本发明涉及果蔬保鲜和农药
技术领域：
，具体涉及为植物源抑菌复配物的制备，特别涉及一种防治荔枝霜疫霉病的植物源复配物制备方法。
背景技术：
：荔枝霜疫霉病是荔枝生产和果实贮藏中的重要病害（姜子德，2011；戚佩坤，1994），其病原为荔枝霜疫霉（陶挺燕，2010）。由于荔枝果实发育期和采收期正值高温、高湿的夏季，果实极易受荔枝霜疫霉的侵染，鲜果贮藏期间很容易引发病害，致果实腐烂变质。为防治贮藏病害，荔枝常温贮藏中常用so2、扑海因、仲丁胺、特克多抑霉唑和多菌灵等化学药剂（蒋雨，2016）。防治病害的化学药剂中主要为化工农药，但荔枝贮藏中使用化工农药容易造成环境污染和农药残留，食用含农残的果实会对人体健康产生不利影响，严重会造成农药中毒或死亡。所以，研究和开发植物源抑菌物质防治荔枝霜疫霉病对环境、果实的安全以及促进荔枝产业发展均具有重要意义。目前关于植物源抑菌物质对荔枝霜疫霉病害防治的研究和应用主要集中在单一植物提取物或植物源的某一化合物上面，但是植物源的抑菌物质作为抑菌剂或水果保鲜剂时，常要跟化工农药比如抑霉唑、雷多米尔等相结合，才具有较好的抑菌效果。果实贮藏中跟化工农药结合进行抑菌的方法在果实中还是容易造成农药残留，同样存在安全隐患。另外，使用单一植物的提取物或化合物用于抑菌，则需要大量某种植物，这样就容易造成某一种植物资源匮乏。如果用于提取防治病害抑菌物质的植物种类太少，没有较多的植物种类选择，还容易破坏自然生态平衡。在荔枝霜疫霉病害防治中，如果找到一些植物源提取物，用这些提取物复配后，抑菌效果可以相加或加强，这样更利于病害防治。从材料用量来讲可以减少对某一种植物材料的需要量，不易受到某一植物种类数量和植物资源稀缺的限制。复配时更多考虑植物组合的抑菌效果，这样有不同的组合配方就有更多的植物种类可以选择，也就不易破坏生态平衡。如果用植物源复配物进行抑菌，能不与化工农药结合就能满足抑菌要求，这样就不会造成环境污染，也不会存在安全隐患。植物源抑菌剂或植物源农药由于其原料来源、储存加工、制剂工艺等方面的一些特殊要求，生产成本相对化工农药要高，为了达到速效，或为达到化工农药的类似的使用效果难度也较大，特别是在开发单一植物源农药或单一植物源抑菌化合物时，开发成本就会大大增加。同时，植物源农药在使用上要求一般比较高，相对化工农药繁琐。这些都是目前植物源农药需要克服的地方。研究配制过程简单、操作方便、成本低廉，又能达到抑菌要求、容易施用的植物源复配物，不仅可以满足现有的大多数中小型荔枝合作社和荔枝经销商在生产和销售安全水果上对植物源抑菌剂的需求，还有利于降低荔枝的生产和销售成本。技术实现要素：本发明在对多种植物进行广泛筛选后，发现了苦参、黄连和丁香的杀菌特性，提供了一种配制简单，稳定安全且克服单一植物源提取物不足的应用于荔枝保鲜和荔枝霜疫霉病害防治的植物源复配物制备方法。本发明可以通过以下技术方案来实现：一种防治荔枝霜疫霉病的植物源复配物制备方法，其特征在于包括以下制备步骤：步骤1，材料粉碎：取苦参、黄连和丁香分别洗净并干燥处理，将干燥后的苦参、黄连和丁香分别粉碎过筛处理，得到苦参粉碎物、黄连粉碎物和丁香粉碎物；将苦参、黄连和丁香洗干净可减少杂质带入制备得到的植物源复配物中，提高产品纯度，通过粉碎过筛得到粒径较小的颗粒，有利于后续能将有效物质成分充分提取出来。步骤2，超生波提取：将步骤1制备得到的苦参粉碎物、黄连粉碎物和丁香粉碎物分别置于提取装置中，均按重量比或体积比加入乙醇，浸泡5～10小时，再用超声波提取0.5～1小时，经抽滤分别得到苦参提取物、黄连提取物和丁香提取物；乙醇为常用植物提取溶剂且无毒，对环境和人体几乎没有危害。通过超声波提取的方法有利于将材料中的抑菌有效成分充分释放并溶解在乙醇中。步骤3，植物源复配物配制：分别取苦参提取物、黄连提取物和丁香提取物按比例混合形成植物源复配物母液，将植物源复配物母液用乳化水溶液稀释，即得植物源复配物。