一种促进老化大豆种子萌发的方法与流程

本发明属于大豆培育领域，具体地说，涉及一种促进老化大豆种子萌发的方法。

背景技术：

大豆(glycinemax)作为富含蛋白质的粮食及油料作物，在我国具有悠久的栽培历史。20世纪我国是世界上重要的大豆生产与出口国之一，随着种植面积的急剧减少，需求不断地增加，现如今我国大豆由出口转变为进口，严重的威胁着我国的粮食安全。因此，大力发展国内的大豆产业是当前大豆生产过程中亟待解决的问题。但是，大豆种子的活力受环境的影响较大，在储藏的过程中极易发生老化，种子活力急剧降低，在农业生产中对萌发与出苗造成较大的影响。大豆种子的老化严重的制约了我国大豆产业的发展，引起了广泛的关注。

种子在成熟之后不可避免的都在发生老化，种皮结构发生损伤，内部储存的能量物质发生过氧化反应，遗传物质损伤等导致种子寿命缩短。大豆种子在储存的过程中受环境的影响较大，在收获储存的过程中极易发生老化。大豆种质资源的保存制约着农业生产中的产业化和机械化，随着机械化农业的发展，对作物种子的活力要求更加严格，这使得提高大豆种子萌发率显得十分重要。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明针对上述的问题，提供了一种促进老化大豆种子萌发的方法。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种促进老化大豆种子萌发的方法，包括以下步骤：

步骤1、种子预处理：选取自然风干后选取大小均一，颗粒饱满，无病虫害的老化的大豆种子，在室温下回干2d，备用；

步骤2、选取步骤1得到的种子，将其放入铺有双层滤纸的干净培养皿中；

步骤3、于恒温无光照条件下，在培养皿中加入己酸二乙氨基乙醇酯溶液，使种子在其中萌发；

步骤4、将经过步骤3处理并且已经萌发的大豆种子种植于土壤中，光周期同自然环境，出苗期间，定时定量喷洒适量自来水。

进一步地，步骤3中己酸二乙氨基乙醇酯溶液的浓度为100-400μm。

进一步地，步骤3中种子的萌发时间为12-24h。

进一步地，步骤4中环境温度为20-25℃。

与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：

本发明da-6对老化大豆种子萌发、及随后的幼苗光合建成具有明显的促进作用。其机理在于，通过促进油脂向糖的转化，为种子萌发提供更多能量，并增加了幼苗建成后的叶绿素含量，促进了植株的碳同化能力，最终保证了老化种子的萌发及幼苗的光合建成。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明经过老化处理与未经过老化处理的大豆种子在萌发过程中施加da-6对其萌发率的影响；其中，a、b和c为种子萌发过程中60h时表型图片；d为大豆种子在不同的处理条件下的萌发情况统计图；a为未老化为正常大豆种子在清水条件下萌发；b：老化+水为老化处理后的在0μm与200μm的da-6条件下萌发；c：老化+da-6为老化处理后的在0μm与200μm的da-6条件下萌发；

图2是本发明正常的大豆种子在不同浓度的da-6条件下萌发情况；其中，ck是正常的大豆种子在清水中萌发；200μm是正常的大豆种子在200μm的da-6中萌发；

图3是本发明经过老化与未经过的大豆种子萌发70h后的胚根长度及其鲜重，a为大豆种子萌发后的胚根长度；b为胚根的鲜重；c为胚根的干重；未老化为正常大豆种子在清水条件下萌发；老化+水与老化+da-6均为老化处理后的在0μm与200μm的da-6条件下萌发；

图4是本发明经过老化与未经过处理的大豆种子幼苗建成能力；其中，a为已经萌发的大豆种子移栽到土壤后20d后幼苗建成率；b为大豆种子移栽后20d幼苗建成统计；c为幼苗建成后株高表型图；d为幼苗建成后株高统计数据，bar＝5cm；未老化为正常大豆种子在清水条件下萌发；老化+水与老化+da-6均为老化处理后的在0μm与200μm的da-6条件下萌发；

图5是本发明不同处理对大豆种子幼苗建成以后性状的影响；其中，a为不同处理条件下，大豆幼苗建成后干重的差异；b为不同处理下萌发的种子幼苗建成后叶绿素含量的差异；未老化为正常大豆种子在清水条件下萌发；老化+水与老化+da-6均为老化处理后的在0μm与200μm的da-6条件下萌发；

