甲基丙二酸在制备线虫杀虫剂中的应用的制作方法

本发明属于农业微生物学
技术领域：
，具体涉及甲基丙二酸在制备线虫杀虫剂中的应用。
背景技术：
目前对植物有害的线虫约有3000多种，而在我国发现的有40多种，其中对作物危害最严重的线虫之一是根结线虫。根结线虫虫体微小，生活在植物体内或土壤中，会随着雨水、劳事操作及病株的转移而转移，防治极为困难。据不完全估计，线虫在全球造成的经济损失在800亿左右。在根结线虫病害严重的热带和亚热带地区，致使农作物减产80％以上。根结线虫(meloidogyne)是一种雌雄异体、高度专化型的杂食性植物病原线虫，其生活史要经历卵、幼虫和成虫三个时期。在适宜条件下(20-30℃)，卵经过2天分裂成约20个左右的细胞，然后进入囊胚期，再经过2天，第4-5天进入原肠期，之后的4-5天先出现口针，形成一龄幼虫，再经过静伏和第一次蜕皮，破壳孵出即是二龄幼虫。二龄幼虫是根结线虫侵染危害植物的唯一有效龄期，二龄幼虫由植物根尖侵入，在经过两次蜕皮发育成成虫，雄成虫重回到土壤中，雌成虫产卵繁殖后代，多数根结线虫只进行孤雌生殖。根结线虫主要以卵、卵囊或2龄幼虫随病残体在土壤中越冬，当气温达到10℃以上时，卵就能孵化出幼虫。根结线虫有驱水性和趋化性。在潮湿环境中有利于移动，极端潮湿和干旱都能抑制根结线虫的生存与活动，田间含水量维持在50％-80％时有利于雌虫产卵。植物根系分泌物对根结线虫有很强的吸引力，所以根结线虫在土壤中的分布集中在10-30cm的土层，聚集在耕作层植物根际周围。二龄幼虫能在土壤中移动，活动范围有限，不超过2米，在水中不活跃。根结线虫对温度适应性较强。15-3o℃是根结线虫的适宜生长繁殖温度，40℃以上高温和5℃以下低温即可抑制二龄幼虫存活和卵囊中卵孵化，雌虫不能发育完全。根结线虫病，必须严格实行以防为主、综合防治的植保方针，着重抓好农业、物理防治措施，配合化学及生物防治，才能有效地预防其危害。主要防治方法有有以下4种方法：(1)农业防治：包括水旱轮作、嫁接、改良土壤、调节播种期、种植抗病品种等。(2)物理防治：主要有清除病株残体、土壤处理和种子处理等。(3)化学防治：施用化学杀线剂来进行防治。(4)生物防治：生物防治是近年来发展较迅速的一种防治方法，是指利用线虫的天敌来控制虫口数量和限制线虫引起的损失，且对人、动物和环境均相对安全，应用前景广阔。生物防治中目前应用最广泛的是苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis,简称bt)，此外还有穿刺巴氏杆菌(psteuriapenetrans)、假单胞杆菌(pseudomonasspp.)以及近年发现的坚强芽胞杆菌(bacillusfirmus)等。本发明所述甲基丙二酸(methylmalonicacid)，中文别名是甲基马来酸(methylmaleicacid)或异琥珀酸(isosuccinicacid)，是一种小分子有机酸，分子式为c4h6o4，物理性质易溶于水、醇和醚。甲基丙二酸由丙酸、胸腺嘧啶等代谢过程产生的甲基丙二酰辅酶a分解生成。在缺乏维生素b12而甲基丙二酰辅酶a代谢受到阻碍时由尿中排出。本申请首次发现甲基丙二酸具有杀线虫活性。技术实现要素：本发明的目的在于提供甲基丙二酸在制备线虫杀虫剂中的应用，特别是秀丽隐杆线虫杀虫剂和/或根结线虫杀虫剂中的应用。所述的甲基丙二酸分子式为c4h6o4，分子量为118.09。该小分子有机酸具备杀线虫活性，其化学式如下：为了达到以上目的，本发明采用以下技术措施：甲基丙二酸在制备线虫杀虫剂中的应用，应用过程包括以甲基丙二酸为主效成分或者主效成分之一制备成线虫杀虫剂；以上所述的应用中，优选的，所述的线虫为南方根结线虫或秀丽隐杆线虫。以上所述的应用中，优选的，甲基丙二酸与甜菜碱复配制备成线虫杀虫剂。