本发明涉及组织培养，尤其涉及一种用于树莓组织培养的培养基及其配制方法和应用。
背景技术：
树莓是一种高产出的经济林木，现实需要大面积种植，因此，需要对树莓苗木进行组培快繁。现有的树莓苗木组培繁殖方法是在实验室进行组织培养、快速繁殖，形成生根的快繁苗木，将进行组织培养的试管盖打开，进行室内瓶内炼苗2-3天，再在温室或网室把试管苗木移栽到营养钵内的基质中30天以上，并用遮阴网遮阴、保湿，成活后的苗木再移栽到苗圃田，再进行短时间的遮阴保湿，成活生长为所需的经济苗木。
现在常用的树莓培养基配方一般为ms培养基+1mg/l6-ba+0.1mg/lnaa+30g糖/l+7g琼脂/l，ph为5.7。每升培养基里有：大量元素：1900mg硝酸钾，1650mg硝酸铵，370mg七水合硫酸镁，170mg磷酸二氢钾，440mg二水合氯化钙；铁盐:37.3mg乙二胺四乙酸二钠，27.8mg七水合硫酸亚铁；微量元素：22.3mg四水合硫酸锰，8.6mg七水合硫酸锌，6.2mg硼酸，0.83mg碘化钾，0.25mg七水合钼酸钠，0.025mg五水合硫酸铜，0.025mg六水合氯化钴；有机元素：2mg甘氨酸，0.5mg维生素b6，0.1mg维生素b1，0.5mg烟酸，100mg肌醇；激素：1mg6-苄氨基嘌呤，0.1mg萘乙酸。此配方的缺点在于树莓组培苗在生长期间，幼苗叶片为淡绿色，经过测量，叶绿素合成明显不足，幼苗柔弱无力，自身光合作用效率极低，不利于后续组培苗驯化繁苗等操作，此配方后期苗木驯化的成活率仅为60％左右，使得树莓组培苗生产供应方蒙受巨大损失。
技术实现要素：
发明目的：本发明提供了一种用于树莓组织培养的增殖培养基，旨在解决树莓组培苗在培养基生长中，叶片颜色偏淡，叶绿素合成不足，种苗柔弱无力，光合作用效率低下的问题，提高树莓组培苗驯化过程中的成活率。
技术方案：本发明所述的用于树莓组织培养的增殖培养基，包括基础培养基，所述的基础培养基为改良ms培养基，该改良ms培养基为调整ms培养基中七水合硫酸镁、乙二胺四乙酸二钠、七水合硫酸亚铁的浓度得到，调整后，七水合硫酸镁的浓度为720～760mg/l，乙二胺四乙酸二钠浓度为70～80mg/l，七水合硫酸亚铁的浓度为52～57mg/l。
优选的，七水合硫酸镁的浓度为735～745mg/l，乙二胺四乙酸二钠浓度为73～76mg/l，七水合硫酸亚铁的浓度为54～56mg/l。更优选的，七水合硫酸镁的浓度为740mg/l，乙二胺四乙酸二钠浓度为74.6mg/l，七水合硫酸亚铁的浓度为55.6mg/l
具体的，所述的用于树莓组织培养的增殖培养基的组成为：基础培养基+0.8～1.2mg/l6-苄氨基嘌呤+0.1～0.2mg/l萘乙酸+30～32g/l糖+6.5～7.5g/l琼脂。
本发明还提供了一种用于树莓组织培养的增殖培养基的配制方法，包括：
(1)配制所述的改良ms培养基；
(2)改良ms培养基中加入配方量的糖、琼脂、6-苄氨基嘌呤和萘乙酸后灭菌。
本发明还提供了所述的培养基在树莓组织培养中的应用。
所述的应用包括：将树莓无菌苗接种于所述的培养基上进行培养，培养条件为：温度23～27℃，光照强度2800～3000lux，每日光照时间为16～18小时。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明对ms培养基的配方进行改良，将七水合硫酸镁，乙二胺四乙酸二钠，四水合硫酸亚铁的使用量进行适当改进，使得树莓在幼苗期的生长过程中，叶片颜色更加健康，叶绿素合成明显加倍，光合作用效率明显增加，幼苗生长的更加健康粗壮，这大大提高了后期树莓组培苗的移栽，驯化的成活率，最高可达到95％。此改进配方也极大的控制了污染率，使污染率降到了1.12％以下。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
