本发明涉及一种甜瓜花药诱导培养基及花培育种方法，具体涉及一种有效提高花药愈伤诱导率、大大加快了甜瓜花培育种进程的甜瓜花药诱导培养基及花培育种方法，属于果蔬培育种植技术领域。
背景技术：
甜瓜（melon），别名甘瓜、香瓜、穿肠瓜、果瓜以及熟瓜，在植物分类学上属于葫芦科（cucurbitaceae）甜瓜属（cucumis），是1年生蔓性草本植物，是一种深受人们喜爱的水果型蔬菜。甜瓜原产于印度、非洲热带沙漠地区，大约在北魏时期随着西瓜一同传到中国，明朝开始广泛种植。作为世界十大水果之一，一直以其风味独特著称。
成熟甜瓜果实中含有大量的碳水化合物及柠檬酸、胡萝卜素和维生素b、c等，且水分充沛，可消暑清热，生津解渴，除烦等；营养甜瓜中含有转化酶，可以将不溶性蛋白质转变成可溶性蛋白质，能帮助肾脏病人吸收营养，对肾病患者有益；甜瓜蒂所含的葫芦素b能明显增加实验性肝糖元蓄积，减轻慢性肝损伤，从而阻止肝细胞脂肪变性及抑制纤维增生；甜瓜蒂含有苦毒素，葫芦素b、e等结晶性苦味质，能刺激胃粘膜，内服适量，可致呕吐，但不为身体吸收，而无虚脱及中毒等弊端；现代研究发现，甜瓜子有驱杀蛔虫、丝虫等作用，可广泛用于治疗虫积病症。补充营养甜瓜熟肉含有蛋白质、脂肪、碳水化合物、无机盐等，可补充人体所需要的能量及营养素，帮助机体恢复健康。
作为一种重要的瓜类经济作物，甜瓜为世界十大重要水果之一，栽培面积和产量较大，世界温带至热带地区广泛栽培。中国、俄罗斯、西班牙、美国、伊朗、意大利、日本等国家普遍栽培，以中国产量最高。自20世纪80年代以来，我国甜瓜的栽培面积和产量一直居于世界第一。因此，我国甜瓜生产在世界上占有重要地位，甜瓜是我国高端农业的优势作物，对农民增收与农业结构调整有着重要意义。
由于甜瓜是异花授粉植物，天然杂交率高，因此采用常规育种手段获得纯系具有周期长、难度大、遗传性状不稳定等缺点，而利用单倍体技术育种就可以避免这些问题，大大提高育种效率。单倍体育种技术是指通过诱发单性生殖使某些品种的异质配子发育成单倍体植株，再经过染色体加倍获得纯系，之后进行品种选育的一种育种方法。这种技术能够缩短育种年限、提高育种效率。但自然界中，作物自发产生单倍体植株的几率极低，不过通过一些人为手段可获得单倍体，如花药或游离小孢子培养技术。迄今为止，甜瓜中没有发现自发产生的单倍体植株，所以甜瓜花培技术就成为获得甜瓜单倍体植株的重要途径。
技术实现要素：
本发明的目的是针对当前甜瓜花培愈伤组织诱导率极低、花培技术不完善的缺陷，提供了一种有效提高花药愈伤诱导率、大大加快了甜瓜花培育种进程的甜瓜花药诱导培养基及花培育种方法。
本发明采用的技术方案如下：
一种甜瓜花药诱导培养基，其特征在于：培养基配方由每升蒸馏水中以下组分含量分别为：kno380-90mg/l，mgso4∙7h2o140-160mg/l，kh2po470-76mg/l，ca(no3)2∙4h2o160-200mg/l，mnso4∙4h2o25-30mg/l，na2-edta11-14mg/l，feso4∙7h2o12-15mg/l，h3bo38.0-8.5mg/l，znso4∙7h2o8.5-9.5mg/l，ki0.45-0.55mg/l，agno315-19mg/l，na2moo4∙2h2o0.2-0.3mg/l，cuso4∙5h2o0.02-0.03mg/l，cocl2∙6h2o0.02-0.03mg/l，腺嘌呤13-17mg/l，谷氨酰胺450-550mg/l，维生素b10.9-1.1mg/l，维生素b60.6-0.8mg/l，vc0.55-0.65mg/l，烟酸4.5-5.5mg/l，肌醇120-140mg/l，甘氨酸3.5-4.5mg/l，胰岛素1.8-2.2mg/l，环鸟苷酸0.15-0.25g/l，谷胱甘肽30-35mg/l，甲基磺酸乙酯1.0-1.4g/l，蔗糖42-48g/l，琼脂6.5-7.5g/l，6-ba0.8-1.2mg/l，naa0.8-1.2mg/l，甘露醇14-16g/l，椰乳27-33g/l，植物硫化激动素psk-α18-22pmol/l。
