本发明涉及微生物抗植物病毒活性物质、农药制剂及其应用，特别涉及一种含糖蛋白gp-1的微生物源抗病毒组合物、制剂及其应用。
背景技术
植物病毒病发生普遍、防治困难，严重危害着农业生产，并在世界范围内造成了巨大经济损失。微生物是抗植物病毒剂研发的重要资源库，从微生物代谢产物中筛选与分离抗植物病毒活性物质一直是国内外学者们的研发热点。
喀纳斯链霉菌(streptomyceskanasensiszx01)是分离自新疆喀纳斯湖畔的一种新型放线菌，其代谢产物具有抗植物病毒和杀真菌活性，其中糖蛋白gp-1为主要的活性成分，具有抗病毒、诱导植物抗病性和增产的效果，其对植物安全，不易产生抗药性，可作为农业病害防治的理想药剂的活性成分。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种含糖蛋白gp-1的微生物源抗病毒组合物、制剂及其应用，本发明的糖蛋白gp-1与小檗碱混合后，在一定的混合比条件下，表现出了不可预料的增效效果。
为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案得以实现：
一种含糖蛋白gp-1的微生物源抗病毒组合物，该组合物包括小檗碱，还包括糖蛋白gp-1和/喀纳斯链霉菌(streptomyceskanasensiszx01)的代谢物。
可选的，所述的喀纳斯链霉菌(streptomyceskanasensiszx01)的代谢物的制备包括：
喀纳斯链霉菌(streptomyceskanasensiszx01)在小米发酵培养基28℃发酵培养7天后过滤，滤液进行喷雾干燥得到粉状物即得；
所述的小米培养基为：小米10g、葡萄糖10g、蛋白胨3g、nacl2.5g、caco30.2g、水1l、ph7.2～7.4。
可选的，所述的糖蛋白gp-1分离自喀纳斯链霉菌(streptomyceskanasensiszx01)的代谢物。
一种含糖蛋白gp-1的微生物源抗病毒制剂，所述的制剂包括有效成分和助剂，所述的有效成分为所述的含糖蛋白gp-1的微生物源抗病毒组合物。
可选的，所述的制剂形态是可溶性液剂、水剂或可湿性粉剂。
可选的，可溶性液剂由以下原料按重量百分比配制：含糖蛋白gp-1微生物代谢物：20％～40％，小檗碱0～10％，表面活性剂：5％～15％，防冻剂：5％，余量为木醋液，原料的重量百分比之和为100％。
可选的，含糖蛋白gp-1微生物代谢物：20％～40％，小檗碱：0～10％；表面活性剂：5％～15％，防冻剂：5％，余量为水，原料的重量百分比之和为100％。
可选的，可湿性粉剂制备配比：含糖蛋白gp-1微生物代谢物：20％～40％，小檗碱：0～10％，表面活性剂：5％～15％，其余为填料，原料的重量百分比之和为100％。
所述的含糖蛋白gp-1的微生物源抗病毒组合物用于制备防治植物病原真菌、细菌和/或病毒引起的植物病害的农药和/或肥料的应用。
可选的，所述的真菌引起的植物病害包括番茄灰霉病、马铃薯晚疫病、小麦赤霉病和苹果炭疽病；
细菌引起的植物病害包括白菜软腐病和水稻白叶枯病；
所述的病毒包括烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒、马铃薯卷叶病毒、番茄黄化曲叶病毒病和水稻矮缩病毒。
本发明的优点包括：