实施例1
1、本实施例培养基的配方为：
改进ms培养基+1mg/l6-ba+0.1mg/lnaa+31g/l糖+7g/l琼脂，ph为5.7。每一升培养基的具体组成为：
大量元素：1900mg硝酸钾，1650mg硝酸铵，720mg七水合硫酸镁(七水硫酸镁)，170mg磷酸二氢钾，440mg二水合氯化钙；
铁盐:71mg乙二胺四乙酸二钠，52mg七水合硫酸亚铁；
微量元素：22.3mg四水合硫酸锰，8.6mg七水合硫酸锌，6.2mg硼酸，0.83mg碘化钾，0.25mg七水合钼酸钠，0.025mg五水合硫酸铜，0.025mg六水合氯化钴；
有机元素：2mg甘氨酸，0.5mg维生素b6，0.1mg维生素b1，0.5mg烟酸，100mg肌醇；
激素：1mg6-苄氨基嘌呤，0.1mg萘乙酸；
其他：琼脂7g，蔗糖31g。
2、培养基的配置包括以下步骤：
(1)配制改良ms培养基：
(11)50倍大量元素母液的配制：分别称取82.5g硝酸铵、95g硝酸钾、36g七水合硫酸镁，然后用蒸馏水溶解后定容至1000ml，配成母液ⅰ；
称取22g二水氯化钙，用蒸馏水溶解后定容至1000ml，配成母液ⅱ；
称取8.5g磷酸二氢钾，用蒸馏水溶解后定容至1000ml，配成母液ⅲ；
使用时配制每升培养基取母液ⅰ，母液ⅱ，母液ⅲ各20ml；
(12)100倍的微量元素母液的配制：称取2.23g硫酸锰，0.86g硫酸锌，0.0025g硫酸铜，0.025g钼酸钠，0.62g硼酸，0.0025g氯化钴，0.083g碘化钾用蒸馏水溶解后定容至1000ml，配成母液ⅳ，使用时配制每升培养基取10ml母液ⅳ；
(13)100倍的edta-铁盐母液的配制：称取7.1g乙二胺四乙酸二钠，加200ml蒸馏水进行溶解，再称取5.2g硫酸亚铁加入溶解，溶解时需要用电热炉加热，当溶液呈浅棕色透明液体时，停止加热，加蒸馏水定容至1000ml，配成母液ⅴ，使用时配制每升培养基取10ml母液ⅴ；
(14)100倍的有机成分母液的配制：称取0.05g烟酸，0.01g盐酸硫胺素，0.05g盐酸吡哆醇，10g肌醇，0.2g甘氨酸，用蒸馏水溶解后混合定容至1000ml，配成母液ⅵ，使用时配制每升培养基取10ml母液ⅵ；
(2)激素母液的配制：称取50mgnaa，先用5ml体积浓度95％的酒精溶解，然后加水定容至50ml，配成1mg·ml-1的naa母液，使用时配制每升培养基取0.1mlnaa母液；称取50mg6-ba，先用5ml0.1mol·l-1naoh溶解，然后加水定容至50ml，配成1mg·ml-1的6-ba母液，使用时配制每升培养基取1ml6-ba母液；
(3)按上述步骤(11)至步骤(14)中配制每升培养基的用量加入后，再加入琼脂7g，蔗糖31g，6-ba母液1ml，naa母液0.1ml，加热溶解后定容至1l，用0.lmol·l-1盐酸或氢氧化钠调ph值至5.7，再分装培养基，灭菌。
3、将原保存的树莓无菌苗在超净台上接种至本实施例配制好的灭菌的培养基上，在光照强度3000lux的条件下培养，培养条件为：温度23-27℃，每日光照时间为16小时。