甲基丙二酸在制备植物病原菌杀菌剂中的应用，应用过程包括以甲基丙二酸为主效成分或者主效成分之一制备成植物病原菌杀菌剂；以上所述的应用中，优选的，所述的植物病原菌为青枯假单胞菌或欧文氏菌。以上所述的应用中，优选的，甲基丙二酸与甜菜碱复配制备成植物病原菌杀菌剂。与现有技术相比，本发明具有以下特点：本发明首次报道了甲基丙二酸其杀线虫活性，为新型的根结线虫生防制剂的制备提供了新的选择性。甲基丙二酸制备的杀线剂具有高效、低毒、持续性好的优点，同时对植物病原菌也有杀菌作用。附图说明图1为甲基丙二酸的化学结构示意图。图2为甲基丙二酸对植物细菌病原菌的抑菌效果图；其中：a.对青枯假单胞菌的抑菌效果。b.对欧文氏菌的抑菌效果。c.对核桃黑斑病的抑菌效果。图3为甲基丙二酸对植物真菌病原菌的抑菌效果图；其中：a.对辣椒疫霉菌的抑菌效果。b.对灰葡萄孢菌的抑菌效果。c.对尖孢镰刀菌的抑菌效果。d.对索兰尼链格孢的抑菌效果。e.对多主棒孢霉的抑菌效果。f.对茶拟盘多毛孢的抑菌效果。g.对立枯丝核菌的抑菌效果。h.对核盘菌的抑菌效果。具体实施方式下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为报道的微生物学常规操作方法，所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。实施例1：杀线虫甲基丙二酸的结构验证1.甲基丙二酸购自sigma公司。2.核磁共振(nmr)核磁共振检测甲基丙二酸结构：以氘水(d2o)为溶剂，分别测定氢谱(hnmr)及碳谱(13cnmr)，表1为核磁共振数据。表1甲基丙二酸核磁共振二维谱数据实施例2：甲基丙二酸在制备根结线虫杀虫剂中的应用，应用过程如下：从番茄根部挑取线虫感染根结，将卵块置于96孔板20℃孵育，观察根结线虫孵化情况。用无菌水冲洗线虫，在96孔板中加入20μl1mg/ml的甲基丙二酸水溶液，同时加入纯净水，调整孔板中甲基丙二酸的终浓度依次为1000，100，25，16.67，12.5，10，1μg/ml，每孔加入40头线虫，生测总体系为200μl，纯净水做对照，每组3次重复。置于16℃培养箱中培养，甲基丙二酸对南方根结线虫的lc50值见表1所示，为13.11μg/ml。表1甲基丙二酸对南方根结线虫的杀虫活性利用上述方法，申请人对甜菜碱的杀虫效果进行了测试，经测试甜菜碱对南方根结线虫的lc50为75.22μg/ml。实施例3：甲基丙二酸在制备秀丽隐杆线虫杀虫剂中的应用，应用过程如下：在96孔板中加入20μl1mg/ml的甲基丙二酸水溶液，同时加入纯净水，调整孔板中甲基丙二酸的终浓度依次为1000，100，25，16.67，12.5，10，1μg/ml，每孔加入40头线虫，生测总体系为200μl，纯净水做对照，每组3次重复。置于16℃培养箱中培养，甲基丙二酸对秀丽隐杆线虫的lc50值见表2所示，为1.20μg/ml。表2甲基丙二酸对秀丽隐杆线虫的杀虫活性利用上述方法，申请人对甜菜碱的杀虫效果进行了测试，经测试甜菜碱对秀丽隐杆线虫的lc50为14.75μg/ml。实施例4：甲基丙二酸对植物细菌病原菌的抑菌活性青枯假单胞菌、欧文氏菌、黄单胞菌划线活化得到单菌落，挑取单菌落接种到lb液体培养基中活化。采用琼脂平板扩散法，将1％病原细菌加入培养基中倒入培养皿，在培养皿中放置滤纸片(滤纸片的直径是6mm)，在滤纸片中加入5μl浓度0.1g/ml的甲基丙二酸，以水作为阴性对照，3个重复，置于30℃培养。抑菌实验结果显示，甲基丙二酸对青枯假单胞菌和欧文氏菌均具有抑菌活性，对青枯假单胞菌抑菌活性高于欧文氏菌(表3，图2)。表3甲基丙二酸对植物细菌病原菌的抑菌活性(-)：没有抑菌活性；(+)有抑菌活性，抑菌圈直径小于10mm；(++)有抑菌活性，抑菌圈直径大于10mm。