一种银杏的组织培养方法及生根培养基与流程

本申请涉及组织培养技术领域，尤其涉及一种银杏的组织培养方法及生根培养基。

背景技术：

银杏为银杏科、银杏属落叶乔木，是我国特有树种，银杏出现在几亿年前，是第四纪冰川运动后遗留下来的裸子植物中最古老的孑遗植物，现存活在世的银杏稀少而分散，上百岁的老树已不多见，和它同纲的所有其他植物皆已灭绝，所以银杏又有“活化石”的美称。银杏树枝生长较慢，寿命极长，自然条件下，从栽种到银杏结果要二十多年，四十年后才能大量结果。银杏具有绿化环境、净化空气、保持水土、防治虫害、调节气温、调节心理等功能，是良好的造林、绿化和观赏树种，对中国大江南北农林种植结构调整、平原农区林业的发展具有重要意义。现代研究表明，银杏叶提取物具有扩张血管、改善脑循环、抑制血小板活化因子等作用，还可开发成保健品、饮料、化妆品等，经济效益颇为可观。

随着市场的需求增加，人们对银杏栽培面积扩大，对银杏的繁殖需求也增大。现有技术中，银杏的繁殖方法主要有4种：播种、扦插、嫁接和植物组织培养。传统的播种方法容易发生性状分离导致银杏品质下降，扦插和嫁接受季节影响较大，并且繁殖速度相对较慢。

随着银杏药用价值的挖掘，对银杏的品质要求也越来越高，现代分子生物学的发展出现了植物组织培养的方法对植物进行无性繁殖，银杏组织培养既可以打破季节的影响也可以保持亲本优良性状，还可以通过优化条件加快繁殖速度以满足不同季节不同品质的需求。在银杏组织培养过程中，大多选择成熟胚诱导无菌苗，然后以无菌苗的胚轴或子叶为外植体，或者以银杏的腋芽为外植体，研究银杏芽的萌发、增殖和生根。在银杏组织培养的过程中常常出现很多问题，比如：由于银杏属木本植物，组织培养苗褐化比较严重；愈伤诱导率低；种子较大，容易污染等。

因此，在通过组织培养来促进银杏的繁殖的方法中，如何避免上述问题，成为本领域技术人员亟待解决的技术问题。

技术实现要素：

本申请提供一种银杏的组织培养方法及生根培养基，以解决现有的通过组织培养来促进银杏繁殖的技术中，组织培养苗褐化严重、容易污染的技术问题。

第一方面，本申请实施例提供一种银杏的组织培养方法，包括如下步骤：

制备ms培养基母液；所述ms培养基母液由大量元素母液、微量元素母液、铁盐母液以及有机物母液组成；

配制浓度为1g/l的6-苄氨基嘌呤溶液和浓度为1g/l萘乙酸溶液；

分别以银杏树枝和银杏果壳为原料，制备得到银杏树枝活性炭和银杏果壳活性炭；

以琼脂、蔗糖、所述ms培养基母液、所述6-苄氨基嘌呤溶液和所述萘乙酸溶液，以及所述银杏树枝活性炭或所述银杏果壳活性炭为原料，制备生根培养基；

取外植体，所述外植体为银杏侧芽带叶茎尖；

对所述外植体进行消毒处理；

将消毒处理后的所述外植体接种到所述生根培养基中；

将接种后的所述生根培养基置于500lux-1000lux光照、20℃-25℃环境下培养。

优选地，所述对外植体进行消毒处理的步骤包括：

将所述外植体置于洗衣粉水中浸泡1h-3.5h后，用流水冲洗5min-15min；

采用自来水，对流水冲洗后得到的外植体浸泡4-5次，每次5min；

将自来水浸泡后得到的外植体置于70％的乙醇溶液中浸泡0.75min-2min，并用无菌水冲洗3-4次，每次1min；

采用0.5％的新洁尔灭，对无菌水冲洗后得到的外植体处理8min-25min，并用无菌水冲洗3-4次，每次1min。

优选地，所述以琼脂、蔗糖、所述ms培养基母液、所述6-苄氨基嘌呤溶液和所述萘乙酸溶液，以及所述银杏树枝活性炭或所述银杏果壳活性炭为原料，制备生根培养基的步骤包括：

