本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种无nh4no3植物组织培养用培养基。
背景技术
ms培养基由murashige和skoog于1962年发布，其普遍适用性及稳定性使其广泛用于多种植物的各类组织培养，香蕉、兰花及桉树等实现工业化组培育苗的品种，其培养基均由ms衍生改良而来。硝酸铵nh4no3为ms主要构成成分，占大量元素质量百分比36.4%，是ms铵态氮nh4+的来源，同时维持了nh4+与no3－摩尔浓度近似1:2的合适比例。nh4no3是《危险化学品安全管理条例》及《民用爆炸物品安全管理条例》管制药剂，禁止纯品nh4no3市场流通，nh4no3的禁用对组培产业可谓釜底抽薪，寻求nh4no3有效替代品维持正常生产成为产业生存与发展的重要课题。
王媛花将ms培养基nh4no3替换为3.4g/l(nh4)2so4，对苹果、草莓和葡萄组培苗进行试验，报道结论为继代的植物叶片平展，叶色嫩绿，植物幼嫩组织含水量高，植株生长旺盛。大量元素的简单替换导致离子浓度大幅波动，其nh4+及so42-水平远远超过ms、er、b5、wpm等常用培养基，nh4+与no3－比例亦是独树一帜达到2.74:1，而据普遍适用的规律，培养基内过高nh4+水平，持续培养会抑制培养物生长，诱发玻璃化等毒害反应，该配方应用效果和适应性有待验证。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是：在不使用nh4no3的前提下，提供一种具备普遍适用性的植物组织培养用培养基。
为了解决上述技术问题，本发明提供的一种无nh4no3植物组织培养用培养基,包括sk基本培养基,该sk基本培养基中大量元素的含量为：ca(no3)2494mg/l、mg(no3)2222mg/l、(nh4)2so4198mg/l、(nh4)3po4372mg/l、nh4cl321mg/l和kno32153mg/l。
上述中，该sk基本培养基中微量元素、铁盐和有机物的含量与ms培养基中的相同。
上述中，该sk基本培养基中微量元素的含量为mnso4·4h2o22.3mg/l、znso4·7h2o8.6mg/l、h3bo36.2mg/l、ki0.83mg/l、namoo4·2h2o0.25mg/l、cuso4·5h2o0.025mg/l和cocl2·6h2o0.025mg/l；铁盐含量为naedta·2h2o37.3mg/l和feso4·7h2o27.8mg/l；有机物的含量为肌醇100mg/l、烟酸0.5mg/l、盐酸吡哆醇0.5mg/l、盐酸硫胺素0.1mg/l和甘氨酸2mg/l。
本发明中的sk基本培养基可替换常用的ms培养基，且与ms培养基一样，在生产用培养基制作中，在sk基本培养基基础上，根据实际培养需要添加包含但不限于大量元素水溶性肥料、有机液肥、适量激素、蔗糖和卡拉胶等，而添加的量与ms培养基一样，且调节ph至5.8，即可搅拌分装。
另外，其sk基本培养基全部或部分大量元素组分可按相同比例调整。
本发明的有益效果在于：使用(nh4)2so4、(nh4)3po4和nh4cl提供nh4+，ca(no3)2、mg(no3)2和kno3提供no3－，部分替换nh4no3，重新设计培养基，使其大量元素离子浓度与ms、er等常用培养基接近，能维持组培苗正常生长，应对nh4no3短缺对组培产业带来的挑战，需求迫切，具备现实的生产意义。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式予以说明。
以下实施例中用于配制大量元素、铁盐、微量元素及有机物的药剂均为广州化学试剂厂生产的分析纯试剂，蔗糖为食用级白砂糖，卡拉胶为北京康倍斯科技有限公司生产。翠筠（18-18-18）水溶肥由佛山市顺德区翠筠园艺有限公司生产，其标识成分为：全氮18%（其中铵态氮3.6%、硝态氮5.3%）、水溶性磷18%、水溶性钾18%、水溶氧化镁2%。
