本发明涉及一种水稻悬浮细胞系快速培养的方法，属生物技术领域。
背景技术：
水稻是世界上重要的粮食作物之一，是世界上50％以上人口的主食同时也是遗传学和基因组研究的模式植物之一。疣粒野生稻主要分布于在我国的云南省及海南省。野生稻由于长期处于野生状态，经受了各种灾害和不良环境的自然选择，抗逆性较强，是天然的基因库，保持有栽培稻不具有或已经消失了的有利基因。
悬浮细胞系具有来源统一，遗传背景一致，不存在植株研究中个体差异的影响；生长条件容易控制，生理状态基本相同，避免了环境的干扰；发生各种反应更为迅速一致；具有较好的细胞全能性。水稻细胞悬浮系不仅可以直接应用于原生质体分离、培养与杂交、基因转移和生产次生代谢物等，还可以在细胞水平上短期内筛选出预期突变体，培育水稻新品种等，利用悬浮细胞也可以保护和繁育濒危野生稻品种。因此，悬浮细胞培养已成为植物生物技术中最有效的手段之一。
水稻的幼胚和成熟胚诱导出胚性愈伤组织可以保持胚性，能够分化出完整的再生植株，但是其颗粒坚硬，分散困难，需要长时间的生长过程，才能培养出繁殖较快的细胞系，目前文献报道的建立水稻悬浮系的时间多为3-4个月，因水稻悬浮细胞的培养操作是在超净台的无菌操作，且每5-7天需要补充新鲜液体培养基进行继代，繁琐的实验环节、过长的实验周期不仅增加了材料污染的风险而且也严重阻碍着水稻悬浮培养在实践中的应用。因此，寻找一种既能缩短水稻悬浮细胞系建立的周期，又易于操作的方法是本领域科技人员长期想探索的技术问题。
迄今为止，未见在较短的时间(1.5-2个月)内建立起水稻悬浮细胞系的公开报道。
技术实现要素：
本发明目的在于解决现有技术中获得水稻悬浮细胞系周期过长的问题，提供一种快速建立水稻悬浮细胞系的方法。
本发明的快速建立水稻悬浮细胞系的方法，其具体步骤如下：
a.外植体的选择：选择成熟胚或幼胚，装于透气网袋中，置于4℃冰箱中保存备用；
b.外植体灭菌：取出保存于4℃冰箱中的成熟胚或幼胚，剥去其颖壳，放入已灭菌的100ml三角瓶中用体积百分比为75％的酒精浸泡1分钟进行表面消毒，摇动三角瓶，无菌蒸馏水冲洗5-6次，再用体积百分比为15％的次氯酸钠溶液消毒，每50ml次氯酸钠溶液加1滴tween20，在摇床中室温110r/min黑暗下振荡15分钟或18分钟消毒，无菌蒸馏水冲洗10次或12次，最后用不添加tween20的体积百分比为15％的次氯酸钠溶液在摇床中室温110r/min黑暗下振荡15分钟消毒，消毒后用无菌蒸馏水冲洗10次或12次，直到清洗后的水中没有次氯酸钠溶液残留；
c.愈伤组织的诱导：消毒后将胚放在无菌滤纸上于超净台上风干表面多余的水分，用灭菌的镊子将胚接种于n6诱导培养基中，每皿8颗或12颗种子，置于培养箱中28℃、2000lux光照培养，光照时间为每天6:00-22:00时，经10天或25天长出愈伤组织，n6诱导培养基配方为：n6+2.8mg/l2,4-d+300mg/l水解络蛋白+1.0g/ll-脯氨酸+30g/l蔗糖+0.5g/lmes+3.0g/l植物凝胶，ph5.6-5.8；
d.愈伤组织继代：将诱导出的愈伤组织用灭菌的手术刀切割成3mm或4mm后接种于n6继代培养基，每皿12枚愈伤块；将接种愈伤的培养皿放到培养箱中在28℃、空气相对湿度60％、以2000lux光照培养，光照时间为每天6:00-22:00时，每12天继代一次，n6继代培养基配方为：n6+2.5mg/l2,4-d+300mg/l水解络蛋白+1.0g/ll-脯氨酸+30g/l蔗糖+0.5g/lmes+3.0g/l植物凝胶，ph5.6-5.8；