本发明的含糖蛋白gp-1的微生物源抗病毒组合物，是一种新型环保型微生物源抗病毒剂，适用于防治烟草花叶病毒病、番茄黄化曲叶病毒病、黄瓜花叶病毒病等。其作用方式新颖，可有效的缓解常规农药长期使用带来的抗性问题，符合农业和农药发展的趋势。原料简单易得，效果显著，易于工业化生产，具有成本低、对环境、人畜安全，不易产生抗药性等特点，且可采用常规施药方法。特别是本发明研究了将糖蛋白gp-1与小檗碱混合后，在一定的混合比条件下，表现出了不可预料的增效效果。
具体实施方式
喀纳斯链霉菌(streptomyceskanasensiszx01)在hanlr,zhanggq,miaogp,zhangx*,fengjt.streptomyceskanasensisspnov.,anantiviralglycoproteinproducingactinomyceteisolatedfromforestsoilaroundkanaslakeofchina.currentmicrobiology,2015,71(6):627-631.文献中记载，放线菌zx01是从新疆喀纳斯湖畔树林的土壤中分离得到的一株放线菌。经过菌株形态学特征归类，zx01可归属于链霉菌粉红孢类群。用多相分类学鉴定方法结合dna同源性对zx01菌株进行鉴定，将链霉菌鉴定为1个新种，命名为streptomyceskanasensiszx01。即为本发明中提到的喀纳斯链霉菌(streptomyceskanasensiszx01)。
糖蛋白gp-1从喀纳斯链霉菌zx01代谢物中分离得到。该糖蛋白分子量约为8500da，多糖和蛋白含量分别为40.23％和54.36％；蛋白部分由15种氨基酸组成，其中酸性氨基酸asp和glu含量较高(15.15％和12.63％)，碱性氨基酸arg和lys含量较低(0.62％和4.88％)；多糖部分由6种单糖组成，分别是甘露糖，木糖，阿拉伯糖、葡萄糖、氨基葡萄糖和半乳糖(0.38:0.14:0.40:2.62:0.10:1.00)，经过质谱分析，gp-1是一个结构较为新颖的糖蛋白。提取方法参照张国强.喀纳斯链霉菌zx01抗tmv活性物质分离及全局调控基因nsda阻断研究[d].西北农林科技大学,2016.中的方法进行糖蛋白gp-1的获得。
小檗碱亦称黄连素，是从中药黄连中分离的一种季铵生物碱，是黄连抗菌的主要有效成分。为黄色针状结晶，味苦。在植物界中分布较广，大约有4个科10个属内发现有本品存在。临床应用主要为本品的盐酸盐和硫酸盐。我国现用合成法大量生产。在市场上可通过购买获得。
本发明的含糖蛋白gp-1的微生物源抗病毒组合物用于制备防治植物病原真菌、细菌和/或病毒引起的植物病害的农药和/或肥料的应用。比如真菌引起的植物病害包括番茄灰霉病、马铃薯晚疫病、小麦赤霉病和苹果炭疽病；细菌引起的植物病害包括白菜软腐病和水稻白叶枯病；病毒包括烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒、马铃薯卷叶病毒、番茄黄化曲叶病毒病和水稻矮缩病毒。
以下结合发明人的试验和实施例对本发明作进一步的详细描述。
一、含糖蛋白gp-1的微生物代谢物的获得
喀纳斯链霉菌(streptomyceskanasensiszx01)在小米发酵培养基中28℃发酵培养7天后过滤，滤液进行喷雾干燥，得到的粉状物即为含糖蛋白gp-1的微生物代谢物。这个代谢物是含有糖蛋白gp-1的混合物，其它组分也会有一定药效，但主要效果是糖蛋白gp-1。糖蛋白gp-1是这个混合物经过活性追踪的方法分离得到，经过活性追踪和大量馏分段的活性生物测定，很明确糖蛋白gp-1发挥主要的药效。参照张国强.喀纳斯链霉菌zx01抗tmv活性物质分离及全局调控基因nsda阻断研究[d].西北农林科技大学,2016
