一种利用水稻基因组学技术快速精准选育三系水稻不育系的方法与流程

本发明涉及的是水稻育种技术领域，特别是涉及一种利用水稻基因组学技术快速精准选育三系水稻不育系的方法。

背景技术：

目前杂交水稻育种实践证明快速、精准选育高配合力、米质优、多抗、异交习性好的不育系，是育成强优组合的关键。多年来，中国三系杂交水稻因其高产稳产、制种生产相对安全，在中国及世界得到广泛应用，对解决粮食安全问题起到至关重要的作用。然而三系水稻不育系育种因不育系为质核互作不育的遗传性状的条件限制，选育新的质源的保持系较为困难，目前主要采用常规技术，多数是进行保持系之间的杂交，虽然取得很大进展，但仍未能达到将现有的水稻恢复系及常规稻等新的优良基因及新材料在三系保持系和不育系上进行运用，突破的优质多抗的三系杂交稻的亲本及组合市场严重缺乏，制约了三系杂交稻的进一步快速发展，不能满足市场对优质多抗杂交稻的发展需要。三系杂交稻育种存在的主要问题有以下几点：1、不育系育种年限较长；2、质核互作型不育，保持基因主要来源于早稻品种，国内多数新保持系选育为保持系和保持系杂交，品质相对较差和遗传距离和血缘关系较近；3、与优质抗病恢复系及常规水稻等杂交选育过程中恢复基因剔除不干净，难以选育成功；4、已应用于生产的不育系一般只具备1-2个优异性状，具有综合优异性状的不育系欠缺；5、需要新的育种手段和方法。

随着农业供给侧结构的改革，突出稻米品质的重要性，而杂交水稻的稻米品质与其不育系有密切关系，因此急需加强优质三系不育系的遗传改良；另一方面，在三系不育系的改良过程中，要使不育系的雄性不育性性状得到保持，对保持系的要求非常严格，在育种实践中由于恢复基因的干扰和保持系中保持基因是否存在等问题，对保持系的改良比较困难。

三系水稻不育系要实现目标克服上述问题，必须进行常规育种技术与现代高新技术相结合。现代生物技术的迅速发展特别是水稻全基因组测序的完成，使水稻不育系育种能从基因水平上进行操作。为快速、精准选育聚合综合优异性状的三系水稻不育系和保持系奠定了坚实的基础。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种利用水稻基因组学技术快速精准选育三系水稻不育系的方法，旨在创新育种方法和手段，解决现有选育三系不育系的年限较长、遗传距离较近、恢复基因剔除不干净、综合优良性状聚合不够等问题。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了一种利用水稻基因组学技术快速精准选育三系水稻不育系的方法，包括如下步骤：

(1)以待改良的水稻保持系为母本1，以含有目标性状的水稻恢复系为父本1，进行常规有性杂交后，与父本1回交一次，获得的BC1F1代再自交一次，获得BC1F2代分离群体，其中所述的目标性状指的是母本1所没有的待改良的优良性状；

(2)对步骤(1)的BC1F2代分离群体进行田间单株选择，择优选择含有父母本双亲优良性状的单株进行混收，并种植BC1F2代混选株系群体种子，得到BC1F3群体；

(3)以水稻恢复系所含的育性恢复基因作为分子标记筛选基因，对步骤(2)的BC1F3群体进行分子标记筛选，选择不含所述育性恢复基因的单株套袋并自交，同时利用二代全基因组测序技术对自交单株及父母本1进行全基因组测序和基因型分析，筛选含有双亲优良基因、遗传背景更接近父本1、田间农艺性状优良且柱头外露率高的稳定优良单株进行收种；

(4)以步骤(3)的稳定优良单株BC1F3为父本2，以待改良的水稻保持系对应的野败型或红莲型细胞质雄性不育系为母本2，进行杂交，获得F1单株，筛选田间农艺性状优良、柱头外露率高的F1单株，利用二代全基因组测序技术对筛选的F1单株及其父母本进行全基因组测序及基因型分析，筛选全基因组序列与其父本更接近、且花粉镜检100％不育的单株与父本2继续回交；

(5)重复步骤(4)，再回交4代以上，即可育成稳定的优良不育系和对应的保持系。

进一步地，所述步骤(2)还包括对BC1F3群体进行田间农艺性状筛选，择优选择含有父母本双亲优良性状、且柱头外露率高的单株进入下一步分子标记筛选步骤。

进一步地，所述目标性状包括株叶形态较好、优质、高产、抗病、高异交率及配合力高等性状中的一种或多种优良性状，但不限于此。

本发明相比现有技术具有以下优点：

1)有效剔除育性恢复基因：在选育过程中，采用分子标记辅助选择，将不含和含有育性恢复基因的保持系有效的区分开，确保育成不育系不育度的稳定性，而常规的方法是很难实现的。

