一种韭菜未受精子房离体培养方法与流程

本发明属于单倍体培养技术，具体涉及一种韭菜未受精子房离体培养方法。

背景技术：

韭菜(alliumtuberosumrottl.exspr.)原产于中国，属于百合科葱属多年生宿根植物。我国是韭菜的生产大国，对韭菜的需求量大，因此，需要不断培育新品种以达到市场的需求。目前，韭菜新品种培育多采用有性杂交结合系统选育的方法进行，杂交分离后代自交纯合速度慢，每年只能繁殖一个世代，新品种培育速度缓慢，育成一个品种往往需要7—8年时间，限制了韭菜品种更新换代的速度。

近年来，随着单倍体育种技术的发展，为韭菜快速育种提供了一种新方法。单倍体育种，在较短时间内能选育出整齐一致的纯系，大大缩短育种年限，还能丰富种质资源，对于选育出亲本自交系、加快育种进程、培育优势杂交组合具有重要的意义。但是，由于韭菜常常雄性不育，花药(小孢子)单倍体培养目前还没有获得的成功的例子。自1976年sanneoum首先按从未受精子房或胚珠得来的单倍体植株的离体诱导在大麦中获得成功以来，这种方法已应用于多种作物，并认为在花药培养尚未成功的情况下对花药培养是一种选择。传统韭菜一般为同源四倍体(2n＝4x＝36)，未受精子房中卵细胞、助细胞、反足细胞和珠被细胞均具有胚胎发生功能。田惠桥和杨弘(1989)以加入0.5ppmzt和0.1ppmmcpa的ms培养基诱导韭菜子房胚状体分化，分化率最高为48.7％，从培养到获得再生植株共经历65天，分化率较低，历时较长。因此迫切需要研究一种快速、高效获得韭菜单倍体育种技术，使韭菜杂交分离后代快速纯合，育成新的韭菜品种。

技术实现要素：

本发明目的是提供一种快速、高效通过未受精子房获得韭菜单倍体和纯合体的方法，为韭菜育种提供新的方法。

本发明目的通过以下方案实现

本发明提供一种韭菜未受精子房离体培养方法，该方法以韭菜未受精子房作为对象，经过子房预处理、接种、转接、生根步骤，最终获得韭菜单倍植株，具体步骤如下：

(1)子房预处理：选择韭菜花蕾，进行消毒处理，剥去花萼、花瓣，取出子房；

(2)接种：将子房切片，以切口接触愈伤诱导培养基进行接种，诱导子房形成愈伤组织；其中，愈伤诱导培养基为改良bds培养基：bds+2,4-d1.5mg/l+kt1.5mg/l，蔗糖含量10％，ph5.8-6.0；

(3)转接：将诱导获得愈伤组织的子房转接于分化培养基中，使愈伤组织分化出芽；其中，分化培养基为改良ms培养基1：ms+5％鲜椰汁+6-ba2mg/l+naa0.2mg/l，蔗糖含量3％，ph5.8-6.0；

(4)生根：将分化出芽的植株转接于生根培养基中，获得韭菜单倍体植株。其中，生根培养基为改良ms培养基5：ms+6-ba0.5mg/l+naa0.2mg/l，蔗糖含量3％，ph5.8。

子房切片厚度一般为1-2mm。在转接分化培养基时，应尽可能轻柔而迅速，保证子房受到最小损伤，这对后面的分化效率是很重要的。鲜椰汁为市售任一品种椰子汁，以去离子无菌水进行稀释调配。

2.上述1提供的韭菜未受精子房离体培养方法，其中，步骤(2)进行接种后，进行温度光照诱导处理：4℃预处理24h-48h，然后33℃热激24h，进入25℃暗培养。

3.上述1提供的韭菜未受精子房离体培养方法，其中，步骤(3)转接需要在3-5天内完成；转接后，培养温度为24-26℃，光照2500lux，7h白天/5h黑夜。

4.上述1提供的韭菜未受精子房离体培养方法，其中，步骤(4)进行生根培养前，直接将分化出芽的愈伤组织转接于扩增培养基中，其中，扩增培养基为改良ms培养基2：ms+5％鲜椰汁+6-ba2.5mg/l+naa0.3mg/l，蔗糖含量3％，ph5.8-6.0。

5.上述1提供的韭菜未受精子房离体培养方法，其中，步骤(1)中选择的花蕾为花苞张开前2天的花蕾，对应的是小孢子发育为单核中期。

花苞开前2天的花蕾，表现为花蕾饱满，花苞苞膜完好。

6.上述1提供的韭菜未受精子房离体培养方法，其中，步骤(1)中对子房进行预处理，其方式为：流水冲洗5次以上，然后75％酒精浸泡25s，然后0.2％升汞浸泡8min，最后无菌水冲洗5次以上。

7.上述1提供的韭菜未受精子房离体培养方法，其中，步骤(4)进行生根后，将苗子接种在0.01％秋水仙素的ms培养基上，蔗糖含量3％，ph5.8，处理3天，然后转接在不含秋水仙素的ms培养基上，获得染色体加倍的韭菜，即2n＝32。

8.上述7提供的韭菜未受精子房离体培养方法，其中，加倍后的韭菜幼苗扩大生产进行炼苗，选择幼苗特征为长4—5条根，根长4cm以上；进行炼苗时，设置温室温度24-28℃，湿度75％，光照第1周5000-10000lux，第二周1.5万—2万lux。

有益效果：

1.本发明通过优化愈伤组织诱导培养基和诱导处理方式，大大提高了成胚数和成胚率，经过对比试验，无论是何种品种，成胚数最少为78个·蕾^-1，成胚率至少为83.8％，相对于传统地的方法，均有明显提高。