二、含糖蛋白gp-1的微生物源抗病毒环保制剂的制备
将含糖蛋白gp-1的微生物代谢物、小檗碱、木醋液、表面活性剂等材料配制成可溶性液剂、水剂或可湿性粉剂，用于防治有植物病毒引起的植物病毒病。上述各种剂型中各原料物质的重量百分比参见下表：
上述所用的表面活性剂是本领域常用的各类表面活性物质的一种或几种的混合物；
所用的填料是白炭黑、膨润土、硅藻土或本领域工作人员共知的物质中的一种或几种混合物。
所用的防冻剂是乙二醇或丙二醇。
三、糖蛋白抗病毒剂防治烟草花叶病毒病增效作用结果
防效测定(1)tmv体外钝化作用测定。以半叶枯斑法检测药剂对tmv的体外钝化作用。具体方法:选取健康生长旺盛的4～6叶期心叶烟左半叶接种药剂与病毒的等体积混合液，右半叶接种蒸馏水与病毒的等体积混合液(对照)，重复3次。接种5～7d后计算枯斑数。
枯斑抑制率计算公式：枯斑抑制率(％)＝(对照枯斑数-处理枯斑数)/对照枯斑数×l00％。
(2)对tmv初侵染和复制增殖作用的测定。同样以半叶枯斑法进行检验。具体方法:选取健康生长旺盛的4-6叶期心叶烟，初侵染试验中先在供试植物左半叶涂药间隔一定时间后，再全叶接种病毒；复制增殖试验中先全叶接种病毒，间隔一定时间后，再在供试植物的左半叶涂药。植物提取液浓度为50倍液，香菇多糖作为药剂对照，浓度为400倍液，病毒接种浓度为10mg/ml。各处理重复3次，5～7d后计算枯斑数，按上述方法计算枯斑抑制率。
(3)活性物质之间增效作用的测定方法。利用y.p.sun和e.r.johnson方法计算复配剂的共毒系数，并根据共毒系数大小来评价复配剂增效作用，并确定最佳配比。
毒力指数(ti)＝标准杀菌剂ec50/供试药剂ec50×100；
复配制剂实际毒力指数(ati)＝标准药剂ec50/混剂ec50；
复配制剂剂理论毒力指数(tti)＝单剂a的ti×pa+单剂b的ti×pb，(pa和pb分别是混剂中单剂a和单剂b有效成分的百分含量)；
复配制剂共毒系数(ctc)＝混剂的实际毒力指数ati/混剂的理论毒力指数tti；
增效作用判断：ctc>120时为增效作用；ctc<80时为拮抗作用；80≤ctc≤120时为相加作用。
表1供试药剂试验浓度设置
据相关数据的分析，计算出各试验药剂对tmv的枯斑抑制率。并将其值转化为几率值(y)，将药剂浓度转化为相应的对数值(x)，即可根据相关公式，求出各药剂对tmv的毒力回归曲线方程：y＝a+bx，以及ec50值和相关系数(r)。
两种活性成分对tmv病毒病的抑制活性和复配增效结果:
表2两种活性成分对tmv病毒病的抑制活性
注:同列不同小写字母表示处理间差异显著。
表3不同比例组合抗tmv的共毒系数
表2表3表明，糖蛋白与小檗碱具有良好的抗病毒活性，且糖蛋白与小檗碱在复配时，其比例为1：1和3：7时，其共毒系数大于120，表现为增效作用。
试验实施例
需要说明的是，以下给出的实施例仅为较佳的例子，本发明不限于这些实施例，在本发明的范围内均能够得到符合要求的抗病毒剂。
实施例1：0.05％糖蛋白·0.2％小檗碱抗病毒可溶性液剂的配制