2)有效扩大三系保持系和不育系的遗传背景和遗传距离，利于创制新型三系不育系新质源。

3)快速精准：利用基于水稻全基因组测序的基因分型技术进行遗传背景选择，从而缩短了保持系的改良世代和不育系的回交世代，仅4-5年就能育成稳定的不育系，较常规育种减少2-3年时间，大大加快了育种速度，减少育种的盲目性。

3)聚合优良性状：田间农艺性状观察结合全基因组测序，筛选聚合双亲优良性状的单株。

附图说明

图1：实施例1的技术路线图；

图2：实施例2的技术路线图。

具体实施方式

下面通过两组具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明，其中涉及的方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品，所用的种质资源，均为市售常规品种，可直接从安徽荃银高科种业股份有限公司购买或从国家种质库获得。

实施例1

本实施例提供了一种对“中9A”进行改良的方法，具体为利用水稻基因组学技术快速精准选育三系水稻不育系，包括以下步骤：

(1)杂交

以“中9A”对应的高异交率的“中9B”保持系为母本1，以另一个农艺性状优良、含抗稻瘟病Pi2基因、品质优良的恢复系“YR0822”为父本1，进行常规有性杂交后，与父本1回交一次，获得的BC1F1代再自交一次，获得BC1F2代分离群体。

(2)田间农艺性状筛选

对BC1F2代分离群体进行田间农艺性状筛选，选择株叶形态较好的优良单株139个，在这139个优良单株中继续筛选，择优选择含有父母本1双亲优良性状的单株，共计118个，将筛选的118个单株的种子进行混收，并种植BC1F2代混选株系群体种子，得到BC1F3群体，共计3000株。

对BC1F3群体继续进行田间农艺性状筛选，选择株叶形态较好、并择优选择含有父母本1双亲优良性状、且柱头外露率高的单株，共计180个。

(3)分子标记筛选和全基因组测序

通过国家水稻数据中心查询恢复系“YR0822”的育性恢复基因为RF3，以RF3基因为分子标记基因，以RF3基因标记筛选引物RM10338为特异性扩增引物，对上述步骤(2)筛选获得的180个单株进行分子标记筛选，步骤包括：

1)DNA制备：对上述180个F3单株进行植株编号，利用CTAB法提取基因组DNA；

2)PCR反应：

PCR反应体系为20μl，含：2mM Mg²⁺的10×Buffer 2.0ul，2.5mM dNTPs 2.0ul，1U/μl Taq酶0.5ul，2μM正反引物各0.5ul，100ng左右基因组DNA 2ul，ddH2O 12.5ul；

RM10338引物序列为：

正向：GTGAAGTTTCCCTCGGAATCACG

反向：AGCTAGGGAGAAGAAGCGGAAGC

反应条件为94℃预变性3min后，按94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min循环35次，72℃延伸5min；

扩增后的PCR产物利用8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测60min(250V)，电泳结果在胶片观测灯上观察、拍照。

3)结果统计：记录PCR产物条带，剔除含纯合及杂合育性恢复基因的单株，筛选得到不含恢复基因的单株。结果：有137份含有恢复基因的单株被剔除，筛选到43份不含育性恢复基因的单株。

利用二代全基因组测序技术，对双亲“中9B”、“YR0822”和上述筛选获得的43个单株的全基因组进行测序，步骤包括：

i)对“中9B”、“YR0822”和上述筛选获得的43个单株进行编号，在苗期取对应的植株叶片，利用Qiaqen公司的N96新型植物基因组DNA提取试剂盒提取植株叶片基因组DNA；

ii)将基因组DNA打碎，用DNA聚合酶修复后连上接头，多个样品混合进行电泳，并回收300-400bp的片段，建立PE400测序文库；

iii)利用Illumina Hiseq X10测序平台，用2×150bp双末端测序法进行全基因组重测序，亲本测序深度约50×、后代单株测序深度约0.1×，约在一周左右时间内便可完成测序工作。

通过将子代单株和双亲进行全基因组序列比对和遗传变异分析鉴定，获得子代单株的精细基因型图谱，通过子代单株的精细基因型图谱，分析优异基因位点的基因型，选择优异基因杂合程度低、含双亲优异基因(包括抗稻瘟病Pi2基因)且遗传背景更接近“YR0822”的单株4个，这4个单株为田间株叶形态较好、柱头外露率高、不含育性恢复基因、含有抗稻瘟病Pi2基因且品质较好的优良稳定单株。