将高浓度的植物源复配物母液稀释后得到的植物源复配物可用浸泡、喷雾等方法处理荔枝果实，预防荔枝霜疫霉病害的发生。本发明所提供的植物源复配物制备方法操作简单，时间短，用苦参、黄连和丁香的提取物配制的植物源复配物中的有效成分属于天然抗菌活性物质，是植物次生代谢产物，能参与自然物质与能量代谢，施于果实或环境中不会造成有毒残留。而本发明中各个处理步骤的操作方式可灵活调整。进一步地，步骤1所述干燥处理为晒干、阴干或烘干。通过晒干、阴干或烘干将材料的水分烘干，可减少后续粉碎过程中材料的损耗，同时避免水分含量过高导致后续提取加入乙醇后有效组分不易提取出来。进一步地，步骤1所述过筛处理为过40～60目筛。粉碎过筛后得到有一定程度的小颗粒有利于抑菌活性物质的提取，过筛目数小于40目会增加粉碎难度和成本，过筛目数大于60目则不利于提取活性物质。进一步地，乙醇加入量为重量比或体积比的2～5倍。乙醇加入量低于重量比或体积比的2倍导致抑菌活性物质无法充分溶解提取出来，加入量高于重量比或体积比的5倍则导致提取物浓度过低，影响稀释后的使用效果。进一步地，步骤2所述乙醇的百分浓度为85%～95%。乙醇百分浓度为低于85%则乙醇占比过低导致抑菌活性物质不能充分提取出来，导致提取物浓度过低，影响使用效果。进一步地，步骤3所述苦参提取物、黄连提取物和丁香提取物按体积比为1:1:0.1～1:1:0.5混合。苦参提取物、黄连提取物和丁香提取物均具有较高的离体抑制活性，其中丁香提取物的抑菌效果好，但丁香材料价格贵，降低丁香提取物配比与苦参提取物和黄连提取物混合，可大大提高防治荔枝霜疫霉病害的效果并降低使用成本。丁香提取物配比若高于0.5会导致荔枝变色，影响果实色泽。进一步地，步骤3所述植物源复配物母液稀释倍数为100～300倍。植物源复配物母液稀释倍数低于100倍，制备得到的植物源复配物浓度过高，经处理后的果实外表会变色，影响果实外观；植物源复配物母液稀释倍数高于300倍，制备得到的植物源复配物浓度过低，无法有效抑菌和防治荔枝霜疫霉病害的发生。进一步地，步骤3所述植物源复配物母液稀释的溶液为0.05～0.1%吐温-80乳化水溶液。含0.05～0.1%吐温-80乳化水溶液能有效溶解分散植物源复配物母液，得到浓度均一的植物源复配物。进一步地，所述植物源复配物母液的贮存条件为低温冷藏，所述冷藏温度为4～10℃。低温冷藏能延长制备得到的植物源复配物母液的有效期，且高浓度母液方便储存和稀释使用。本发明一种应用于防治荔枝霜疫霉病的植物源复配物制备方法，具有如下的有益效果：第一、配制过程简单，操作方便；本发明经过材料粉碎、乙醇超声波提取和配制稀释三步即可制备得到植物源复配物，配制过程简单，时间短，操作方便，只需将配制得到的植物源复配物采用浸泡、喷雾等方法处理荔枝果实即可，果农容易掌握和使用；第二、材料容易获取，制备成本低；本发明所采用的植物材料来源广泛，均为市场上常见的材料，容易购买，且价格不高，制备成本低；第三、环保安全；本发明提取过程中使用的乙醇为无毒溶剂，而以苦参、黄连和丁香提取物配制得到的植物源复配物中的有效成分属于天然抗菌活性物质，是植物次生代谢产物，能在自然环境中降解，施于果实上或环境中，不会造成有毒残留；第四、不易产生抗药性；本发明制备得到的植物源复配物对植物病原菌的作用机理不同于常规农药，同时也克服单一植物提取物抗病活性不足的缺陷，使用后病原菌不容易产生抗药性；第五、提供一种安全有效的植物源复配物；本发明用苦参、黄连和丁香的提取物配制得到的植物源复配物具有良好的抑菌抗病效果，无需添加化工农药，使用后没有农药残留，无安全隐患。具体实施方式为了更清楚的理解本发明以及植物源复配物对荔枝霜疫霉的抑菌防病效果，以下通过发明人给出的依据本发明技术方案完成的如下实施例，对本发明作进一步的详细描述，这些仅是本发明较好的实施例，但不限于这些实施例。