图6是本发明种子吸涨不同时间糖含量的变化；a种子在吸涨期间不同处理条件下蔗糖含量的变化；b种子吸涨期间不同处理条件下果糖含量的变化；c种子吸涨期间不同处理下还原糖含量的变化；d种子吸涨期间不同处理下可溶性总糖含量的变化；其中未老化为正常大豆种子在清水条件下萌发；老化+水与老化+da-6均为老化处理后的在0μm与200μm的da-6条件下萌发；每个时刻的三个柱状图自左向右依次为未老化、老化+水和老化+da-6；

图7是本发明种子在吸涨过程中蔗糖转化酶的活力变化；其中老化后的大豆种子其蔗糖转化酶大多数较未老化的大豆种子低，其中老化后在清水中与在da-6中萌发有极显著的差异，其中未老化为正常大豆种子在清水条件下萌发；老化+水与老化+da-6均为老化处理后的在0μm与200μm的da-6条件下萌发；每个时刻的三个柱状图自左向右依次为未老化、老化+水和老化+da-6；

图8是本发明种子再吸涨过程中脂肪酸含量的变化；其中b是gc-ms检测到大豆种子中所有脂肪酸的总量，c为检测到的不饱和脂肪酸的总量；d为检测到的饱和脂肪酸的总量；

图9是本发明中种子吸涨过程中一些基因的表达量，其中a-d为种子萌发过程中，由脂肪酸的分解向糖类物质转化过程中的一些关键基因；e为种子萌发过程中的脂氧合酶的表达量检测。

具体实施方式

以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

本发明公开了一种促进老化大豆种子萌发的方法，包括以下步骤：

步骤1、种子预处理：选取自然风干后选取大小均一，颗粒饱满，无病虫害的老化的大豆种子(储存年限在1年以上且种皮无霉变没有完全丧失萌发能力)，在室温下回干2d，备用；