所述的培养基配方由每升蒸馏水中以下组分最佳含量分别为：kno385mg/l，mgso4∙7h2o150mg/l，kh2po473mg/l，ca(no3)2∙4h2o180mg/l，mnso4∙4h2o27.5mg/l，na2-edta12.5mg/l，feso4∙7h2o13.5mg/l，h3bo38.25mg/l，znso4∙7h2o9.0mg/l，ki0.5mg/l，agno317mg/l，na2moo4∙2h2o0.25mg/l，cuso4∙5h2o0.025mg/l，cocl2∙6h2o0.025mg/l，腺嘌呤15mg/l，谷氨酰胺500mg/l，维生素b11.0mg/l，维生素b60.7mg/l，vc0.6mg/l，烟酸5.0mg/l，肌醇130mg/l，甘氨酸4.0mg/l，胰岛素2.0mg/l，环鸟苷酸0.2g/l，谷胱甘肽32.5mg/l，甲基磺酸乙酯1.2g/l，蔗糖45g/l，琼脂7.0g/l，6-ba1.0mg/l，naa1.0mg/l，甘露醇15g/l，椰乳30g/l，植物硫化激动素psk-α20pmol/l。
所述的甲基磺酸乙酯的添加方法为：配制好甲基磺酸乙酯溶液后，用灭菌的0.22μm的微孔滤膜过滤灭菌，待培养基高压蒸汽灭菌后冷凝到45-55℃时，取出置于超净工作台中，无菌操作，加入甲基磺酸乙酯溶液，摇匀冷凝，24h时间内接种。
所述的培养基的配制ph值为：5.4-5.8，最佳配制ph值为5.6。
一种甜瓜花培育种方法，其特征在于：花培育种方法按如下步骤操作：
（1）花蕾取材与预处理
在大田常规栽培的甜瓜处于初花期时，上午9-11点采集生长健壮、无病虫害的植株上取发育时期处于单核靠边期的花蕾为试材，将采集的花蕾用湿纱布包裹后再用自封塑料袋套起，置于4℃冰箱中低温处理2d，然后转入36℃环境下热激处理2d；
（2）培养基的配制
将权利要求1、2、3和4所述的培养基配制好后分装于250ml的三角瓶中，每瓶盛50ml-70ml的培养基，密封后置于温度为121℃、压力为15kpa高压蒸汽条件下灭菌20min，冷凝到45-55℃时，取出置于超净工作台中，无菌操作，加入甲基磺酸乙酯溶液，摇匀冷凝，24h时间内接种；
（3）花药接种
取出预处理后的花蕾，先用流水冲洗1-2min，用镊子剥去花柄，用小块纱布包裹，浸入70%酒精中15s，用无菌水冲洗2-3次后转入0.1%升汞溶液中消毒8-10分钟，然后用无菌水冲洗3-4次，将花蕾放入覆有滤纸的灭菌培养皿内，无菌条件下剥取花药接种到步骤2配制好的诱导培养基上，每瓶接入花药14-16枚；
（4）花药诱导培养
将接种花药后的培养基置于温度为26-28℃、光照强度1400-1800lx、光周期11h光/13h暗的环境下进行培养，诱导出花药愈伤；
（5）花药分化培养
待花药愈伤长至直径2.5cm后，挑选半透明、结构松散的愈伤组织转接入分化培养基上进行分化培养，愈伤逐渐分化出绿苗；
（6）驯化与移栽
花药分化培养35d后绿苗生长旺盛，此时将封口膜打开驯化炼苗，7d后将试管苗取出，将根部清洗干净，移栽入温室，常规栽培。
所述步骤（1）的单核靠边期的甜瓜花蕾选材标准为：测量甜瓜花蕾的纵茎长度，纵茎长度为3.0-3.6mm的花蕾。
所述步骤（5）分化培养的条件为：温度25-27℃、湿度为70%-80%、光照强度2000-2500lux、光周期12h光/12h暗。