实施例5：甲基丙二酸对植物真菌病原菌的抑菌活性挑取真菌病原菌菌丝接种到pda培养基上活化。采用菌丝生长速率法，使用无菌水配置成200μg/ml甲基丙二酸母液，0.5ml母液中加入4.5ml无菌水混匀，挑取菌块于pda培养基平板中心，以无菌水作为阴性对照，置于28℃培养，观察结果。待对照菌丝铺满平板，使用十字交叉法统计对照和处理菌落直径。抑菌实验结果显示，甲基丙二酸对植物真菌病原菌无抑菌活性(表4，图3)。表4甲基丙二酸对植物真菌病原菌的抑菌活性+：表示有效果，-：表示无效果。实施例6：甲基丙二酸复配甜菜碱在制备根结线虫杀虫剂中的应用，应用过程如下：从番茄根部挑取线虫感染根结，将卵块置于96孔板20℃孵育，观察根结线虫孵化情况。用无菌水冲洗线虫，在96孔板中加入20μl1mg/ml的甲基丙二酸和甜菜碱混合水溶液(质量比为1:1)，同时加入纯净水，调整孔板中复配液的终浓度依次为1000，100，25，16.67，12.5，10，1，0.5，0.25μg/ml，每孔加入40头线虫，生测总体系为200μl，纯净水做对照，每组3次重复。置于16℃培养箱中培养，甲基丙二酸和甜菜碱复配液对南方根结线虫的lc50值见表5所示，为2.85μg/ml。表5甲基丙二酸复配甜菜碱对南方根结线虫的杀虫活性实施例7：甲基丙二酸复配甜菜碱在制备秀丽隐杆线虫杀虫剂中的应用，应用过程如下：在96孔板中加入20μl1mg/ml的甲基丙二酸和甜菜碱混合水溶液(质量比为1:1)，同时加入纯净水，调整孔板中复配液的终浓度依次为1000，100，25，16.67，12.5，10，1，0.5，0.25μg/ml，每孔加入40头线虫，生测总体系为200μl，纯净水做对照，每组3次重复。置于16℃培养箱中培养，甲基丙二酸对秀丽隐杆线虫的lc50值见表6所示，为0.27μg/ml。表6甲基丙二酸复配甜菜碱对秀丽隐杆线虫的杀虫活性实施例8：甲基丙二酸复配甜菜碱对植物细菌病原菌的抑菌活性青枯假单胞菌、欧文氏菌、黄单胞菌划线活化得到单菌落，挑取单菌落接种到lb液体培养基中活化。采用琼脂平板扩散法，将1％病原细菌加入培养基中倒入培养皿，在培养皿中放置滤纸片(滤纸片的直径是6mm)，在滤纸片中加入5μl浓度0.1g/ml的甲基丙二酸和甜菜碱混合水溶液(质量比为1:1)，以水作为阴性对照，3个重复，置于30℃培养。抑菌实验结果显示，复配液对青枯假单胞菌和欧文氏菌均具有抑菌活性，对黄单胞菌无抑菌活性(表7)。表7甲基丙二酸复配甜菜碱对植物细菌病原菌的抑菌活性(-)：没有抑菌活性；(+)有抑菌活性，抑菌圈直径小于10mm。实施例9：甲基丙二酸复配甜菜碱对植物真菌病原菌的抑菌活性挑取真菌病原菌菌丝接种到pda培养基上活化。采用菌丝生长速率法，使用无菌水配置成200μg/ml甲基丙二酸和甜菜碱混合水溶液(质量比为1:1)，0.5ml混合液中加入4.5ml无菌水混匀，挑取菌块于pda培养基平板中心，以无菌水作为阴性对照，置于28℃培养，观察结果。待对照菌丝铺满平板，使用十字交叉法统计对照和处理菌落直径。抑菌实验结果显示，复配液对植物真菌病原菌无抑菌活性(表8)。表8甲基丙二酸对植物真菌病原菌的抑菌活性名称拉丁名引起病害抑菌效果辣椒疫霉菌phytophthoracapsici辣椒疫霉-灰葡萄孢菌botrytiscinerea黄瓜灰霉病-尖孢镰刀菌fusariumoxysporum番茄枯萎病-索兰尼链格孢alternariasolani马铃薯早疫病-多主棒孢霉corynesporacassiicola黄瓜棒孢叶斑病-茶拟盘多毛孢pestalotiopsistheae茶叶轮斑病-立枯丝核菌rhizoctoniasolani水稻纹枯病-核盘菌sclerotiniasclerotiorum油菜菌核病-+：表示有效果，-：表示无效果。当前第1页12