实施例1苦参、黄连和丁香植物源提取物及三者配伍的植物源复配物的制备：步骤1，材料粉碎：取苦参、黄连和丁香各100g，分别洗净并干燥处理，将干燥后的苦参、黄连和丁香分别粉碎过40目筛，得到苦参粉碎物、黄连粉碎物和丁香粉碎物；步骤2，超声波提取：将步骤1制备得到的苦参粉碎物、黄连粉碎物和丁香粉碎物各50g分别置于500ml具塞三角瓶中，加入100ml的95%乙醇（相当于粉碎物重量2倍），室温浸泡5小时，期间摇动数次，再超声波提取1小时，真空抽滤，再将滤液用95%乙醇定容至100ml，即得苦参提取物、黄连提取物和丁香提取物。步骤3，植物源复配物的配制：取苦参提取物、黄连提取物各100ml以及丁香提取物50ml混合，即得植物源复配物母液，将配制好的植物源复配物母液放入4℃冰箱中贮藏备用。使用时取植物源复配物母液10ml，加入1000ml含0.05%吐温－80的乳化水溶液稀释使用。实施例2苦参、黄连和丁香植物源提取物及三者配伍的植物源复配物的制备：步骤1，材料粉碎：取苦参、黄连和丁香各100g，分别洗净并干燥处理，将干燥后的苦参、黄连和丁香分别粉碎过50目筛，得到苦参粉碎物、黄连粉碎物和丁香粉碎物；步骤2，超声波提取：将步骤1制备得到的苦参粉碎物、黄连粉碎物各50g和丁香粉碎物10g置于1000ml具塞三角瓶中，加入220ml的90%乙醇（相当于粉碎物重量2倍），室温浸泡8小时，期间摇动数次，再超声波提取0.5小时，真空抽滤，再将滤液用90%乙醇定容至220ml，即得植物源复配物母液，将配制好的植物源复配物母液放入8℃冰箱中贮藏备用；步骤3，植物源复配物配制：取植物源复配物母液10ml，加入3000ml含0.08%吐温-80的乳化水溶液稀释使用。实施例3苦参、黄连和丁香植物源提取物及三者配伍的植物源复配物的制备：步骤1，材料粉碎：取苦参、黄连和丁香各100g，分别洗净并干燥处理，将干燥后的苦参、黄连和丁香分别粉碎过40目筛，得到苦参粉碎物、黄连粉碎物和丁香粉碎物；步骤2，超声波提取：将步骤1制备得到的苦参粉碎物、黄连粉碎物和丁香粉碎物各50g分别置于500ml具塞三角瓶中，加入250ml的85%乙醇（相当于粉碎物重量5倍），室温浸泡10小时，期间摇动数次，再超声波提取1小时，真空抽滤，再将滤液用85%乙醇定容至250ml，即得苦参提取物、黄连提取物和丁香提取物，放入10℃冰箱中贮藏备用；步骤3，植物源复配物配制：取苦参提取物、黄连提取物和丁香提取物各100ml，分别加入2000ml含0.1%吐温-80的乳化水溶液稀释，再分别取稀释后的苦参提取物溶液、黄连提取物溶液各1000ml和丁香提取物溶液100ml混合后即得植物源复配物。为进一步证明本技术方案具备有效抑菌抗病效果，发明人通过实验分别对单个植物材料提取物和上述三个实施例制备得到的植物源复配物进行了荔枝霜疫霉的抑制活性试验。试验例1苦参、黄连和丁香提取物对荔枝霜疫霉的抑菌活性试验：测定提取物及复配物对荔枝霜疫霉的抑菌活性，供试菌种荔枝霜疫霉菌(peronophythoralitchi)由惠州学院植物学实验室提供，研究报告如下。（1）对荔枝霜疫霉孢子囊萌发的抑制活性将荔枝霜疫霉菌接种于马铃薯蔗糖培养基（psa培养基）上28℃下培养10天后，用20ml无菌蒸馏水冲洗菌丝及抱子囊，4层纱布过滤制得孢子囊悬液，镜检并调整抱子囊浓度，使其在低倍镜下(10×10)每个视野的孢子数达80～100个。取5ml孢子囊悬液于试管中，加入5µl浓度为5.0mg/ml植物提取物后放入28℃恒温振荡培养箱中培养5小时后镜检，随机检查3个视野，统计孢子萌发数，按下述公式计算抱子囊萌发抑制率。每处理重复3次，以95%乙醇5µl加入抱子囊悬液作对照。苦参、黄连和丁香提取物对荔枝霜疫霉孢子囊萌发的抑制作用测定结果如表1。