得camv35s启动子和nos终止子，同时这两个元件两端也引入了相应的酶切位点，这两个元件最后分别导入pcambia的多克隆位点，形成camv35s：：mcs：：nos单元。该植物表达载体含有1套2×camv35s启动子控制nptii基因的植物表达元件、1套camv35s启动子控制报告基因grp-gusplus-his6的植物表达元件和一套camv35s启动子控制目标基因的植物表达元件，可实现kan和gus活性的双标记筛选。在多克隆位点(multiplecloningsite，mcs)插入外源基因，可以实现外源基因的超量表达。

bamhⅰ和ecorⅰ双酶切peasy-bbcsn，回收bbcsn片段，克隆进植物表达载体，获得正确的plgn-35s-bbcsn转化子(图1)。其中grp-gusplus-his6代表gusplus报告基因，该基因在n端融合了grp信号肽，在c端融合了his6序列标签；nptⅱ代表新霉素磷酸转移酶基因，具有卡那霉素抗性；nosterm：nos终止子；camv35s：来源于花椰菜花叶病毒的植物组成性启动子；lb：t-dna左边界；rb：t-dna右边界。利用电击法将plgn-35s-bbcsn转入根癌农杆菌lba4404感受态，经验证获得正确的农杆菌转化子，并用于下一步的烟草遗传转化。

实施例2烟草遗传转化

烟草遗传转化用培养基

种子萌发培养基：msb+蔗糖30g/l+普通琼脂6g/l，ph＝6.8；上述浓度均为所述物质在配制好的培养基中的质量浓度。

共培养基：msb+蔗糖10g/l+6-ba(6-苄氨基嘌呤)2mg/l+naa(吲哚乙酸)0.1mg/l+普通琼脂6g/l，ph＝5.4；上述浓度均为所述物质在配制好的培养基中的质量浓度。

筛选培养基：msb+蔗糖30g/l+6-ba(6-苄氨基嘌呤)2mg/l+naa(吲哚乙酸)0.1mg/l+km(卡那霉素)1000mg/l+cef(头孢霉素)1000mg/l+普通琼脂6g/l，ph＝5.8；上述浓度均为所述物质在配制好的培养基中的质量浓度。

继代培养基：msb+蔗糖30g/l+km(卡那霉素)75mg/l+cef(头孢霉素)1000mg/l+普通琼脂6g/l，ph＝5.8；上述浓度均为所述物质在配制好的培养基中的质量浓度。

生根培养基：msb+蔗糖30g/l+cef(头孢霉素)1000mg/l+普通琼脂6g/l，ph＝6.8；上述浓度均为所述物质在配制好的培养基中的质量浓度。

(1)转化用农杆菌浸染液的制备

挑取plgn-35s-bbcsn农杆菌单菌落于ysk液体培养基(含125mg/mlsm和50mg/mlkm的yeb液体培养基)中，28℃，200rpm摇床培养过夜，再次吸取少量上述农杆菌菌液于20ml左右ysk液体培养基中，28℃，200rpm培养至od600为0.8-1.2。取10ml农杆菌菌液于1.5ml离心管中(1ml/管)，10000rpm1min收集plgn-35s-bbcsn农杆菌菌体，用10ml液体共培养基重悬菌体，重悬液体即为烟草外植体的浸染液。

(2)转化用烟草材料的准备

先用75％乙醇漂洗大烟草种子1min，弃乙醇；然后在0.1％的升汞中漂洗6-8min，弃升汞溶液；最后用无菌水漂洗6次以上，然后将烟草种子于装有适量无菌水的三角瓶中摇床培养，待烟草种子萌发出小芽后移于萌发培养基上生长，约1个月后得到无菌烟草苗，将烟草幼苗健壮的嫩叶去掉叶脉和叶边缘后将剩余部分在无菌条件下切成0.5cm×0.5cm大小，作为农杆菌介导遗传转化的外植体。

(3)农杆菌侵染转化及转基因烟草植株的获得

用农杆菌浸染液浸染外植体40min后倾去浸染液，无菌吸水纸吸去外植体表面多余菌液，然后将外植体正面朝上平铺到固体共培养基上，暗培养2d。共培养完成后，将外植体转入筛选培养基中进行分化培养十天左右，然后将外植体转入继代培养基诱导愈伤生成，每2周继代一次。产生km抗性幼芽后，将幼芽切下插入生根培养基，获得km抗性再生植株。待其长成根长3-5cm的再生幼苗，移栽入温室生长成苗。