分别量取50ml所述大量元素母液、5ml所述微量元素母液、5ml铁盐母液和5ml有机物母液，混合得到ms培养基母液；

分别称取7g-8g琼脂、0-15g蔗糖，以及2g-10g所述银杏树枝活性炭或2g-10g所述银杏果壳活性炭，加入到所述ms培养基母液中，采用蒸馏水定容至1l；

向定容后的所述ms培养基母液中加入0.5ml-1.5ml所述6-苄氨基嘌呤溶液以及0.1ml-0.3ml所述萘乙酸溶液，加热搅拌至所述琼脂完全溶解，得到混合体；

将所述混合体的ph调节至5.2-5.8，分装到培养瓶中；

将所述培养瓶置于121℃下灭菌30min，得到生根培养基。

优选地，所述蔗糖的加入量为0g。

优选地，所述银杏树枝活性炭加入量为6g，所述银杏果壳活性炭的加入量为5g，所述6-苄氨基嘌呤溶液的加入量为1ml，所述萘乙酸溶液的加入量为0.15ml。

优选地，所述大量元素母液的成分及浓度为：硝酸铵1650mg/l、硝酸钾1900mg/l、磷酸二氢钾170mg/l、七水合硫酸镁370mg/l以及无水氯化钙440mg/l。

优选地，所述微量元素母液的成分及浓度为：碘化钾0.83mg/l、硫酸锰22.3mg/l、硼酸6.2mg/l、硫酸锌8.6mg/l、钼酸钠0.25mg/l、硫酸铜0.025mg/l以及氯化钴0.025mg/l。

优选地，所述铁盐母液的成分及浓度为：硫酸亚铁27.8mg/l和乙二胺四乙酸二钠37.3mg/l。

优选地，所述有机物母液的成分及浓度为：肌醇100mg/l、烟酸0.5mg/l、盐酸硫胺素0.1mg/l、盐酸多吡醇0.5mg/l以及甘氨酸2mg/l。

第二方面，本申请实施例提供一种用于银杏组织培养的生根培养基，包括琼脂、ms培养基母液、6-苄氨基嘌呤溶液和萘乙酸溶液，以及银杏树枝活性炭或银杏果壳活性炭；

所述ms培养基母液由大量元素母液、微量元素母液、铁盐母液以及有机物母液组成；

所述银杏树枝活性炭由银杏树枝制备而成；

所述银杏果壳活性炭由银杏果壳制备而成。

由以上技术方案可知，本申请实施例提供一种银杏的组织培养方法及生根培养基，所述方法包括：制备ms培养基母液；配制浓度为1g/l的6-苄氨基嘌呤溶液和浓度为1g/l萘乙酸溶液；分别以银杏树枝和银杏果壳为原料，制备得到银杏树枝活性炭和银杏果壳活性炭；以琼脂、蔗糖、所述ms培养基母液、所述6-苄氨基嘌呤溶液和所述萘乙酸溶液，以及所述银杏树枝活性炭或所述银杏果壳活性炭为原料，制备生根培养基；以银杏侧芽带叶茎尖为外植体，将消毒处理后的所述外植体接种到所述生根培养基中，置于500lux-1000lux光照、20℃-25℃环境下培养。

与现有技术相比，本申请技术方案采用银杏侧芽带叶茎尖作为外植体，直接诱导生根，缩短了现有技术中利用胚或者腋芽为外植体时促使萌发的时间，缩短育苗周期；能够最大限度的保持亲本的优良性状；在制备生根培养基时加入自制的活性炭，即银杏树枝活性炭或银杏果壳活性炭，将其加入培养基中，能够改善组织培养苗的褐化现象；同时还有抑菌和促进生长的作用。

附图说明

为了更清楚地说明本申请的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本申请根据一示例性示出的一种银杏的组织培养方法流程图；

图2为本申请根据一示例性示出的另一种银杏的组织培养方法流程图；

图3为本申请根据一示例性示出的又一种银杏的组织培养方法流程图。

具体实施方式

参见图1，为本申请实施例提供的一种银杏的组织培养方法流程图，由图1可知，所述方法包括如下步骤：

步骤s01、制备ms培养基母液；所述ms培养基母液由大量元素母液、微量元素母液、铁盐母液以及有机物母液组成；

步骤s02、配制浓度为1g/l的6-苄氨基嘌呤溶液和浓度为1g/l萘乙酸溶液；

植物组织培养技术是以离体植物细胞或原生质体为对象，以细胞量扩增和目标代谢产物累积为目的的培养工艺。对于以获得特定代谢产物为目的的细胞培养而言，其主要工艺环节不仅在于细胞量的扩增，同时，目标代谢产物的诱导合成对培养效果尤为重要。在植物细胞的组织培养过程中，培养条件和营养条件是影响培养效果的重要因素，其中，培养条件是指温度、溶氧、光照、ph等环境条件的控制，而营养条件主要指植物细胞的培养基。由于在封闭培养环境中，培养基是植物细胞的唯一营养来源，因此培养基的成分对植物细胞的生产水平，代谢产物类别具有极其重要的影响。