步骤2、选取步骤1得到的种子，将其放入铺有双层滤纸的干净培养皿中；

步骤3、于恒温无光照条件下，在培养皿中加入浓度为100-400μm的己酸二乙氨基乙醇酯(da-6)溶液，使种子在其中萌发12-24h；

步骤4、将经过步骤3处理并且已经萌发的大豆种子种植于土壤中，环境温度为20-25℃，光周期同自然环境，出苗期间，定时定量喷洒适量自来水。

实施例1

一种促进老化大豆种子萌发的方法，包括以下步骤：

步骤1、种子预处理：选取自然风干后选取大小均一，颗粒饱满，无病虫害的老化的大豆种子，在室温下回干2d，备用；

步骤2、选取步骤1得到的种子，将其放入铺有双层滤纸的干净培养皿中；

步骤3、于恒温无光照条件下，在培养皿中加入浓度为250μm的己酸二乙氨基乙醇酯(da-6)溶液，使种子在其中萌发18h；

步骤4、将经过步骤3处理并且已经萌发的大豆种子种植于土壤中，环境温度为22℃，光周期同自然环境，出苗期间，定时定量喷洒适量自来水。

实施例2

一种促进老化大豆种子萌发的方法，包括以下步骤：

步骤1、种子预处理：选取自然风干后选取大小均一，颗粒饱满，无病虫害的老化的大豆种子，在室温下回干2d，备用；

步骤2、选取步骤1得到的种子，将其放入铺有双层滤纸的干净培养皿中；

步骤3、于恒温无光照条件下，在培养皿中加入浓度为100μm的己酸二乙氨基乙醇酯(da-6)溶液，使种子在其中萌发24h；

步骤4、将经过步骤3处理并且已经萌发的大豆种子种植于土壤中，环境温度为20℃，光周期同自然环境，出苗期间，定时定量喷洒适量自来水。

实施例3

一种促进老化大豆种子萌发的方法，包括以下步骤：

步骤1、种子预处理：选取自然风干后选取大小均一，颗粒饱满，无病虫害的老化的大豆种子，在室温下回干2d，备用；

步骤2、选取步骤1得到的种子，将其放入铺有双层滤纸的干净培养皿中；

步骤3、于恒温无光照条件下，在培养皿中加入浓度为400μm的己酸二乙氨基乙醇酯(da-6)溶液，使种子在其中萌发12h；

步骤4、将经过步骤3处理并且已经萌发的大豆种子种植于土壤中，环境温度为25℃，光周期同自然环境，出苗期间，定时定量喷洒适量自来水。

下面结合具体的实验来说明本发明的技术效果：

1材料与方法

1.1实验材料

实验大豆品种为“南豆12”，种子由四川农业大学“四川省作物带状复合种植工程技术研究中心”提供。

1.2实验处理

将正常的大豆种子进行人工老化处理或者选用自然老化的大豆种子，之后在室温下回干2d后对其进行萌发。

取直径9cm的培养皿，铺两层中速定性滤纸，分别加入经过和未经过老化处理的“南豆12”大豆种子20粒，在经过老化处理的皿中分别加入浓度为100、200、300、400μm的da-6溶液20ml，在未经过老化处理的培养皿中分别加入超纯水、200、400μm的da-6溶液20ml，每个实验设置3次实验重复及生物学重复，将其置于25℃恒温箱(型号：sanyoversatileenvironmentaltestchambermlr-350h)里黑暗萌发2天，在此期间每12h统计萌发率，以确定其表型。在0h、12h、24h、36h、48h为时间点测定糖含量。

1.3测定指标及方法

1.3.1本实验中人工加速老化处理采用(58±1℃)热水加速人工老化法或者选用自然老化的大豆种子，将种子置于(58±1℃)的恒温水浴中处理20min后自然风干，待种子干至初始状态时进行萌发实验。

1.3.2萌发率统计种子在恒温培养箱中黑暗条件下萌发，采用绿色的灯作为光源，在不同时间点统计萌发，将光照对种子萌发的影响降到最低，以种子萌芽长度大于2mm作为萌发的判定标准。胚根长度利用imagej软件测量，重量用电子天平称量。

1.3.3幼苗建成统计将已经萌发且长势一致的种子播种到土壤中，在相同大小的盆中播种数量相同，统计在播种后第7d统计其正常出土，并生长的幼苗数量。在第20d测定株高；将植株从土壤中移出，用清水冲洗干净根际泥土后用吸水纸吸干，电子天平称量鲜重。经过上述处理的幼苗在105℃条件下杀青15min，后调温至75℃烘干至恒重后称其干重，分别称整株植物的单株生物量。

1.3.4叶绿素含量测定选取各处理下的幼苗各3株，取植株地上部分相同叶位完全展开的叶片，参照舒展(舒展，张晓素，陈娟，等.叶绿素含量测定的简化[j].植物生理学通讯,2010,(04):399-402.)等的方法，采用80％丙酮浸提24h，测定叶绿素含量。

1.3.4不同糖含量测定在种子萌发期间不同的时间段(0h、12h、24h、36h、48h)进行取样，用吸水纸吸干表面的水分后装入纸袋。在105℃下杀青15min，75℃烘干至恒重后，在干净的研钵中研磨成粉末，装入eppendorf管备用。可溶性糖含量采用蒽酮比色法，还原糖采用dns测定，蔗糖、及果糖的含量用间苯二酚法测定(阮松林，薛庆中，王清华.种子引发对杂交水稻幼苗耐盐性的生理效应[j].中国农业科学,2003,36(4):463-468.)。

1.3.5蔗糖转化酶活性的测定在种子萌发期间不同的时间段(0h、12h、24h、36h、48h)进行取样，在液氮中速冻后放入-80℃保存。测定方法采用3,5二硝基水杨酸(dns)法。

1.3.6脂肪酸含量的测定在种子萌发期间不同的时间段(0h、12h、24h、36h、48h)进行取样，在液氮中速冻后放入-80℃保存。利用正己烷超声提取大豆籽粒中的脂肪酸，上海甄淮生物脂肪酸混合标品，岛津gc-ms2010分析其成分及其含量。

1.3.7相关基因表达分析利用热酚法提取大豆总rna，1％琼脂糖凝胶电泳测定rna完整性，nanodropplus测定浓度和纯度，宝生物mlv酶进行cdna第一链合成，具体操作参照其说明书。引物设计利用大豆phytozomev10.3数据库分析，ncbi序列分析得到相关大豆基因引物(表1)。每个材料3次重复，采用2^-△△ct，spss进行显著性分析，microsoftexcel2013作图。