e.悬浮细胞的培养：选取组培常规方法继代2次以上的0.48g或0.52g质地坚硬、结构致密、颗粒松散、颜色鲜黄的愈伤加入到含有30mln6液体培养基的100ml三角瓶中，置于往复式摇床上28℃、110r/min黑暗条件培养，每5天继代1次，每次继续代时倾去占总体积2/3的上清液，补充新鲜的n6液体培养基至30ml继续培养，上述条件继代2次，从继代第3次开始，每次继代倾去占总体积2/3的上清液并补充新鲜的n6液体培养基至30ml后用10目已灭菌的筛网过滤悬浮细胞，只保留能通过10目筛网的悬浮细胞继续培养；从继代第6次或第7次开始，每次继代倾去占总体积2/3的上清液并补充新鲜的n6液体培养基至30ml后用已灭菌的20目不锈钢筛网过滤悬浮细胞，只保留能通过20目筛网的悬浮细胞继续培养；从继代第8次或第9次开始，每次继代时倾去占总体积2/3的上清液并补充新鲜的n6液体培养基至30ml后用40目已灭菌的筛网过滤悬浮细胞，只保留能通过40目筛网的悬浮细胞继续培养；到继代第10次或第11次即第50天或55天时，倾去占总体积2/3的上清液并补充新鲜的n6液体培养基至30ml后用40目已灭菌的筛网过滤悬浮细胞，只保留能通过40目筛网的悬浮细胞即获得生长状态均一，分散性好，如沙尘状的细胞团即悬浮细胞系。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明在继代时处理悬浮细胞的方法上进行了改进，即在继代第3次液体培养基后用孔径大小依次约为10目，20目，40目已灭菌的筛网对悬浮培养的细胞进行筛选，滤去大颗粒细胞团，只留下大小均一的细胞团，用此法只需1.5-2个月就能够建立起良好的胚性悬浮细胞系，比文献报道的建立水稻悬浮细胞系所需的3-4个月提高缩短1-2个月，大大缩短了试验周期，降低了悬浮细胞系污染的风险。同时，本发明方法还对培养悬浮细胞培养基进行了改进，所使用的n6培养基，克服了文献中培养悬浮细胞多用的aa液体培养基容易导致悬浮细胞褐化的问题，且提高了悬浮细胞的增殖速度，并且在培养的不同阶段保持培养基的一致性，减少了由固体培养到液体培养更换培养基水稻愈伤的适应过程，更有利于水稻悬浮细胞的生长。
本方法简单易行，为快速获得水稻悬浮细胞系提供了一种高效、快速的新方法，也为利用水稻悬浮细胞系作为实验材料的相关研究提供了一个平台。
具体实施方式：
实施例一：栽培稻02428悬浮细胞系的建立
本实施例以栽培稻品种“02428”的幼胚或成熟胚作为试验材料，采用本发明方法快速获得了悬浮细胞系。实施过程如下：
1)外植体的选择：外植体选取本实验室自主培育于温室的02428材料的幼胚或成熟胚，将选取的02428的胚装于透气网袋中，置于4℃冰箱中保存备用；
2)外植体灭菌：取出保存于4℃冰箱中的02428幼胚或成熟胚，剥去其颖壳，放入已灭菌的100ml三角瓶中用体积百分比为75％的酒精浸泡1分钟进行表面消毒，摇动三角瓶，无菌蒸馏水冲洗5次，再用添加tween20的体积百分比为15％的次氯酸钠溶液，在摇床中室温110r/min黑暗下振荡15分钟消毒，添加tween20的量为每50ml加1滴tween20，消毒后无菌蒸馏水冲洗10次，最后用不添加tween20的体积百分比为15％的次氯酸钠溶液在摇床中室温110r/min黑暗下振荡15分钟消毒，消毒后用无菌蒸馏水冲洗10次直到清洗后的水中没有次氯酸钠溶液残留；
3)02428种胚愈伤组织的诱导：将已灭菌的02428幼胚或成熟胚放在无菌滤纸上于超净台上风干表面多余的水分，用灭菌的镊子将胚接种于n6诱导培养基中，每皿12颗种子。将接种胚的培养皿放到培养箱中在28℃，空气相对湿度60％，以2000lux光照培养，光照时间为每天6:00-22:00时，02428幼胚和成熟胚一般10天长出愈伤组织，n6培养基配方为：n6成分+2.8mg/l2,4-d+300mg/l水解络蛋白+1.0g/ll-脯氨酸+30g/l蔗糖+0.5g/lmes+3.0g/l植物凝胶，ph5.6-5.8；
4)02428愈伤组织的继代增殖培养：将诱导出的愈伤组织用灭菌了的手术刀切割成3mm或4mm大小后接种于n6继代培养基，每皿12枚小愈伤块。将接种愈伤的培养皿放到培养箱中在28℃，空气相对湿度60％，以2000lux光照培养，光照时间为每天6:00-22:00时，根据愈伤组织的生长情况每12天继代一次，n6继代培养基配方为：n6培养基基本成分+2.5mg/l2,4-d+300mg/l水解络蛋白+1.0g/ll-脯氨酸+30g/l蔗糖+0.5g/lmes+3.0g/l植物凝胶，ph5.6-5.8；