在本实施例培养基上培养3-7d，明显看出树莓叶片颜色由原本的淡绿色逐渐转化为深绿色，30d内，可以观察出树莓幼苗明显变得粗壮有力，统计得到污染率为0.9％，，原配方(将本申请改良ms更换为普通ms)污染率为1.7％；后期以与在原配方中生长的树莓共同驯化炼苗，原配方下生长的组培苗成活率为59％，该配方下生长的组培苗成活率为89％。
实施例2
1、本实施例培养基的配方为：
改进ms培养基+0.8mg/l6-ba+0.15mg/lnaa+30g/l糖+6.7g/l琼脂，ph为5.7。每一升培养基的具体组成为：
大量元素：1900mg硝酸钾，1650mg硝酸铵，740mg七水合硫酸镁，170mg磷酸二氢钾，440mg二水合氯化钙；
铁盐:74.6mg乙二胺四乙酸二钠，55.6mg七水合硫酸亚铁；
微量元素：22.3mg四水合硫酸锰，8.6mg七水合硫酸锌，6.2mg硼酸，0.83mg碘化钾，0.25mg七水合钼酸钠，0.025mg五水合硫酸铜，0.025mg六水合氯化钴
有机元素：2mg甘氨酸，0.5mg维生素b6，0.1mg维生素b1，0.5mg烟酸，100mg肌醇；
激素：1mg6-苄氨基嘌呤，0.15mg萘乙酸；
其他：琼脂6.7g，蔗糖30g。
2、培养基的配置包括以下步骤：
(1)配制改良ms培养基：
(11)50倍大量元素母液的配制：分别称取82.5g硝酸铵、95g硝酸钾、37g七水合硫酸镁，然后用蒸馏水溶解后定容至1000ml，配成母液ⅰ；
称取22g二水氯化钙，用蒸馏水溶解后定容至1000ml，配成母液ⅱ；
称取8.5g磷酸二氢钾，用蒸馏水溶解后定容至1000ml，配成母液ⅲ；
使用时配制每升培养基取母液ⅰ，母液ⅱ，母液ⅲ各20ml；
(12)100倍的微量元素母液的配制：称取2.23g硫酸锰，0.86g硫酸锌，0.0025g硫酸铜，0.025g钼酸钠，0.62g硼酸，0.0025g氯化钴，0.083g碘化钾用蒸馏水溶解后定容至1000ml，配成母液ⅳ，使用时配制每升培养基取10ml母液ⅳ；
(13)100倍的edta-铁盐母液的配制：称取7.46g乙二胺四乙酸二钠，加200ml蒸馏水进行溶解，再称取5.56g硫酸亚铁加入溶解，溶解时需要用电热炉加热，当溶液呈浅棕色透明液体时，停止加热，加蒸馏水定容至1000ml，配成母液ⅴ，使用时配制每升培养基取10ml母液ⅴ；
(14)100倍的有机成分母液的配制：称取0.05g烟酸，0.01g盐酸硫胺素，0.05g盐酸吡哆醇，10g肌醇，0.2g甘氨酸，用蒸馏水溶解后混合定容至1000ml，配成母液ⅵ，使用时配制每升培养基取10ml母液ⅵ；
(2)激素母液的配制：称取50mgnaa，先用5ml体积浓度95％的酒精溶解，然后加水定容至50ml，配成1mg·ml-1的naa母液，使用时配制每升培养基取0.1mlnaa母液；称取50mg6-ba，先用5ml0.1mol·l-1naoh溶解，然后加水定容至50ml，配成1mg·ml-1的6-ba母液，使用时配制每升培养基取1ml6-ba母液；
(3)按上述步骤(11)至步骤(14)中配制每升培养基的用量加入后，再加入琼脂6.7g，蔗糖30g，6-ba母液0.8ml，naa母液0.15ml，加热溶解后定容至1l，用0.lmol·l-1盐酸或氢氧化钠调ph值至5.7，再分装培养基，灭菌
3、将原保存的树莓无菌苗在超净台上接种至本实施例配制好的灭菌的培养基上，在光照强度3000lux的条件下培养，培养条件为：温度23-27℃，每日光照时间为16小时。
在本实施例培养基上培养2-4d内明显看出树莓叶片颜色由原本的淡绿色逐渐转化为深绿色，30d内，可以观察出树莓幼苗明显变得粗壮有力，统计得到污染率为1.02％，原配方污染率为2.03％；后期以与在原配方中生长的树莓共同驯化炼苗，原配方下生长的组培苗成活率为57％，该配方下生长的组培苗成活率为95％。