在20～25℃下，取5份含1％糖蛋白gp-1的微生物代谢物、0.2份小檗碱、5份异丙醇、5份十二烷基磺酸钙、5份苯乙烯酚聚氧乙烯醚和79.8份木醋液后，在反应釜中以搅拌速度800～1000转/分钟的速度搅拌10～30分钟，即可得到含有0.05糖蛋白·0.2％小檗碱抗病毒可溶性液剂。
实施例2：0.1％糖蛋白·0.2％小檗碱抗病毒水剂的配制
在20～25℃下，取10份含1％糖蛋白gp-1的微生物代谢物、0.2份小檗碱、2份异丙醇、5份十二烷基磺酸钙和82.8份水后，在反应釜中以搅拌速度800～1000转/分钟的速度搅拌10～30分钟，即可得到含有0.1糖蛋白·0.2％小檗碱抗病毒水剂。
实施例3：0.2％糖蛋白·0.2％小檗碱抗病毒可湿性粉剂的配制
在20～25℃下，取20份含1％糖蛋白gp-1的微生物代谢物粉、15份木质素磺酸钠、5份月桂醇聚氧乙烯醚和60份白炭黑，加入至混合机中充分混匀，即得0.2％糖蛋白·0.2％小檗碱抗病毒可湿性粉剂。
上述实施例1-3的糖蛋白抗病毒剂防治烟草花叶病毒病田间试验结果：
按照本发明的制剂配制方法，配制的0.05％糖蛋白·0.2％小檗碱抗病毒可溶性液剂、0.1％糖蛋白·0.2％小檗碱抗病毒水剂和0.2％糖蛋白·0.2％小檗碱抗病毒可湿性粉剂，在大田进行了防治烟草花叶病毒病和番茄黄化曲叶病毒病的试验，使用0.5％香菇多糖水剂为对照药剂，清水为对照。
防治烟草花叶病毒病试验结果调查方法采取整株调查的方式，按照以下的分级标准进行分级：
0级：全株无病；
1级：心叶明脉或轻微花叶；病株无明显矮化。
3级：1/3叶片花叶但不变形，或病株矮化为正常株高的3/4以上；
5级：1/3-1/2叶片花叶，或少数叶片变形，或主脉变黑，或病株矮化为正常株高2/3-3/4
7级：1/2-2/3叶片花叶，或变形或主侧脉坏死，或病株矮化为正常株高的1/2-2/3；
9级：全株叶片花叶，严重变形或坏死，或株矮化为正常株高的1/2以上。
结果统计：
按照以下公式计算病情指数和防治效果：
病情指数＝∑(病级数×病株数)/(最高病级×各处理总株数)
防治效果＝(对照病指—处理病指)/对照病指×100％
田间预防实验结果见表4：
表4糖蛋白gp-1抗病毒剂对烟草花叶病毒的田间预防试验结果(河南渑池县，2015年6-7月)
试验结果显示三种制剂的200倍和400倍液均能很好的预防烟草花叶病毒病的发生，其对烟草花叶病毒病的防治效果与0.5％香菇多糖对照药剂300倍液相当。
防治番茄黄化曲叶病毒病试验结果调查方法采取整株调查的方式，按照以下的分级标准进行分级：
0级：无症状；
1级：顶部叶片轻度黄化，叶边缘轻度卷曲，花期花轻度脱落；
2级：顶部叶片中度黄化，叶边缘中度卷曲褶皱，花期花轻度脱落，结果期产量轻度减产。
3级：叶片严重黄化，卷曲，褶皱，花期花中度脱落，结果期产量中度减产；
4级：大面积叶片严重畸形缩小，植株生长缓慢，明显矮化，花期花严度脱落，结果期产量严重减产或绝产。
结果统计：
按照以下公式计算病情指数和防治效果：
病情指数＝∑(病级数×病株数)/(最高病级×各处理总株数)
防治效果＝(对照病指—处理病指)/对照病指×100％
田间预防实验结果见表5：
表5糖蛋白gp-1抗病毒剂对番茄黄化曲叶病毒病的田间预防试验结果(陕西渭南，2014年6-7月)
试验结果显示三种制剂的200倍和400倍液均能很好的预防番茄黄化曲叶病毒病的发生，其对番茄黄化曲叶病毒病的防治效果均优于0.5％香菇多糖对照药剂300倍液。