ms培养基是murashige和skoog于1962年为烟草细胞培养设计的，其特点是无机盐和离子浓度较高，是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量高，其养分的数量和比例合适，能满足植物细胞的营养和生理需要，因而适用范围比较广，多数植物组织培养快速繁殖用它作为培养基的基本培养基。

ms培养基的主要组成为大量元素、微量元素、铁盐以及有机物。

本申请中，ms培养基母液由大量元素母液、微量元素母液、铁盐母液以及有机物母液组成，四种母液的主要成分及浓度分别见下表表1至表4。

表1

表2

表3

表4

本申请中，将植物激素6-苄氨基嘌呤(6-ba)和植物激素萘乙酸(naa)配制成溶液，并以此作为制备生根培养基的原料之一，或者说，是在ms培养基的基础上添加6-ba和naa植物激素，以其作为生根培养基中诱导子及前体物质，促进银杏外植体细胞的代谢，优化组织培养效果。

取相应质量的6-ba，将其加入至0.5n的naoh溶液中加热溶解，冷却，用蒸馏水定容，得到浓度为1g/l的6-苄氨基嘌呤溶液，并将6-苄氨基嘌呤溶液置于4℃下保存，备用。

取相应质量的naa，将其加入至少量的无水乙醇中溶解，用蒸馏水定容，得到浓度为1g/l的萘乙酸溶液，并将萘乙酸溶液置于4℃下保存，备用。

步骤s03、分别以银杏树枝和银杏果壳为原料，制备得到银杏树枝活性炭和银杏果壳活性炭；

具体的，收集银杏树枝和银杏果壳，放入80℃烘箱烘干，分别用粉碎机打成粉末，分装，制成银杏树枝活性炭和银杏果壳活性炭。

本申请中，以银杏树枝活性炭和银杏果壳活性炭作为制备生根培养基的原料之一，或者说，将银杏树枝活性炭和银杏果壳活性炭加入到ms培养基中，对其进行改良，能够有效抑菌并减少组织培养苗褐变的发生，有利于保持亲本优良性状。

步骤s04、以琼脂、蔗糖、所述ms培养基母液、所述6-苄氨基嘌呤溶液和所述萘乙酸溶液，以及所述银杏树枝活性炭或所述银杏果壳活性炭为原料，制备生根培养基；

参阅图2，具体地，在步骤s041中，分别量取50ml所述大量元素母液、5ml所述微量元素母液、5ml铁盐母液和5ml有机物母液，混合得到ms培养基母液；

在步骤s042中，分别称取7g-8g琼脂、0-15g蔗糖，以及2g-10g所述银杏树枝活性炭或2g-10g所述银杏果壳活性炭，加入到所述ms培养基母液中，采用蒸馏水定容至1l；

在步骤s043中，向定容后的所述ms培养基母液中加入0.5ml-1.5ml所述6-苄氨基嘌呤溶液以及0.1ml-0.3ml所述萘乙酸溶液，加热搅拌至所述琼脂完全溶解，得到混合体；

在步骤s044中，将所述混合体的ph调节至5.2-5.8，分装到培养瓶中；

在步骤s045中，将所述培养瓶置于121℃下灭菌30min，得到生根培养基。

优选地，所述蔗糖的加入量为0g。

优选地，所述银杏树枝活性炭加入量为6g，所述银杏果壳活性炭的加入量为5g，所述6-苄氨基嘌呤溶液的加入量为1ml，所述萘乙酸溶液的加入量为0.15ml。

在步骤s05中，取外植体，所述外植体为银杏侧芽带叶茎尖；

银杏的快速繁殖方式多为扦插和组织培养，组织培养选择的外植体一般是胚、腋芽、茎段、子叶、胚轴、小孢子、配子体等。一般的外植体，如胚、茎段、子叶、胚轴等都要求幼嫩，多用种子萌发所得，不然褐化严重。组织培养苗因属于无性繁殖，都能保持亲本的性状，选择性状优良的母树自然能保持亲本的优良性状。而通过种子播种会发生性状分离，不一定能保持亲本的优良性状。

本申请中，采用银杏侧芽带叶茎尖作为外植体，直接诱导生根，缩短了利用胚或者腋芽为外植体时促使萌发的时间，缩短了育苗周期；对树龄要求不高，只需要是当年萌发的幼苗，例如，选择广安地区树龄约30年母树当年发出的侧芽带叶茎尖；以银杏侧芽带叶茎尖作为外植体，能够最大限度的保持亲本的优良性状，通过这种方式繁殖银杏具有较大的生产应用价值。