实施例3
1、本实施例培养基的配方为：
改进ms培养基+0.9mg/l6-ba+0.2mg/lnaa+32g/l糖+6.5g/l琼脂，ph为5.7。每一升培养基的具体组成为：
大量元素：1900mg硝酸钾，1650mg硝酸铵，760mg七水合硫酸镁，170mg磷酸二氢钾，440mg二水合氯化钙；
铁盐:80mg乙二胺四乙酸二钠，57mg七水合硫酸亚铁；
微量元素：22.3mg四水合硫酸锰，8.6mg七水合硫酸锌，6.2mg硼酸，0.83mg碘化钾，0.25mg七水合钼酸钠，0.025mg五水合硫酸铜，0.025mg六水合氯化钴；
有机元素：2mg甘氨酸，0.5mg维生素b6，0.1mg维生素b1，0.5mg烟酸，100mg肌醇；
激素：1mg6-苄氨基嘌呤，0.2mg萘乙酸；
其他：琼脂6.5g，蔗糖32g。
2、培养基的配置包括以下步骤：
(1)配制改良ms培养基：
(11)50倍大量元素母液的配制：分别称取82.5g硝酸铵、95g硝酸钾、38g七水合硫酸镁，然后用蒸馏水溶解后定容至1000ml，配成母液ⅰ；
称取22g二水氯化钙，用蒸馏水溶解后定容至1000ml，配成母液ⅱ；
称取8.5g磷酸二氢钾，用蒸馏水溶解后定容至1000ml，配成母液ⅲ；
使用时配制每升培养基取母液ⅰ，母液ⅱ，母液ⅲ各20ml；
(12)100倍的微量元素母液的配制：称取2.23g硫酸锰，0.86g硫酸锌，0.0025g硫酸铜，0.025g钼酸钠，0.62g硼酸，0.0025g氯化钴，0.083g碘化钾用蒸馏水溶解后定容至1000ml，配成母液ⅳ，使用时配制每升培养基取10ml母液ⅳ；
(13)100倍的edta-铁盐母液的配制：称取8g乙二胺四乙酸二钠，加200ml蒸馏水进行溶解，再称取5.7g硫酸亚铁加入溶解，溶解时需要用电热炉加热，当溶液呈浅棕色透明液体时，停止加热，加蒸馏水定容至1000ml，配成母液ⅴ，使用时配制每升培养基取10ml母液ⅴ；
(14)100倍的有机成分母液的配制：称取0.05g烟酸，0.01g盐酸硫胺素，0.05g盐酸吡哆醇，10g肌醇，0.2g甘氨酸，用蒸馏水溶解后混合定容至1000ml，配成母液ⅵ，使用时配制每升培养基取10ml母液ⅵ；
(2)激素母液的配制：称取50mgnaa，先用5ml体积浓度95％的酒精溶解，然后加水定容至50ml，配成1mg·ml-1的naa母液，使用时配制每升培养基取0.1mlnaa母液；称取50mg6-ba，先用5ml0.1mol·l-1naoh溶解，然后加水定容至50ml，配成1mg·ml-1的6-ba母液，使用时配制每升培养基取1ml6-ba母液；
(3)按上述步骤(11)至步骤(14)中配制每升培养基的用量加入后，再加入琼脂6.5g，蔗糖32g，6-ba母液0.9ml，naa母液0.2ml，加热溶解后定容至1l，用0.lmol·l-1盐酸或氢氧化钠调ph值至5.7，再分装培养基，灭菌。
3、将原保存的树莓无菌苗在超净台上接种至本实施例配制好的灭菌的培养基上，在光照强度3000lux的条件下培养，培养条件为：温度23-27℃，每日光照时间为16小时。
在本实施例培养基上培养2-6d内树莓叶片颜色由原本的淡绿色逐渐转化为深绿色，30d内，可以观察出树莓幼苗明显变得粗壮有力，统计得到污染率为0.86％，原配方污染率为1.65％；后期以与在原配方中生长的树莓共同驯化炼苗，原配方下生长的组培苗成活率为56％，该配方下生长的组培苗成活率为93％。