本发明提供的甜瓜花药诱导培养基及花培育种方法是在现有其它蔬菜种的研究基础之上特异性针对甜瓜花药培养要求进行创造性改良的成果，本发明大大提高了甜瓜花药愈伤组织诱导率，首次建立了甜瓜花培育种程序。
本发明所提供的甜瓜花药诱导培养基，是经过大量单因子、多因子试验所筛选的，通过大量的实验研究证明了本发明的培养基组分配比是最优组合。采用本发明所提供的培养基可以大大提高甜瓜花药愈伤组织诱导效率，因此具有较高的产业推广价值。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
一种甜瓜花药诱导培养基及花培育种方法，其特征在于：花培育种方法按如下步骤操作：
（1）花蕾取材与预处理
在大田常规栽培的甜瓜处于初花期时，上午9-11点采集生长健壮、无病虫害的植株上取发育时期处于单核靠边期的花蕾为试材，单核靠边期的甜瓜花蕾选材标准为：测量甜瓜花蕾的纵茎长度，纵茎长度为3.0-3.6mm的花蕾；将采集的花蕾用湿纱布包裹后再用自封塑料袋套起，置于4℃冰箱中低温处理2d，然后转入36℃环境下热激处理2d；
（2）培养基的配制
配制甜瓜花药诱导培养基，培养基配方由每升蒸馏水中以下组分含量分别为：kno380-90mg/l，mgso4∙7h2o140-160mg/l，kh2po470-76mg/l，ca(no3)2∙4h2o160-200mg/l，mnso4∙4h2o25-30mg/l，na2-edta11-14mg/l，feso4∙7h2o12-15mg/l，h3bo38.0-8.5mg/l，znso4∙7h2o8.5-9.5mg/l，ki0.45-0.55mg/l，agno315-19mg/l，na2moo4∙2h2o0.2-0.3mg/l，cuso4∙5h2o0.02-0.03mg/l，cocl2∙6h2o0.02-0.03mg/l，腺嘌呤13-17mg/l，谷氨酰胺450-550mg/l，维生素b10.9-1.1mg/l，维生素b60.6-0.8mg/l，vc0.55-0.65mg/l，烟酸4.5-5.5mg/l，肌醇120-140mg/l，甘氨酸3.5-4.5mg/l，胰岛素1.8-2.2mg/l，环鸟苷酸0.15-0.25g/l，谷胱甘肽30-35mg/l，甲基磺酸乙酯1.0-1.4g/l，蔗糖42-48g/l，琼脂6.5-7.5g/l，6-ba0.8-1.2mg/l，naa0.8-1.2mg/l，甘露醇14-16g/l，椰乳27-33g/l，植物硫化激动素psk-α18-22pmol/l，ph值为：5.4-5.8；
培养基配方由每升蒸馏水中以下组分最佳含量分别为：kno385mg/l，mgso4∙7h2o150mg/l，kh2po473mg/l，ca(no3)2∙4h2o180mg/l，mnso4∙4h2o27.5mg/l，na2-edta12.5mg/l，feso4∙7h2o13.5mg/l，h3bo38.25mg/l，znso4∙7h2o9.0mg/l，ki0.5mg/l，agno317mg/l，na2moo4∙2h2o0.25mg/l，cuso4∙5h2o0.025mg/l，cocl2∙6h2o0.025mg/l，腺嘌呤15mg/l，谷氨酰胺500mg/l，维生素b11.0mg/l，维生素b60.7mg/l，vc0.6mg/l，烟酸5.0mg/l，肌醇130mg/l，甘氨酸4.0mg/l，胰岛素2.0mg/l，环鸟苷酸0.2g/l，谷胱甘肽32.5mg/l，甲基磺酸乙酯1.2g/l，蔗糖45g/l，琼脂7.0g/l，6-ba1.0mg/l，naa1.0mg/l，甘露醇15g/l，椰乳30g/l，植物硫化激动素psk-α20pmol/l，最佳配制ph值为5.6；