5)02428悬浮细胞的培养：选取组培常规方法继代2次以上0.52g质地坚硬，结构致密，颜色鲜黄的02428愈伤组织加入到含有30mln6液体培养基已灭菌的100ml三角瓶中，将悬浮培养物置于往复式摇床上，28℃，110r/min，黑暗条件下每5天换液1次，每次继代时倾去占总体积2/3的上清液，补充新鲜的n6液体培养基至30ml进行培养，上述条件继代2次。在继代第3次、第4次、第5次、第6次时，每次继代倾去占总体积2/3的上清液并补充新鲜的n6液体培养基至30ml后用10目已灭菌的筛网过滤悬浮细胞，只保留能通过10目筛网的悬浮细胞继续培养；在继代第7次和第8次时，每次继代倾去占总体积2/3的上清液并补充新鲜的n6液体培养基至30ml后用已灭菌的20目不锈钢筛网过滤悬浮细胞，只保留能通过20目筛网的悬浮细胞继续培养；在继代第9次和第10次时，每次继代倾去占总体积2/3的上清液并补充新鲜的n6液体培养基至30ml后用已灭菌的40目筛网过滤悬浮细胞，只保留能通过40目筛网的悬浮细胞继续培养；在继代第11次即第55天时倾去占总体积2/3的上清液并补充新鲜的n6液体培养基至30ml，后用已灭菌的40目筛网过滤悬浮细胞，只保留能通过40目筛网的悬浮细胞即获得生长状态均一，分散性好，如沙尘状的细胞团即悬浮细胞系。
实施例二：疣粒野生稻悬浮细胞系的建立
本实施例以在云南省玉溪市元江县野外采集的疣粒野生稻种胚作为试验材料，采用本发明方法快速获得了疣粒野生稻悬浮细胞系。实施过程同实施例一，仅以下几点不同：
1)外植体的选择：外植体选取本课题组于云南省玉溪市元江县采集的疣粒野生稻成熟胚，将选取的成熟胚装于牛皮纸信封中，带回实验室置于4℃冰箱中保存备用；
2)外植体灭菌：取出保存于4℃冰箱中保存的疣粒野生稻成熟胚，剥去其颖壳，放入已灭菌的100ml三角瓶中用体积百分比为75％的酒精浸泡1分钟进行表面消毒，摇动三角瓶，无菌蒸馏水冲洗5次，再用添加tween20的体积百分比为15％的次氯酸钠溶液，在摇床中室温110r/min黑暗下振荡18分钟消毒，添加tween20的量为每50ml加1滴tween20，消毒后无菌蒸馏水冲洗12次，直到清洗后的水中没有次氯酸钠溶液残留，最后用不添加tween20的体积百分比15％的次氯酸钠溶液摇床中室温110r/min黑暗下振荡18分钟消毒，消毒后用无菌蒸馏水冲洗12次，直到清洗后的水中没有次氯酸钠溶液残留；
3)疣粒野生稻种子愈伤组织的诱导：灭菌后将胚放在无菌滤纸上于超净台上风干表面多余的水分，用灭菌的镊子将胚接种于n6诱导培养基中，每皿8颗种子。将接种胚的培养皿放到培养箱中培养，培养条件与02428愈伤诱导培养的条件相同，疣粒野生稻成熟胚一般25天长出愈伤组织。n6培养基配方为：n6培养基基本成分+2.8mg/l2,4-d+300mg/l水解络蛋白+1.0g/ll-脯氨酸+30g/l蔗糖+0.5g/lmes+3.0g/l植物凝胶，ph5.6-5.8；
4)疣粒野生稻悬浮细胞的培养：选取组培常规方法继代2次以上0.48g质地坚硬，结构致密，颜色鲜黄的云南疣粒野生稻愈伤组织加入到含有30mln6液体培养基已灭菌的100ml三角瓶中，将悬浮培养物置于往复式摇床上，28℃，110r/min，黑暗条件下每5天换液1次，每次继代时倾去占总体积2/3的上清液，补充新鲜的n6液体培养基至30ml进行培养，上述条件继代2次。在继代第3次、第4次、第5次时，每次继代倾去占总体积2/3的上清液并补充新鲜的n6液体培养基至30ml后用10目已灭菌的筛网过滤悬浮细胞，只保留能通过10目筛网的悬浮细胞继续培养；在继代第6次和第7次时，每次继代倾去占总体积2/3的上清液并补充新鲜的n6液体培养基至30ml后用已灭菌的20目不锈钢筛网过滤悬浮细胞，只保留能通过20目筛网的悬浮细胞继续培养；在继代第8次和第9次时，每次继代时倾去占总体积2/3的上清液并补充新鲜的n6液体培养基至30ml后用已灭菌的40目筛网过滤悬浮细胞，只保留能通过40目筛网的悬浮细胞继续培养；在继代第10次即第50天时倾去占总体积2/3的上清液并补充新鲜的n6液体培养基至30ml后用已灭菌的40目筛网过滤悬浮细胞，只保留能通过40目筛网的悬浮细胞即获得生长状态均一，分散性好，如沙尘状的细胞团即悬浮细胞系。