该培养基包括sk基本培养基，该sk基本培养基中各组分的含量为：
大量元素ca(no3)2494mg/l、mg(no3)2222mg/l、(nh4)2so4198mg/l、(nh4)3po4372mg/l、nh4cl321mg/l和kno32153mg/l，微量元素mnso4·4h2o22.3mg/l、znso4·7h2o8.6mg/l、h3bo36.2mg/l、ki0.83mg/l、namoo4·2h2o0.25mg/l、cuso4·5h2o0.025mg/l及cocl2·6h2o0.025mg/l，铁盐含量为naedta·2h2o37.3mg/l和feso4·7h2o27.8mg/l，有机物的含量为肌醇100mg/l、烟酸0.5mg/l、盐酸吡哆醇0.5mg/l、盐酸硫胺素0.1mg/l和甘氨酸2mg/l。
下面各实施例分别采用上述的sk基本培养基，添加植物生长调节剂而得各种植物组织培养基。
实施例一：
广林9号巨尾桉，增殖sk+6-ba0.2mg/l+naa0.05mg/l，生根sk+naa1.0mg/l+iba0.5mg/l，所有培养基均加入卡拉胶6.5g/l、白砂糖30g/l，灭菌前ph调节为5.8。
实施例二：
黑金刚橡胶榕，增殖sk+6-ba1.5mg/l+naa0.1mg/l，生根sk+naa0.5mg/l+iba0.1mg/l，所有培养基均加入卡拉胶6.5g/l、白砂糖30g/l，灭菌前ph调节为5.8。
实施例三：
美酒白掌，增殖sk+翠筠（18-18-18）水溶肥0.5g+6-ba1.5mg/l，生根ms+naa0.5mg/l+iba0.1mg/l，所有培养基均加入卡拉胶6.5g/l、白砂糖30g/l，灭菌前ph调节为5.8。
应用比较例：
1.参试材料组培方法
原始培养基：（1）广林9号巨尾桉，增殖er+6-ba0.2mg/l+naa0.05mg/l，生根1/2er+naa1.0mg/l+iba0.5mg/l；（2）黑金刚橡胶榕，增殖ms+6-ba1.5mg/l+naa0.1mg/l，生根ms+naa0.5mg/l+iba0.1mg/l；（3）美酒白掌，增殖ms+6-ba1.5mg/l，生根ms+naa0.5mg/l+iba0.1mg/l。所有培养基均加入卡拉胶6.5g/l、白砂糖30g/l，灭菌前ph调节为5.8。
培养环境：培养室光照强度1600lx、培养温度26℃±2℃；炼苗间为单层遮阳网大棚，遮光率40%，配备风机水帘。
培养周期：广林9号巨尾桉继代增殖周期20d，生根培养时间为25d；黑金刚橡胶榕继代增殖周期30d，生根培养时间为25d；美酒白掌继代增殖周期30d，生根培养时间为35d。
生根苗接入标准：广林9号巨尾丛生芽内高度＞1.0㎝单芽可用于生根，且取长度0.5㎝顶芽接种至生根培养基；黑㎝金刚橡胶榕高度＞2.0㎝单芽可用于生根，且取长度1.2～1.5㎝顶芽接种至生根培养基；美酒白掌高度＞2.5㎝单芽可用于生根，将单芽完整的从丛生芽分离，接种至生根培养基。达不到高度要求但形态完整的单芽保留在接种团块上用于继代，本研究将可用于生根的单芽称为生根芽、形态完整的后备单芽称为后备芽。
2.sk培养基应用效果测试
广林9号巨尾桉增殖、黑金刚橡胶榕、美酒白掌组培苗增殖和生根培养均设置ms、er、sk、sk+翠筠（18-18-18）水溶肥0.5g基本培养基共4个处理，广林9号巨尾桉原基本培养基为1/2er，则基本培养基处理大量元素均减半。各物种原有培养基激素、培养环境和培养周期等保持不变。
2.1各培养基对参试材料增殖继代的影响
以生产用继代增殖材料，接入试验培养基，每个处理重复3次，每个重复接种30瓶，继代周期完成后，选择具备代表性的增殖材料重新转入相同试验培养基进行第2代培养，共培养3代。第3代继代培养周期完成后观察其增殖苗植株形态是否出现可见变化，玻璃化程度、小芽完整程度、叶片是否正常展开。统计单瓶增殖苗内生根芽及后备芽数量，测量生根芽基部茎粗及高度等指标。