将培养基配制好后分装于250ml的三角瓶中，每瓶盛50ml-70ml的培养基，密封后置于温度为121℃、压力为15kpa高压蒸汽条件下灭菌20min，冷凝到45-55℃时，取出置于超净工作台中，无菌操作，加入甲基磺酸乙酯溶液，甲基磺酸乙酯的添加方法为：配制好甲基磺酸乙酯溶液后，用灭菌的0.22μm的微孔滤膜过滤灭菌，待培养基高压蒸汽灭菌后冷凝到45-55℃时，取出置于超净工作台中，无菌操作，加入甲基磺酸乙酯溶液，摇匀冷凝，24h时间内接种；摇匀冷凝，24h时间内接种；
（3）花药接种
取出预处理后的花蕾，先用流水冲洗1-2min，用镊子剥去花柄，用小块纱布包裹，浸入70%酒精中15s，用无菌水冲洗2-3次后转入0.1%升汞溶液中消毒8-10分钟，然后用无菌水冲洗3-4次，将花蕾放入覆有滤纸的灭菌培养皿内，无菌条件下剥取花药接种到步骤2配制好的诱导培养基上，每瓶接入花药14-16枚；
（4）花药诱导培养
将接种花药后的培养基置于温度为26-28℃、光照强度1400-1800lx、光周期11h光/13h暗的环境下进行培养，诱导出花药愈伤；
（5）花药分化培养
待花药愈伤长至直径2.5cm后，挑选半透明、结构松散的愈伤组织转接入分化培养基上进行分化培养，分化培养的条件为：温度25-27℃、湿度为70%-80%、光照强度2000-2500lux、光周期12h光/12h暗，愈伤逐渐分化出绿苗；
（6）驯化与移栽
花药分化培养35d后绿苗生长旺盛，此时将封口膜打开驯化炼苗，7d后将试管苗取出，将根部清洗干净，移栽入温室，常规栽培。
实施例1
一种甜瓜花药诱导培养基，按照以下配方配制：
每升蒸馏水中以下组分含量分别为：kno385mg/l，mgso4∙7h2o150mg/l，kh2po473mg/l，ca(no3)2∙4h2o180mg/l，mnso4∙4h2o27.5mg/l，na2-edta12.5mg/l，feso4∙7h2o13.5mg/l，h3bo38.25mg/l，znso4∙7h2o9.0mg/l，ki0.5mg/l，agno317mg/l，na2moo4∙2h2o0.25mg/l，cuso4∙5h2o0.025mg/l，cocl2∙6h2o0.025mg/l，腺嘌呤15mg/l，谷氨酰胺500mg/l，维生素b11.0mg/l，维生素b60.7mg/l，vc0.6mg/l，烟酸5.0mg/l，肌醇130mg/l，甘氨酸4.0mg/l，胰岛素2.0mg/l，环鸟苷酸0.2g/l，谷胱甘肽32.5mg/l，甲基磺酸乙酯1.2g/l，蔗糖45g/l，琼脂7.0g/l，6-ba1.0mg/l，naa1.0mg/l，甘露醇15g/l，椰乳30g/l，植物硫化激动素psk-α20pmol/l，最佳配制ph值为5.6。
将培养基配制好后分装于250ml的三角瓶中，每瓶盛50ml-70ml的培养基，密封后置于温度为121℃、压力为15kpa高压蒸汽条件下灭菌20min，冷凝到45-55℃时，取出置于超净工作台中，无菌操作，加入甲基磺酸乙酯溶液，甲基磺酸乙酯的添加方法为：配制好甲基磺酸乙酯溶液后，用灭菌的0.22μm的微孔滤膜过滤灭菌，待培养基高压蒸汽灭菌后冷凝到45-55℃时，取出置于超净工作台中，无菌操作，加入甲基磺酸乙酯溶液，摇匀冷凝，24h时间内接种；摇匀冷凝，24h时间内接种。
试验甜瓜品种选为红城10号和龙甜一号，花培育种方法按如下步骤操作：
花蕾取材与预处理：在大田常规栽培的甜瓜处于初花期时，上午9-11点采集生长健壮、无病虫害的植株上取发育时期处于单核靠边期的花蕾为试材，单核靠边期的甜瓜花蕾选材标准为：测量甜瓜花蕾的纵茎长度，纵茎长度为3.0-3.6mm的花蕾；将采集的花蕾用湿纱布包裹后再用自封塑料袋套起，置于4℃冰箱中低温处理2d，然后转入36℃环境下热激处理2d；