孢子囊萌发抑制率(%)＝(对照孢子囊萌发率－处理孢子囊萌发率)/对照孢子囊萌发率×100。表1苦参、黄连和丁香提取物对荔枝霜疫霉孢子囊萌发的抑制作用测定材料浓度（mg/ml）萌发率（%）萌发抑制率（%）苦参提取物5.0021.3256.29黄连提取物5.0013.5775.17丁香提取物5.0010.8279.44从上述试验数据可见苦参、黄连和丁香的提取物均对荔枝霜疫霉包子囊萌发有抑制作用。（2）对荔枝霜疫霉菌丝生长的抑制活性分别将苦参、黄连、丁香提取物与冷却至50～60℃的psa培养基充分混合，配制成5.000mg/ml带药培养基，进行菌丝生长量测定，然后将苦参提取物配制成5.000，2.500，1.000，0.500和0.250mg/ml等5个质量浓度梯度的带药培养基，把黄连、丁香提取物配制成2.000，1.000，0.500，0.250和0.125mg/ml等5个质量浓度梯度的带药培养基，将三种提取物在不同浓度梯度下进行菌丝生长量测定。取10ml各带药培养基倒入直径为9cm的培养皿制成带药培养基，用直径为4mm的打孔器在培养好的荔枝霜疫霉菌落边缘打取菌饼，将菌饼移植到带药培养基中心(一皿一个菌饼)，使菌丝面向下接触培养基，28℃培养5天后，用十字交叉法测量并记录菌落直径，按下述公式计算抑菌率。以乙醇代替提取物制作培养基为对照，每处理3次重复。抑菌率(%)=100(对照净生长量－处理净生长量)/对照净生长量，其中净生长量＝菌落直径－菌饼直径。用spss19计算毒力回归方程y＝a+bx，并计算抑菌中浓度（ec50）。苦参、黄连和丁香提取物对荔枝霜疫霉菌丝生长的抑菌活性测定结果如下表2和表3。表2苦参、黄连和丁香提取物对荔枝霜疫霉菌丝生长的抑制作用测定材料浓度（mg/ml）菌落直径（mm）抑菌率（%）苦参提取物5.005.23±0.1185.60黄连提取物5.000.00100.00丁香提取物5.000.00100.00表3苦参、黄连和丁香提取物对荔枝霜疫霉的毒力回归方程试验例2苦参、黄连和丁香三者的复配物对接种荔枝霜疫霉果实的抑菌效果：挑选大小均匀、成熟度接近、无病虫害和机械损伤的桂味荔枝果实置于荔枝霜疫霉抱子囊(4×104个/ml)悬浮液中浸泡5min。将浸泡过的果实取出晾干(约10min左右)，用苦参、黄连和丁香提取物三者的复配物对果实进行喷雾处理，全果喷湿至有液体滴出，喷雾处理30个果实。试验设空白对照，用无菌纯水处理，并以防治霜疫霉的杀菌剂雷多米尔(ridomil)作为商品杀菌剂对照，雷多米尔溶液浓度为800mg/l。喷雾后将果实晾干再放入保鲜盒，果实单层放置且不相互接触，上盖4层湿润纱布。果实于25℃下放置96小时后统计病情指数。病情指数=∑(各级病果数×该病级)×100%/(总调查果数×最高病级数)，其中：0级，果皮无病斑无褐化；1级，病斑和褐化的面积小于总面积25%；2级，病斑和褐化的面积大于25%而小于50%；3级，病斑和褐化的面积大于50%而小于75%；4级，病斑和褐化的面积大于75%。效菌效果见表3。表4植物源复配物对接种荔枝霜疫霉果实的抑菌效果从上述试验数据可见苦参、黄连和丁香提取物混合制备得到的植物源复配物均对荔枝霜疫霉包子囊萌发具有明显的抑制作用。以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制；凡本行业的普通技术人员均可按以上所述而顺畅地实施本发明；但是，凡熟悉本专业的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，可利用以上所揭示的技术内容而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变等，均仍属于本发明的技术方案的保护范围之内。当前第1页12