表1相关大豆基因引物

1.4数据统计分析

实验数据采用microsoftexcel2013软件进行整理，方差分析采用spss19.0统计分析软件，平均值之间的比较采用单因素方差分析法(one-wayanova)；不同处理之间的显著性采用duncan多重比较检验，长度测量采用imagej测定。

2结果与分析

2.1da-6对老化大豆种子萌发的影响

经过老化的种子在不同的da-6浓度下萌发，由(图1-a、b)可以看出，在200μm的da-6浓度下，其对老化后的大豆种子萌发率有显著地提高作用。综合上述结果，在后续的实验中选取了对老化种子萌发过程中影响较大的浓度200μm。

da-6对于老化的种子萌发有一定的促进作用，当其作用于正常的种子时，并没有发现有提升萌发率作用，只是在种子萌发的过程中，对其萌发速率有轻微的影响，但是最终的萌发率与对照基本达到一致的水平(图2)。由此可见da-6只是专一的提高了老化的大豆萌发率。

当经过老化与未经过老化的大豆种子在不同的处理条件下萌发以后(70h)后利用imagej软件辅助测量其胚根长度，并用电子天平称其重量，结果显示，经过老化处理的大豆种子在da-6中萌发后，其胚根长度和重量较老化后在清水中萌发有显著的提高(图3)。

2.2da-6对老化种子萌发后幼苗建成和光合建成的影响

老化后的大豆种子在da-6条件下萌发，2d后将长势一致的种子移栽在土壤中，可以看出经过老化处理的大豆种子在da-6条件下萌发，其幼苗建成能力显著地高于在清水条件下萌发的幼苗建成率(高达91％)，与ck(未经过老化处理在清水条件下萌发的大豆种子)幼苗建成率相当(图4a、b)。当对照生长到第一片复叶完全展开时，测量其株高、鲜重、干重，由图4c、d可以看出老化后的种子在200μm浓度的da-6条件下，株高得到极显著的提高，基本回复到ck水平。

对光形态建成后的幼苗，进行进一步的生物学性状的分析，分别称其单株的干重，可以发现经过老化处理后的种子形成的幼苗干重较ck低，但是老化后经过da-6萌发的种子形成的幼苗干重较没有da-6处理的有极显著(p<0.01)的提高(图5a)。

同时，老化处理后的种子在da-6中萌发和在清水中萌发，在da-6中萌发的种子其幼苗建成后叶绿素含量与ck相比有显著地(p<0.05)提高，并且高于未老化的种子(图5b)。说明使用da-6可以使叶绿素含量增加，表明da-6对提高老化大豆种子的幼苗建成有正向的调控作用，由此表明da-6在一定程度上促进了生物量的积累。

2.3da-6促进老化种子萌发过程中糖含量的影响

虽然老化处理后的种子在萌发的过程中，糖含量较对照ck有显著或极显著的降低，但是经过da-6处理后的种子，其蔗糖含量较未经过da-6处理的高(图6a)，但是总体的变化趋势显示出先升高后降低的趋势。

与蔗糖一样，可溶性糖也表现出先升高后降低的趋势，但是在不同的时间点，经过老化处理后的含量总是较未经过老化处理的含量低，在12h、24h时经过da-6处理的种子中可溶性糖含量高于未经过da-6处理的种子(图6b)。

2.4da-6影响种子萌发过程中的酶活性

种子在萌发的过程中，糖类是其能量供应的重要成分，蔗糖水解酶是植物组织中将其主要的同化产物蔗糖不可逆的转化为葡萄糖和果糖，为植物提供可利用的六碳糖，为呼吸作用偶联的氧化磷酸化产生能量，与植物的生长有着密切的关系，在一定程度上能反映其生长状况。

在本实验中，经过老化处理的大豆种子在da-6和水中萌发，其萌发率有较显著的差异，其内部的蔗糖转化酶活性也发生了相应的变化。数据显示，在老化处理后，清水中萌发的种子期蔗糖转化没得活性显著地低于老化后在da-6中萌发的种子。在da-6中萌发的种子其内部的蔗糖转化酶活性与正常的打偶种子萌发过程中的蔗糖转化酶活性基本达到了相当的水平(图7)。