花药接种：取出预处理后的花蕾，先用流水冲洗1-2min，用镊子剥去花柄，用小块纱布包裹，浸入70%酒精中15s，用无菌水冲洗2-3次后转入0.1%升汞溶液中消毒9分钟，然后用无菌水冲洗3-4次，将花蕾放入覆有滤纸的灭菌培养皿内，无菌条件下剥取花药接种到步骤2配制好的诱导培养基上，每瓶接入花药14-16枚；
花药诱导培养：将接种花药后的培养基置于温度为27℃、光照强度1600lx、光周期11h光/13h暗的环境下进行培养，诱导出花药愈伤，统计花药愈伤组织诱导率，花药愈伤组织诱导率（%）=花药愈伤组织数/接种花药数×100%，实际统计得到红城10号和龙甜一号花药愈伤组织诱导率分别为35.4%和28.8%；
花药分化培养：待花药愈伤长至直径2.5cm后，挑选半透明、结构松散的愈伤组织转接入分化培养基上进行分化培养，分化培养的条件为：温度26℃、湿度为75%、光照强度2250lux、光周期12h光/12h暗；愈伤逐渐分化出绿苗；
驯化与移栽：花药分化培养35d后绿苗生长旺盛，此时将封口膜打开驯化炼苗，7d后将试管苗取出，将根部清洗干净，移栽入温室，常规栽培。
实施例2
在本发明的甜瓜花药诱导培养的研发过程中，进行了培养基组分的单因子配比试验，培养基配方的单因子试验组分种类分别为：腺嘌呤、vc、胰岛素、环鸟苷酸、甲基磺酸乙酯、椰乳和植物硫化激动素psk-α。每个试验组分差异均仅限一种，其它组分与实施例1相同。试验甜瓜品种均亦选为红城10号和龙甜一号，培养基的配制方法、花培育种方法均与实施例1相同。
单因子配比试验具体配比和试验结果如下表1-表7。
由表1到表7的甜瓜花药诱导培养基组分改变的单因子试验可以发现，培养基配方的单因子试验组分种类中胰岛素、甲基磺酸乙酯和椰乳配比的增加产生了显著的不利效应；而腺嘌呤、vc、环鸟苷酸和植物硫化激动素psk-α的增加不能显著增加培养基的诱导效果，由于这些添加物的增加会提高培养基的配制成本，在培养基诱导效果达最优值的最小配比量是综合生产成本后的最佳配比。由此可见，进行任何培养基组分的增加或减少均是不利的，同时说明本发明的组分配比是最优的。
实施例3
为了比较本发明所提供的甜瓜花药诱导培养基与其它培养基对甜瓜花药胚性愈伤组织诱导效率的差异，我们另外选择了2种花药诱导培养基，试验品种亦采用红城10号和龙甜一号，花药分离方法、组培操作方法、培养方法均与实施例1相同，胚性愈伤组织形成后分别统计红城10号和龙甜一号的花药在该2种培养基内的花药愈伤组织诱导率。
其它2种花药诱导培养基配方为：
c17-2培养基：c17-2基本培养基+20g/l蔗糖+7g/l琼脂+2mg/l2，4-d+1mg/l激动素，ph为5.8（对比文件来自于f∙s∙wen等《高粱花药和花序培养诱导愈伤组织及再生植株》）；
ms培养基：ms基本培养基+3%蔗糖＋1.0mg/lnaa＋1.0mg/lkt＋10%椰乳，ph为5.8（对比文件来自于高秀云等《番茄花药离体培养获得植株》）。
培养基对比实验
将采用本发明所提供的花药诱导培养基与对比实施例所提供的其它2种培养基诱导红城10号和龙甜一号花药愈伤组织统计所得的花药愈伤组织诱导率进行比较，比较结果如下表8所示。
由上表8可以发现，本发明提供的甜瓜花药诱导培养基及花培育种方法对甜瓜品种红城10号和龙甜一号的花药愈伤组织诱导率均值高达32.1%，，可以发现本发明的甜瓜花药诱导培养基及花培育种方法特异性针对甜瓜花药培养要求进行创造性改良的成果，首次建立了甜瓜花培育种程序。采用本发明所提供的培养基可以大大提高甜瓜花药愈伤组织诱导效率，因此具有较高的产业推广价值。
本领域技术人员可以根据本发明公开的内容和所掌握的本领域技术对本发明内容作出替换或变型，但是这些替换或变型都不应视为脱离本发明构思的，这些替换或变型均在本发明要求保护的权利范围内。