2.2各培养基对参试材料生根培养的影响
广林9号巨尾桉使用2.3.1所得sk增殖试验苗、黑金刚橡胶榕及美酒白掌使用sk+翠筠（18-18-18）水溶肥0.5g增殖试验苗作为试材，接入不同生根培养基，使用生产配方接种生根苗作为对照。每个处理重复3次，每个重复接种30瓶，接种10d，剔除污染，带瓶转移至炼苗棚炼苗，各品种生根培养时间结束后，观测生根苗顶芽生长是否正常，根系完整情况及根系质地，测量生根苗高度、根系条数并分析。
3.sk培养基测试结果
3.1基本培养基处理对各参试物种增殖继代培养的影响
基本培养基处理对广林9号巨尾桉、黑金刚橡胶榕及美酒白掌组培苗增殖均存在影响。（1）广林9号巨尾桉，ms及sk+翠筠（18-18-18）水溶肥0.5g基本培养基处理，增殖苗生长旺盛，组织含水量高呈现轻微玻璃化，丛生芽多而叶片大，丛生芽内单芽茎干纤细。er和sk基本培养基处理，苗木形态正常，充实健壮，且丛生芽内单芽质地趋向木质化，利于生根培养。（2）黑金刚橡胶榕，ms及sk+翠筠（18-18-18）水溶肥0.5g基本培养基处理，丛生芽团块基部轻微愈伤化，增殖苗生长旺盛，丛生芽内单芽茎干粗壮整齐、未见玻璃化、顶芽色泽和形态均正常。er和sk基本培养基处理，丛生芽团块愈伤极少，苗木形态正常，丛生芽内单芽茎粗不均匀，部分单芽较纤细、顶芽叶片小，不能正常用于生根培养。（3）美酒白掌，ms及sk+翠筠（18-18-18）水溶肥0.5g基本培养基处理，丛生芽团块少量不定根发生，增殖苗生长旺盛，丛生芽内单芽叶柄粗壮，叶片正常展开、叶色浓绿未见玻璃化，可生根单芽矮缩茎膨大。er和sk基本培养基处理，丛生芽团块不定根发生较多，增殖苗长势稍差，部分单芽细弱、叶片窄而狭长、叶色淡绿，可生根单芽矮缩茎未见明显膨大。相关指标见表1。
表1.基本培养基处理对增殖苗生长的影响
由表1可知，（1）对广林9号巨尾桉，ms处理效果与sk+翠筠（18-18-18）水溶肥0.5g处理效果类似，呈现后备芽多而生根芽少、生根芽纤细而高生长明显的趋势。er和sk培养基效果类似，有效生根芽数量多，而后备芽也能正常发育为有效生根芽，生根芽粗壮敦实。（2）对黑金刚橡胶榕增殖苗的影响，各处理后备芽数量、生根芽高度不存在统计学差异。效果类似，有效生根芽数量多，单芽茎基直径大，与er和sk处理差异显著，ms处理与sk+翠筠（18-18-18）水溶肥0.5g处理之间在有效生根芽数量和单芽茎基直径上不存在统计学差异，er和sk处理之间亦不存在统计学差异。（3）对美酒白掌的影响，各基本培养基处理后备芽数量不存在统计学差异，er和sk处理继代过程中后备芽不能正常发育达到生根标准，其生根芽数量和生根芽茎基直径均显著小于ms与sk+翠筠（18-18-18）水溶肥0.5g处理。
3.2基本培养基处理对各参试物种生根培养的影响
各基本培养基处理均能使各参试组培苗100%生根，且苗木生长健壮，顶芽色泽及形态均正常，根系完整，主根生长均匀且木质化程度良好、侧根发达，根冠比例正常。各处理相关指标见表2。
表2.基本培养基处理对生根苗生长的影响
由表2可知，各基本培养基处理对广林9号巨尾桉、黑金刚橡胶榕和美酒白掌生根苗高度、生根苗茎基直径的影响均不构成统计学差异。低盐培养基er和sk，生根条数优于ms与sk+翠筠（18-18-18）水溶肥0.5g处理。
4.对测试结果的评价
sk大量元素离子浓度设计合理，no3-/nh4+比例接近2:1，符合一般富盐培养基的设计规律。在培养基适应性研究过程中发现，sk或翠筠（18-18-18）水溶肥0.5g培养基，可使参试物种正常增殖继代和生根培养，sk应用效果和er接近，sk+翠筠（18-18-18）水溶肥0.5g应用效果同ms接近。ms为组培常用培养基，er亦为经典培养基，但二者均需用到nh4no3，sk用其它药品完全取代了nh4no3，为应对nh4no3禁用对组培产业的影响提供了简单可行的解决方案。