最终，获得50株烟草幼苗。gus染色结果显示，46株为阳性，仅有4株为阴性，进一步利用pcr技术对烟草植株进行验证。引物为p1和p2，采用标准的pcr扩增程序。图3所示为部分转基因植株的扩增结果。结果显示，gus阳性植株均能扩增出预期大小的目标条带，9、15、18、21扩增条带较弱。

实施例3转基因烟草中bbcsn的表达情况

选取相对较嫩的叶片，提取叶片rna，并反转录成cdna(primescriptrtreagentkitwithgdnaeraser，takara)，然后以cdna为模板，用real-timepcr的方式测定各转化子中bbcsn的表达情况，所用引物为(p3：5’-gacctcgatgcctttatcca-3’；p4：5‘-tgccgtaaatcagcttgttg-3’)。rt-pcr反应体系：5.0μluniversalsybrgreensupermix(bio-rad)，4.0μlcdna，0.5μlp3，0.5μlp4，总体积10μl。rt-pcr反应参数：95℃(3min)；36循环:95℃(10sec),56℃(20sec),72℃(30sec)。结果显示，转基因材料为2号，12号，27号烟草植株中bbcsn基因的表达量较高(图4)。

实施例4转基因烟草叶片总蛋白抗菌活性分析

真菌培养：在马铃薯固体培养基(pda)平板接种毛霉菌，在rm平板灰葡萄孢霉，将平板置于28℃培养箱中培养7天左右至产孢。用0.05％的tween-80准备孢悬液，并稀释孢子浓度到10⁷个/ml。

叶片总蛋白提取：称取2.5g烟草幼嫩叶片于10ml离心管中，加入液氮以锥形研磨棒研磨，向研磨后的叶片粉末中加入4ml乙酸钠(0.1mph5.2)溶液，颠倒混合均匀后冰上放置30min。匀浆液于4℃，10000rpm离心20min，将上清液转移到新的离心管中，以bradford法对总蛋白提取液进行定量。

真菌孢子萌发分析：在150mm培养皿底部铺上一层滤纸，加入5ml一级水使整张滤纸保持湿润。然后在滤纸上放上牙签，将干净的载破片置于牙签上，培养皿高温灭菌处理。将3μl真菌孢悬液(10⁷个/ml)、3μl马铃薯液体培养基(pdb)或rm液体培养基和10μl浓度一致的烟草总蛋白提取液(烟草总蛋白浓度约为200ug/ml)，混合均匀后置于培养皿中的载玻片上(灭菌处理)，28℃培养箱中培养。处理23h(毛霉菌)或30h(灰葡萄孢霉菌)后于显微镜下观察拍照。结果如图5(毛霉菌)和图6(灰葡萄孢霉菌)所示，与野生型叶片总蛋白相比，烟草叶片总蛋白对毛霉菌和灰葡萄孢霉菌的孢子萌发均有较强的抑制效果。

平板抑菌分析：在马铃薯固体培养基平板上接种稻瘟病菌，于28℃培养箱中培养1-2天，直到平板上长出直径约3㎝的菌落。在距离菌落边缘约0.5cm的地方放置直径约8mm的无菌滤纸片，每个滤纸片上加入40ul浓度一致的烟草叶片总蛋白提取液(烟草叶片总蛋白浓度分别约为200ug/ml(图7)和600ug/ml(图8))。将平板放于28℃培养箱中培养2-3天后，观察烟草叶片总蛋白对菌落生长的抑制。从图7(稻瘟病菌)和图8(灰葡萄孢霉)中可以看出转基因烟草叶片总蛋白对稻瘟病菌菌丝和灰葡萄孢霉菌丝生长的抑制作用较野生型更强，

实施例5离体转基因烟草叶片抗病分析

真菌培养及孢悬液准备按照前述的方法进行。取新鲜的bbcsn转基因和野生型烟草叶片，包括一个野生型烟草叶片对照组和三个bbcsn转基因烟草叶片实验组(2号、12号、27号)，每组设置三个重复，用湿润的吸水纸包住烟草叶柄部位；将烟草赤星病菌孢悬液(10⁸个/ml)均匀喷洒在叶片上，将处理后的烟草叶片置于敞口的塑料筐中，并在塑料框上覆盖上一层透明薄膜以保持筐中的湿度，使叶片不至于因失水而快速枯萎。26℃放置15天左右观察烟草叶片的发病情况。结果如图9所示，处理15天后，野生型烟草叶片出现变黄、萎焉等症状并且产生病斑；而bbcsn转基因烟草叶片未出现明显的发病现象。表明在烟草中表达bbcsn有效提高了植株的抗病效果。

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

sequencelisting

<110>西南大学

<120>球孢白僵菌脱乙酰几丁质酶bbcsn在防治植物病原真菌中的用途

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