(4)不育系培育

以“中9A”为母本2，分别与步骤(3)筛选获得的4个优良稳定单株(父本2)进行杂交，获得F1单株，筛选田间表现异交率高、柱头外露率高的F1单株，利用二代全基因组测序技术对筛选的F1单株及其父母本(父母本2)进行全基因组测序及基因型分析，具体测序和分析方法同步骤(3)，筛选全基因组序列与父本2更接近且花粉镜检100％不育的单株与父本2继续回交；

(5)连续回交

重复步骤(4)，继续回交5次，最后进行花粉镜检和套袋检测，4个单株(父本2)转育的不育系的不育度都达到100％，得到稳定的优良不育系(命名为荃908A)和对应的保持系(命名为荃908B)。

实施例2

本实施例提供了一种对红莲型不育系“粤泰A”进行改良的方法，具体为利用水稻基因组学技术快速精准选育三系水稻不育系，包括以下步骤：

(1)杂交

以“粤泰A”对应的“粤泰B”保持系为母本1，以另一个农艺性状优良、含抗稻瘟病Pi2基因、品质优的恢复系“五山丝苗”为父本1，母本1父本1杂交后与父本1回交一次，获得F2代分离群体，共计1297株；

(2)田间农艺性状筛选

对F2代分离群体进行田间农艺性状筛选，选择株叶形态较好的优良单株131个，在这131个优良单株中继续筛选，选择株叶形态符合父本1的优良单株，共计124个，将筛选的124个单株的种子进行混收，并种植F2代混选株系群体种子，得到F3群体。对F3群体继续进行田间农艺性状筛选，筛选株叶形态符合父本1性状且柱头外露率高的单株，共计173个；

(3)分子标记筛选和全基因组测序

通过国家水稻数据中心查询恢复系“五山丝苗”的育性恢复基因为RF3，以RF3基因为分子标记基因，以RF3基因标记筛选引物RM10338为特异性扩增引物，对上述步骤(2)筛选获得的173个单株进行分子标记筛选，步骤包括：

1)DNA制备：对上述173个F3单株进行植株编号，利用CTAB法提取基因组DNA；

2)PCR反应：

PCR反应体系为20μl，含：2mM Mg²⁺的10×Buffer 2.0ul，2.5mM dNTPs 2.0ul，1U/μl Taq酶0.5ul，2μM正反引物各0.5ul，100ng左右基因组DNA2ul，ddH2O 12.5ul；

RM10338引物序列为：

正向：GTGAAGTTTCCCTCGGAATCACG

反向：AGCTAGGGAGAAGAAGCGGAAGC

反应条件为94℃预变性3min后，按94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min循环35次，72℃延伸5min；

扩增后的PCR产物利用8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测60min(250V)，电泳结果在胶片观测灯上观察、拍照。

3)结果统计：记录PCR产物条带，剔除含纯合及杂合育性恢复基因的单株，筛选得到不含恢复基因的单株。结果：有134份含有恢复基因的单株被剔除，筛选到39份不含育性恢复基因的单株。

利用二代全基因组测序技术，对双亲“粤泰B”、“五山丝苗”和上述筛选获得的39个单株的全基因组进行测序，步骤同实施例1的二代全基因组测序技术步骤，在此不做重复描述。通过将子代单株和双亲进行全基因组序列比对和遗传变异分析鉴定，获得子代单株的精细基因型图谱，分析子代单株的精细基因型图谱中优良基因位点的基因型，选择优异基因杂合程度低、含双亲优异基因(包括抗稻瘟病Pi2基因)且遗传背景更接近“五山丝苗”的单株3个，这3个单株为柱头外露率高、不含育性恢复基因、含有抗稻瘟病Pi2基因的优良稳定单株。

(4)不育系培育

以“粤泰A”为母本2，分别与步骤(3)筛选获得的3个优良稳定单株(父本2)进行杂交，获得F1’单株，筛选田间表现异交率高、柱头外露率高的F1’单株，利用二代全基因组测序技术对筛选的F1’单株及其亲本(父母本2)进行全基因组测序及基因型分析，具体测序和分析方法同步骤(3)，筛选全基因组序列与父本2更接近且花粉镜检100％不育的单株与父本2继续回交；

(5)连续回交

重复步骤(4)，回交4次，最后进行花粉镜检和套袋检测，3个单株(父本2)转育的不育系的不育度都达到100％，得到稳定的优良不育系(命名为荃泰1A)和对应的保持系(命名为荃泰1B)。

以上为本发明一种详细的实施方式和具体的操作过程，是以本发明技术方案为前提下进行实施，但本发明的保护范围不限于上述的实施例。