2.5da-6对老化大豆种子萌发过程中脂肪酸含量的影响

大豆作为重要的油料作物，其内部储存着大量不饱和的脂肪酸，而种子在萌发的过程中，脂肪酸发生分解并转变为可以为植物生长发育提供能量的糖类，同时在种子储存的过程中，脂肪酸会发生一定程度上的酸败，最终转变为脂肪酸的过氧化物或丙二醛(mda)，影响种子的活力及其萌发率。

本发明数据表明，经过老化处理的大豆种子在种子萌发的过程中，无论是脂肪酸总量、多不饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸总体均表现出老化+da-6高于老化+水(图8)，使得脂肪酸的储备量更大，为种子的萌发提供更为充分的能量。

2.6da-6对老化大豆种子中与代谢相关的基因表达量的影响

在种子萌发的过程中，种子内部的储存性物质发生分解代谢，为其提供萌发所必须的能量。在种子萌发的过程中，乙酰辅酶a是将三大营养物质代谢通路连接起来，进入三羧酸循环和氧化磷酸化，为其提供能量。经过人工老化处理的大豆种子在其萌发过程中，在da-6中萌发的种子调控乙酰辅酶a氧化酶(acx2)的基因表达量较在水中萌发的有显著地上调作用，同时，参与能量代谢的相关基因sdp1、sdp6表达量较清水均有上调。在糖异生途径中，调控催化草酰乙酸形成磷酸烯醇式丙酮酸和二氧化碳的酶的基因(pck1)的表达量也表现出上调趋势。相反，脂氧合酶基因(lox3)的表达量在老化后da-6中萌发的种子中表现下调，使脂肪酸的氧化或过氧化反应降低(图9)；即：在种子萌发的过程中，添加da-6可以使得脂肪分解向糖过程中的关键基因的表达量上调，调控脂肪酸氧化分解的lox3基因的表达量下调，使得脂肪酸的分解大多数像糖类物质转化，为种子的萌发提供能量。

3讨论

大豆作为油料作物种子，其内部储存有大量的脂肪酸，占油脂总量的90％以上。种子在萌发的过程中，糖类作为呼吸作用的直接底物，在种子萌发的过程中有不同程度的下降。本发明表明大豆种子在老化的过程中，蔗糖、还原糖、可溶性糖含量较对照显著地(p<0.05)降低，经过老化的种子，在含有200μm的da-6溶液中萌发率得到显著(p<0.05)提高，并且其蔗糖含量较没有da-6处理的有极显著(p<0.01)的提高。这可能是由于da-6提高了脂肪酶的活性，使大豆种子中的脂肪酸分解代谢提高，加快了脂质向糖的转化，为种子萌发时的呼吸作用提供了充足的底物，保证种子萌发过程的能量供给。

对于经过老化处理后的大豆种子，幼苗建成能力相对于对照有明显的下降，但是。老化处理后的种子经过在da-6中萌发后的幼苗建成率显著地(p<0.05)高于未经过da-6处理的水平，并且其建成的幼苗干重较未经过da-6处理的干重有极显著(p<0.01)的提高。结合叶绿素含量的测定结果，da-6处理可以显著地(p<0.05)提高叶绿素含量。因此其干重的增加可能是由于da-6通过提高叶绿素含量进而提高了作物碳同化能力，使得作物的光合作用增强进而增加了干物质的积累。

本发明筛选出了较为理想的da-6浓度，以提高老化“南豆12”大豆种子的萌发能力、幼苗建成和光合建成能力。经过老化的种子脂质的过氧化水平增加，丙二醛(mda)含量上升，脂肪酶活力下降，糖异生能力减弱。结合上述数据，可以看到da-6可能通过增强了脂肪酶的性，加快了脂质向糖类物质的转化，进而使蔗糖等可溶性糖的含量增加，为种子的萌发提供直接的能量。当种子萌发后，da-6促进了叶绿素的生物合成，使幼苗中的叶绿素含量增加，进而可能增强了幼苗的光合作用及光能的利用率、碳同化能力。导致植株的干重增加，生物量积累明显升高，为植株后期的生长奠定了基础。

上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

序列表

<110>四川农业大学

<120>一种促进老化大豆种子萌发的方法

<130>2017

<160>12

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