2.从子房培养到单倍体植株整个获得时间为55-60天左右，相对于传统地65-100天的时间，时间有所缩短，提高了生产效率。

本发明经过一系列优化方法，填补了目前韭菜单倍体植株培养的空白和局限，为更大规模和深入地进行韭菜育种改造提供基础。

附图说明

图1经过诱导培养后分化出芽的愈伤组织

图2愈伤组织转接于生根培养基中进行生根

图3染色体未加倍处理时韭菜单倍体染色体(2n＝16)

图4经过秋水仙素处理后韭菜染色体(2n＝4x＝32)

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段，或按照制造厂商的建议条件。

实施例1

1、培养基配制

愈伤组织诱导培养基(改良bds培养基)：bds+2,4-d1.5mg/l+kt1mg/l，蔗糖含量10％，ph5.8-6.0；

分化培养基(改良ms培养基1)：ms+5％鲜椰汁+6-ba2mg/l+naa0.2mg/l，蔗糖含量3％，ph5.8-6.0；

扩大培养基(改良ms培养基2)：ms+5％鲜椰汁+6-ba2.5mg/l+naa0.3mg/l，蔗糖含量3％，ph5.8-6.0；

改良ms培养基3：ms+0.5ppmzt+0.1ppmmcpa，蔗糖含量10％，ph5.8-6.0；

改良ms培养基4：ms+2,4-d1.5mg/l+kt1mg/l，蔗糖含量10％，ph5.8-6.0；

生根培养基(改良ms培养基5)：ms+6-ba0.5mg/l+naa0.2mg/l，蔗糖含量3％，ph5.8。

鲜椰汁过除菌过滤器。培养基装在三角瓶内灭菌，灭菌(121℃,20min)后倒入预先灭菌(121℃,20min)的培养皿中，待培养基冷凉，备用。

2、材料选择

2.1品种选择：市售品种，791宽叶雪韭、紫根韭菜、多抗富韭6号。

2.2材料获得：花苞开花前2天，花蕾表现为饱满、圆润，花苞苞膜完好，花蕾长度1-2cm。

2.3材料处理：1)花蕾取下，进行消毒，流水冲洗5次以上，然后75％酒精浸泡25s，然后0.2％升汞浸泡8min，最后无菌水冲洗5次以上；2)在无菌操作台中，剥去花萼、花瓣，取出子房。

3.接种

在无菌操作台中，将取出的子房立即进行切片，切片厚度1-2mm。将切口接触改良bds培养基，接入三角瓶中，每瓶接种9-10个子房，共60个。同时，以改良ms培养基3、4作为对照组，每组30个，处理方式为温度光照诱导处理。

同时，在以改良bds培养基作为愈伤诱导培养基时，分2组，每组30个，一组进行温度光照诱导处理：4℃预处理24h-48h，然后33℃热激24h，进入25℃暗培养，36-60h。一组不做处理。培养35天后，观察胚胎膨大数、胚胎诱导率、出芽率。不同培养基条件对胚胎发生影响如表1所示，从图中看出，ms培养机组，子房几乎全部褐化死亡，说明激素在愈伤组织形成过程中是重要的；不同品种成胚率不完全相同，均表现出改良ms培养基3、4组比改良bds培养基组数量少，说明改良bds培养基对子房的诱导效果明显高于改良ms培养基3、4。同时，经过温度光照诱导处理和未经温度光照诱导处理的结果，从表中可以看出，经过诱导处理后，膨大胚珠数和成胚数均有明显增加，说明温度光照诱导处理是有益成胚的。

表1不同培养基对成胚的影响

同一列数据后不同小写字母表示差异达到显著水平(p<0.05),a:温度光照诱导处理，b：未进行温度光照诱导处理

4.转接

待获得愈伤组织产生后，取出，切除已经褐化或坏死的组织，小心地转接于分化培养基中，要求在3-5天内完成，尽量减少对组织的损伤；转接后，培养温度为培养温度为24-26℃，光照2500lux，7h白天/5h黑夜，经过10天左右，愈伤组织分化出芽，如图1所示。

5.生根

将分化出芽的植株转接于生根培养基中，10天左右，根迅速生长，获得韭菜单倍体植株，如图2所示。取再生植株幼嫩叶片为检测对象，将0.2g待检测叶片置于培养皿中，加入2ml细胞裂解液，用单片迅速将其切片，400目尼龙网过滤，2000r/m离心3min。采用nikon55i1000倍观测，结果如图3所示，从图中可以清楚得看到单倍体植株染色体倍数，2n＝16。

实施例2

生根之前步骤如实施例1所示。

在愈伤组织分化出芽后，将获得芽的愈伤组织转接于扩增培养基中，扩增培养的条件为培养温度为24-26℃，光照2500lux，7h白天/5h黑夜，扩增培养10天左右。

将扩增培养的植株转接于生根培养基中，培养条件如实施例1。

实施例3

单倍体植株获得步骤如实施例2所示。

将单倍体植株接种在0.01％秋水仙素的ms培养基上，蔗糖含量3％，ph5.8，处理3天，然后转接在不含秋水仙素的ms培养基上，获得染色体加倍的韭菜，即2n＝4x＝32。以实施例1中所示观测方法，观察植株的染色体，如图4所示。

加倍后的韭菜幼苗扩大生产进行炼苗，选择幼苗特征为长4—5条根，根长4cm以上；进行炼苗时，设置温室温度24-28℃，湿度75％，光照第1周5000-10000lux，第二周1.5万—2万lux。获得可以直接栽种于大棚中的幼苗。

可以知道，上述实施例仅为了说明发明原理而采用的示例性实施方式，然而本发明不仅限于此，本领域技术人员在不脱离本发明实质情况下，可以做出各种改进和变更，这些改进和变更也属于本发明的保护范围。