在步骤s06中，对所述外植体进行消毒处理；

具体实现中，参阅图3，对所述外植体进行消毒处理的步骤包括：

步骤s061、将所述外植体置于洗衣粉水中浸泡1h-3.5h后，用流水冲洗5min-15min；

步骤s062、采用自来水，对步骤s061得到的外植体浸泡4-5次，每次5min；

步骤s063、将步骤s062得到的外植体置于70％的乙醇溶液中浸泡0.75min-2min，并用无菌水冲洗3-4次，每次1min；

步骤s064、采用0.5％的新洁尔灭，对步骤s063得到的外植体处理8min-25min，并用无菌水冲洗3-4次，每次1min。

在步骤s07中，将消毒处理后的所述外植体接种到所述生根培养基中；

在步骤s08中，将接种后的所述生根培养基置于500lux-1000lux光照、20℃-25℃环境下培养。

本申请实施例还提供一种用于银杏组织培养的生根培养基，包括琼脂、ms培养基母液、6-苄氨基嘌呤溶液和萘乙酸溶液，以及银杏树枝活性炭或银杏果壳活性炭；

所述ms培养基母液由大量元素母液、微量元素母液、铁盐母液以及有机物母液组成；

所述银杏树枝活性炭由银杏树枝制备而成；

所述银杏果壳活性炭由银杏果壳制备而成。

由以上技术方案可知，本申请实施例提供一种银杏的组织培养方法及生根培养基，所述方法包括：制备ms培养基母液；配制浓度为1g/l的6-苄氨基嘌呤溶液和浓度为1g/l萘乙酸溶液；分别以银杏树枝和银杏果壳为原料，制备得到银杏树枝活性炭和银杏果壳活性炭；以琼脂、蔗糖、所述ms培养基母液、所述6-苄氨基嘌呤溶液和所述萘乙酸溶液，以及所述银杏树枝活性炭或所述银杏果壳活性炭为原料，制备生根培养基；以银杏侧芽带叶茎尖为外植体，将消毒处理后的所述外植体接种到所述生根培养基中，置于500lux-1000lux光照、20℃-25℃环境下培养。

与现有技术相比，本申请技术方案采用银杏侧芽带叶茎尖作为外植体，直接诱导生根，缩短了现有技术中利用胚或者腋芽为外植体时促使萌发的时间，缩短育苗周期；能够最大限度的保持亲本的优良性状；在制备生根培养基时加入自制的活性炭，包括银杏树枝活性炭和银杏果壳活性炭，将其加入培养基中，能够改善组织培养苗的褐化现象；同时还有抑菌和促进生长的作用。

本申请技术方案的具体实施方式，还可参见以下几个实施例。

实施例1

选择广安地区3月下旬到5月上旬树龄约30年母树当年发出的带2-3片叶子的侧芽茎尖作为外植体。将采集的外植体置于洗衣粉水中泡1h，用流水冲洗5min；然后用自来水泡4-5次；将得到的外植体放置在70％的乙醇溶液中处理1min，无菌水洗3次，采用0.5％的新洁尔灭处理15min，无菌水洗3-4次。将消毒处理后的外植体接种到生根培养基中，生根培养基中各原料的质量比为：ms培养基母液:蔗糖:银杏树枝活性炭:萘乙酸:6-苄氨基嘌呤:琼脂＝1000000:15000:2000:0.15:1:8000。培养基ph值为5.2。将接种好的培养瓶放置在1000lux光照、光照10h/d、20℃条件下培养。

实施例2

选择广安地区3月下旬到5月上旬树龄约30年母树当年发出的带2-3片叶子的侧芽茎尖作为外植体。将采集的外植体置于洗衣粉水中泡2h，用流水冲洗10min；然后用自来水泡4-5次；将得到的外植体放置在70％的乙醇溶液中处理1min，无菌水洗3次，采用0.5％的新洁尔灭处理20min，无菌水洗3-4次。将消毒处理后的外植体接种到生根培养基中，生根培养基中各原料的质量比为：ms培养基母液:蔗糖:银杏树枝活性炭:萘乙酸:6-苄氨基嘌呤:琼脂＝1000000:75000:4000:0.15:1:7500，培养基ph值为5.4。将接种好的培养瓶放置在1000lux光照、光照10h/d、20℃条件下培养。

实施例3

选择广安地区3月下旬到5月上旬树龄约30年母树当年发出的带2-3片叶子的侧芽茎尖作为外植体。将采集的外植体置于洗衣粉水中泡3h，用流水冲洗15min；然后用自来水泡4-5次；将得到的外植体放置在70％的乙醇溶液中处理2min，无菌水洗3次，采用0.5％的新洁尔灭处理25min，无菌水洗3-4次。将消毒处理后的外植体接种到生根培养基中，生根培养基中各原料的质量比为：ms培养基母液:蔗糖:银杏树枝活性炭:萘乙酸:6-苄氨基嘌呤:琼脂＝1000000:0:6000:0.15:1:7000，培养基ph值为5.6。将接种好的培养瓶放置在1000lux光照、光照10h/d、20℃条件下培养。

实施例4

选择广安地区3月下旬到5月上旬树龄约30年母树当年发出的带2-3片叶子的侧芽茎尖作为外植体。将采集的外植体置于洗衣粉水中泡3h，用流水冲洗15min；然后用自来水泡4-5次；将得到的外植体放置在70％的乙醇溶液中处理50s，无菌水洗3次，采用0.5％的新洁尔灭处理8min，无菌水洗3-4次。将消毒处理后的外植体接种到生根培养基中，生根培养基中各原料的质量比为：ms培养基母液:蔗糖:银杏果壳活性炭:萘乙酸:6-苄氨基嘌呤:琼脂＝1000000:0:2000:0.15:1:7500，培养基ph值为5.2。将接种好的培养瓶放置在1000lux光照、光照10h/d、20℃条件下培养。

实施例5

选择广安地区3月下旬到5月上旬树龄约30年母树当年发出的带2-3片叶子的侧芽茎尖作为外植体。将采集的外植体置于洗衣粉水中泡3h，用流水冲洗15min；然后用自来水泡4-5次；将得到的外植体放置在70％的乙醇溶液中处理1min，无菌水洗3次，采用0.5％的新洁尔灭处理10min，无菌水洗3-4次。将消毒处理后的外植体接种到生根培养基中，生根培养基中各原料的质量比为：ms培养基母液:蔗糖:银杏果壳活性炭:萘乙酸:6-苄氨基嘌呤:琼脂＝1000000:0:4000:0.15:1:7500，培养基ph值为5.4。将接种好的培养瓶放置在1000lux光照、光照10h/d、20℃条件下培养。

实施例6

选择广安地区3月下旬到5月上旬树龄约30年母树当年发出的带2-3片叶子的侧芽茎尖作为外植体。将采集的外植体置于洗衣粉水中泡3h，用流水冲洗15min；然后用自来水泡4-5次；将得到的外植体放置在70％的乙醇溶液中处理1.5min，无菌水洗3次，采用0.5％的新洁尔灭处理15min，无菌水洗3-4次。将消毒处理后的外植体接种到生根培养基中，生根培养基中各原料的质量比为：ms培养基母液:蔗糖:银杏果壳活性炭:萘乙酸:6-苄氨基嘌呤:琼脂＝1000000:0:5000:0.15:1:7500，培养基ph值为5.6。将接种好的培养瓶放置在1000lux光照、光照10h/d、20℃条件下培养。

需要说明的是，上述实施例1至实施例6中所述的生根培养基中各原料的质量比中，萘乙酸和6-苄氨基嘌呤是指纯物质的质量。因此，具体实现时，应根据萘乙酸和6-苄氨基嘌呤纯物质与其他原料的质量比，以及萘乙酸溶液和6-苄氨基嘌呤溶液的浓度，来确定萘乙酸溶液和6-苄氨基嘌呤溶液取量。

上述实施例1至实施例6对应的实验结果数据如下表：

表5

由表5可以看出，采用选用银杏侧芽带叶茎尖为外植体，利用植物激素和自制活性炭改良ms培养基，能够有效地改善现有技术中组织培养苗的褐化及污染的问题，还能保持亲本性状，促进生长。其中，实施例3和实施例6没有褐化和污染现象的出现，且培养10天后，组织培养苗的生长高度达到1.5cm左右，培养30天后，组织培养苗的生长高度达到1.8cm-1.9cm。

与现有技术相比，本申请技术方案采用银杏侧芽带叶茎尖作为外植体，直接诱导生根，缩短了现有技术中利用胚或者腋芽为外植体时促使萌发的时间，缩短育苗周期；能够最大限度的保持亲本的优良性状；在制备生根培养基时加入自制的活性炭，包括银杏树枝活性炭和银杏果壳活性炭，将其加入培养基中，能够改善组织培养苗的褐化现象，同时还有抑菌和促进生长的作用。

本说明书中各个实施例之间相同相似的部分互相参见即可。

以上所述的本发明实施方式并不构成对本发明保护范围的限定。